肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。
背景技术：
：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第五位，发病率仍持续升高，成为我国第二位癌症死亡原因。肿瘤切除或肝移植是目前最有效的治疗手段，但术后复发率极高，5年生存率仅为5％左右。多数患者只有在转移病灶引起异常症状或者影像学检查发现转移病灶时才确诊转移发生，错失了治疗的最佳时机，因此，术后复发转移已成为阻碍HCC病人长期生存的关键。肝癌细胞具有容易侵犯血管的特性，极易造成癌细胞的血行播散。部分肝癌病人在肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血循环系统中，入血的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)是导致肝癌术后复发和转移的首要条件。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymalTransition)，EMT过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强。根据CTCs抗原标志物的差异，目前CTCs主要可分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)和上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)等。不同类型CTCs具有不同的迁移和侵袭能力。因此，对肝癌患者循环肿瘤细胞进行鉴定和分型对肝癌的转移复发监测以及预后等具有重要意义。虽然CTCs检测在其他癌症，包括乳腺癌、结肠癌和前列腺癌等中得到较广泛的应用，但在肝癌中的研究较少，国内外均没有稳定的用于肝癌患者CTCs鉴定和分型的产品。与其他癌症类型一样，目前肝癌患者CTCs的鉴定和分型主要依赖于通用CTCs上皮和间质型标志物分子的检测，由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，且采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些上皮和间质型标志物在不同癌症类型中表达存在差异，从而会导致一些假阳性和假阴性的检测结果。因此，急需一种能提高现有CTCs检测和分型准确度的检测方法，实现肝癌患者CTCs的精确鉴定与分型。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、准确度高的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有三类：选自AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的至少两种的肝癌细胞标志基因mRNA，选自KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的至少一种的间质细胞标志基因mRNA；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。在其中一个实施例中，所述标志基因mRNA还包括有针对白细胞标志基因的mRNA的一类，所述白细胞标志基因为CD45，使用白细胞标志基因，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰。在其中一个实施例中，所述肝癌细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对AFP基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2条或2条以上，针对AST基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2条或2条以上，针对ALT基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2条或2条以上，针对DCP基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2条或2条以上，针对GGT基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2条或2条以上，针对GPC3基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2条或2条以上，针对GP73基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2条或2条以上，针对OPN基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2条或2条以上；针对肝癌细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.181；所述肝癌细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.185，P4序列为SEQIDNO.189。在其中一个实施例中，所述上皮细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对KRT7基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2条或2条以上，针对KRT8基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2条或2条以上，针对KRT17基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.182；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.186，P4序列为SEQIDNO.190。在其中一个实施例中，所述间质细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.131～SEQIDNO.140中的2条或2条以上，针对HIF-1A基因特异性序列P1选自SEQIDNO.141～SEQIDNO.150中的2条或2条以上，针对SNAI1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.151～SEQIDNO.160中的2条或2条以上，针对ZEB2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.161～SEQIDNO.170中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.183；所述间质细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.187，P4序列为SEQIDNO.191。在其中一个实施例中，所述白细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对CD45基因特异性序列P1的选自SEQIDNO.171～SEQIDNO.180中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.184；所述白细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.188，P4序列为SEQIDNO.192。在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个T。在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。本发明的主要优点在于：(1)本发明在各种类型癌症通用CTCs上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因的基础上增加了肝癌细胞标志基因的检测，避免了血液中非肿瘤上皮细胞及采样过程引入正常上皮细胞等因素造成的假阳性结果，确保检测到上皮细胞标志基因和/或间质细胞标志基因的细胞为肝癌循环肿瘤细胞，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。(2)本发明所选择的肝癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析筛选得出的在肝癌循环肿瘤细胞上特异表达 的基因。本发明标志基因的选取，除了能实现单个标志基因的检测外，更与其它标志基因一起使用，从而能够最全面地检测出肝癌循环肿瘤细胞，并区分其细胞类型，解决了CTCs在不同癌症类型之间由于某些标志基因表达水平的差异以及EMT过程中丢失某些标志抗原而造成假阴性结果，进一步提高检测的准确性。(3)本发明所述鉴定方法采用多重RNA探针，能够同时标记多种肝癌细胞标志基因及CTCs特异性基因，并将CTCs分型为I型(上皮型)、II型(上皮-间质混合型)及III型(间质型)，进一步提高了检测结果的准确性，特别的，本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。(4)RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。附图说明图1是本发明阳性肝癌CTC鉴定结果示意图；图2是本发明阳性肝癌CTC分型结果示意图。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任 意的和所有的组合。本发明涉及了肝癌循环肿瘤细胞鉴定方法，主要包括以下步骤：(1)得到去除红细胞后的生物体液样本；(2)过滤，在滤膜上富集肝癌循环肿瘤细胞，通过透化处理，消化细胞，使mRNA暴露；(3)检测肝癌细胞标志基因mRNA、上皮细胞标志基因mRNA、间质细胞标志基因mRNA是否存在，所述肝癌细胞标志基因选自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的两个或两个以上，所述上皮细胞标志基因选自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的一个或一个以上。所述检测肝癌标志基因mRNA、和上皮细胞标志基因mRNA、和间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤：(3.1)每种标志基因的捕获探针特异性序列P1与对应的目标mRNA序列结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；(3.2)捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4分别为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；(3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；(3.4)通过荧光检测仪检测。所述检测肝癌标志物基因mRNA、上皮细胞标志基因mRNA、间质细胞标志基因mRNA是否存在，还可以包括以下步骤：(3.1)每种标志基因的捕获探针的特异性序列P1与对应的目标mRNA序列特异性结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；(3.2)捕获探针的P2序列与带有荧光基团标记的扩增探针的P3序列结合，从而实现目标mRNA信号的放大；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；(3.3)通过荧光检测仪检测。实施例1本实施例所述的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，有两种类型，具有标记探针的与不具有标记探针。其中，具有标记探针的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒A，主要包括有：一、捕获探针捕获探针由三部分组成，5’端至3’端依次是与对应的标志基因的mRNA互补配对的序列P1，间隔臂序列，与对应的扩增探针P3序列互补配对的P2序列，同一类别的标志基因其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。每个标志基因分别设计10条捕获探针，以提高检测的特异性。(具体使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例8)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的标志基因的捕获探针见表1、不同类型的标志基因的捕获探针的P2序列见表2。表1目标基因捕获探针的P1序列表2标志基因捕获探针的P2序列二、扩增探针扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列，3’端是能与标记探针互补配对的P4序列(如不运用标记探针检测时，则P4序列的3’端修饰有荧光基团，如试剂盒B)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T)。标志基因的扩增探针的P3序列见表3。所述P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列，本实施例P4序列优选的碱基组成见表4。表3目标基因的扩增探针的P3序列表4目标基因的扩增探针的P4序列三、标记探针标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针P4序列互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。(当检测体系中使用标记探针时，扩增探针的P4序列3’端不带有荧光基团标记，而由标记探针的3’端带有荧光基团标记，如试剂盒A)标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，标记探针的FL1、FL2、FL3和FL4选择的荧光基团互不相同，且 所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。本实施例标记探针的荧光基团标记优选如表5所示。表5标记探针本实施例所述不具有标记探针的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒B，主要包括有：一、捕获探针：与上述具有标记探针的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒中的捕获探针相同。二、扩增探针：与上述具有标记探针的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒中的捕获探针的序列相同，但P4序列的3’端修饰有荧光基团。所述P4序列的3’端修饰有荧光基团，具体为：针对肝癌细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL1，上皮细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL2，间质细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL3，白细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL4，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，其中FL1、FL2、FL3和FL4对应的荧光基团互不相同，即所对应的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。本实施例标志基因扩增探针的P4序列的3’端的荧光基团标记优选如表6所示。表6标志基因的染料标记实施例2运用实施例1中的试剂盒A对肝癌患者外周血循环肿瘤细胞进行检测所述各种溶液的配方如下：本实施例中的探针混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1具有标记探针的肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒A相应基因列表中的全部探针。一、样本预处理，将肝癌CTCs过滤至滤膜上1.在样本保存管中使用保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清，去除红细胞。2.加入4mLPBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在样本保存管中加入4mLPBS，洗涤管壁后抽滤液体。4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μl4％甲醛溶液，室温固定1h。5.去除液体，每孔加入1mLPBS洗涤三次，每次浸泡2min。二、透化处理1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。2.去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交1.配制相应浓度的消化酶工作液：试剂组分每个样本用量消化酶1.25μlPBS48.75μl总体积50μl2.消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。4.去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。四、探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合1.探针缓冲液、扩增缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。2.配制探针工作液：试剂组分每个样本用量探针混合液8μl探针缓冲液(40℃预热)42μl总体积50.0μl涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。五、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大1.配制扩增工作液：试剂组分每个样本用量扩增混合液2μl扩增缓冲液(40℃预热)48μl总体积50.0μl涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。六、显色，荧光标记目标信号1.配制显色工作液避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。七、荧光显微镜观察肝癌CTCs本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。2.通过20倍物镜计数CTC异性核数量。3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。显微镜使用通道如下：表7荧光基团的激发波长和发射波长八、检测结果判断及分析1.阳性肝癌CTCs鉴定标准在滤膜上，富集有少量的肝癌循环肿瘤细胞以及残留的白细胞，肝癌循环肿瘤细胞阳性的判定标准为(参见图1)：1)具有肝癌细胞标识物和循环肿瘤细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy5通道和/或Cy3通道和/或AlexaFluor488通道下能够显示紫色荧光信号点和/或红色荧光信号点和/或绿色荧光信号点。2)不具有白细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在AlexaFluor750通道下不显示荧光信号点。3)细胞核DAPI染色阳性。4)肝癌循环肿瘤细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。2.阳性肝癌CTCs分型标准：本试剂盒采用多重RNA探针，分别针对多种肝癌CTCs特异性基因，通过不同颜色荧光信号，可进一步将肝癌CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)CTCs携带Cy5荧光基团(显示为紫色荧光信号点)和Cy3荧光基团(显示为红色荧光信号点)，Ⅲ型(间质型)CTCs携带Cy5荧光基团(显示为紫色荧光信号点)和AlexaFluor488荧光基团(显示为绿色荧光信号点)，同时表达Ⅰ型和Ⅲ型特异性基因的CTCs为Ⅱ型(上皮-间质混合型，同时显示紫色荧光信号点、红色荧光及绿色荧光信号点)。参见图2。肝癌CTCs分型标准如下。表8阳性肝癌CTCs分型标准3.使用上述检测方法，对20例肝癌患者外周血样本进行检测和观察，具体结果为(表中数据为CTC数目)。表9样本检测结果实施例3运用实施例1中的试剂盒A对肝癌细胞株进行检测一、细胞株的选择本发明试剂盒肝癌细胞标志基因选自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的两个或两个以上；上皮细胞标志基因选自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；间质细胞标志基因选自：AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的一个或一个以上；白细胞标志基因为CD45。本发明选用的肝癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因中的各种标志基因，是发明人经过大量实验和统计分析筛选得出的在肝癌CTCs上特异表达的基因，对肝癌CTCs的检测具有很好的特异性和准确性。本实施例选用上皮-间质混合型肝癌细胞株HepG2和HuH-7进行实验，阴性对照细胞株选用CCRF-HSB-2淋巴母细胞，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个HepG2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号21-25；取约1000个HuH-7细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号26-30；取约1000个CCRF-HSB-2淋巴母细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号31-35。二、样本检测运用实施例1中的试剂盒A的全部探针(包括所有的标志基因，肝癌细胞标志基因AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN；上皮细胞标志基因KRT7、KRT8、KRT17、 KRT18、KRT19；间质细胞标志基因AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2)，白细胞标志基因CD45，按实施例2所述检测过程和方法对样本21-35进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下：表10样本检测结果通过比较样本中三种细胞株的检测结果可知，本发明试剂盒能实现肝癌细胞相关标志基因的检测，对样本中肝癌细胞株HepG2和HuH-7、淋巴母细胞CCRF-HSB-2的检出率均为100％，其中，肝癌标志基因仅在肝癌细胞株中检测到mRNA表达，而在淋巴母细胞中没有表达，由此可见，本发明试剂盒能够检出肝癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因mRNA表达情况，同时，肝癌细胞标志基因的检出具有癌种特异性，也就是说，肝癌细胞标志基因的检出，能有效区分样本中的肝癌细胞和白细胞，确保检测到上皮细胞标志基因和/或间质细胞标志基因的细胞为肝癌循环肿瘤细胞，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。实施例4不同细胞种类标志基因的选择一、试剂盒制备的设计(目标检测标志基因数量和种类的选择)本发明试剂盒肝癌细胞标志基因选自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN，根据实验组做相应的选择，上皮细胞标志基因为：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18和KRT19；间质细胞标志基因为：AKT2、HIF-1A、SNAI1和ZEB2。肝癌细胞标志基因的选择参见实施组1-4，分别选取一种、两种、四种及八种的标志基因，对比其检测效果，而上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因使用全部的目标基因以及白细胞标志基因的全部目标基因，具体设计如表11所示。本实施例每组相应标志基因的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。表11肝癌细胞标志基因基因的选择二、样本检测本实施例选用上皮-间质混合型肝癌细胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个HepG2细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号36-40；取约1000个HuH-7细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号41-45；取约1000个QGY-7701细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号46-50。采用表11标志基因制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本36-50进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肝癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表12中数据为细胞数目，表13中数据为平均荧光点数)：表12使用不同数量肝癌细胞标志基因检测效果的比较表13使用不同数量肝癌细胞标志基因平均荧光信号点数检测效果的比较对比实验组1-4的实验结果可知，当肝癌细胞标志基因分别选取一种、两种、四种及八种，上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因使用全部基因时，上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因检测结果稳定，而肝癌细胞标志基因检测结果有差异：由于不同肝癌细胞标志基因表达的差异，只选用一种标志基因进行检测时，会造成一定程度的漏检，使用2种或2种以上时，检测效果达到稳定，且紫色荧光信号点从实验组1到实验组4随着肝癌细胞标志基因数量的增加而逐渐增加，检测效果更优，其中，选用全部的肝癌细胞标记基因时，检测信号最强最稳定，效果最优，同时，肝癌细胞标志基因的增加并不影响上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因的检测结果，由此可知，本发明试剂盒所设计的各种类型探针之间基本不存在非特异性结合，特异性好。上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因基因数量的选择实验结果与肝癌细胞标志基因一致。其它针对使用不同数量和种类的肝癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。实施例5试剂盒目标检测标志基因的选择一、试剂盒制备的设计(目标检测标志基因数量和种类的选择)本发明试剂盒肝癌细胞标志基因选自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN，上皮细胞标志基因选自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19；间质细胞标志基因选自：AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2。设计实验组5--8，分别选取三种、六种、十二种及十七种的标志基因，对比其检测效果，白细胞使用标志基因CD45，具体设计如表14所示。本实施例每组相应标志基因的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。表14试剂盒标志基因基因的选择二、样本检测本实施例选用上皮-间质混合型肝癌细胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个HepG2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号51-55；取约1000个HuH-7细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号56-60；取约1000个QGY-7701细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号61-65。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本51-65进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肝癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表15中数据为细胞数目，表16中数据为平均荧光点数)：表15试剂盒使用不同数量标志基因检测效果的比较表16试剂盒使用不同数量标志基因平均荧光信号点数检测效果的比较对比实验组5-8的检测结果可知，使用3种标志基因时(实验组5)会由于不同肝癌细胞上基因的差异表达而照成假阴性的结果，使用6种及6种以上标志基因进行检测时效果达到稳定，且细胞上3种细胞种类标志基因对应的荧光信号点从实验组5到实验组8随着标志基因数量的增加而逐渐增加，检测效果更优，其中，选用全部的标记基因时，检测信号最强最稳定，效果最优。其它针对使用不同数量和种类的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。实施例6不同间隔臂的试剂盒对肝癌循环肿瘤细胞mRNA原位杂交的检测一、试剂盒制备的设计(间隔臂的选择)以肝癌细胞标志基因(共8个基因)为例，分别选用不同的间隔臂，具体设计如表17所示。其余捕获探针、扩增探针与标记探针的碱基组成以及所用数量全部与实施例1试剂盒A相同、不同之处仅在于间隔臂不同，检测方法如实施例2所述。对应的捕获探针、扩增探针的间隔臂相同。表17间隔臂及其长度间隔臂种类长度实验组poly(dT)59poly(dA)810(CH2)n1511poly(TTG)312二、样本检测本实施例选用上皮-间质混合型肝癌细胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个HepG2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号66-70；取约1000个HuH-7细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号71-75；取约1000个QGY-7701细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号75-80。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本66-80进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，具体检测结果如下(表中数据为细胞数目)。表18肝癌细胞标志基因检测探针使用不同间隔臂的实验结果比较经过对比4个实验的检测结果可知，4组实验设计的检测效果没有差异，因此，这4种间隔臂的设计是等效的。上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因以及白细胞标志基因检测探针使用不同的间隔壁检测结果与肝癌细胞标志基因一致，具体数据省略。其它针对捕获探针、扩增探针和标记探针内部不同的间隔序列的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。实施例7：标记探针的运用一、试剂盒制备的设计(信号检测组分)本发明试剂盒信号检测组分有两种选择，1)扩增探针P4序列的3’端修饰有荧光基团；2)扩增探针3’端P4序列与标记探针的P5序列通过碱基互补配对结合，同时标记探针的3’端带有荧光基团。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用荧光基团修饰的标记探针，检测信号更加稳定，效果较优。以所述试剂盒的检测上皮细胞标志基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表19所示。即所述试剂盒的组成为：实验组13：相应捕获探针和扩增探针组成和数量同实施例1试剂盒A，但扩增探针3’端修饰有荧光基团Cy3；没有标记探针；实验组14：相应捕获探针、扩增探针和标记探针组成和数量同实施例1试剂盒A，扩增探针不具有荧光基团，但配置有标记探针，标记探针的P5序列3’端修饰有荧光基团Cy3。表19信号检测组分二、样本检测本实施例选用上皮-间质混合型肝癌细胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个HepG2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号81-85；取约1000个HuH-7细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号86-90；取约1000个QGY-7701细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号91-95。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本81-95进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肝癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表20中数据为细胞数目，表21中数据为平均荧光点数)。表20上皮细胞标志基因使用不同信号检测探针的检测结果比较表21上皮细胞标志基因使用不同信号检测探针平均荧光点数检测结果比较将两组设计的检测结果进行统计学分析，证明两组设计对样本中细胞数目的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中，使用荧光基团修饰的标 记探针(即实验组14)，其检测到上皮细胞标志基因荧光点数更多，信号更加稳定，效果较优。其他针对肝癌细胞标志基因和间质细胞标志基因标记探针的运用检测结果与上皮细胞标志基因检测结果一致，具体数据省略。实施例8标志基因的捕获探针的数量选择一、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)本发明肝癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，针对不同细胞种类的每个标志基因分别设计了10条捕获探针，且同一细胞种类的标志基因的捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种标志基因，选择对应的至少2条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以上皮细胞标志基因KRT7的捕获探针数量选择为例，参见实验组15-17，分别选取1条、2条及10条的捕获探针，对比其检测效果。在该对比实验中，上皮细胞标志基因仅使用KRT7(参见表22)，而肝癌细胞标志基因和间质细胞标志基因使用如实施例1试剂盒A所列出的全部的基因和探针以及白细胞标志基因CD45及其对应的检测探针。表22上皮细胞标志基因KRT7的捕获探针的选择二、样本检测本实施例选用上皮-间质混合型肝癌细胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个HepG2细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号96-100；取约1000个HuH-7细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号101-105；取约1000个QGY-7701细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号105-110。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本96-110进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肝癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表23中数据为细胞数目，表24中数据为平均荧光点数)。表23上皮细胞标志基因KRT7使用不同数量捕获探针的检测结果比较表24上皮细胞标志基因KRT7使用不同数量捕获探针平均荧光点数检测结果比较通过三组实验对比可知，当仅选用上皮细胞标志基因KRT7，使用1条、2条和10条的捕获探针均可完成检测，当捕获探针使用2条或以上时，其特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，上皮基因检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。其它针对肝癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3