与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物及其应用。

背景技术：

烟草赤星病(Tobacco Brown Spot)是一种叶部病害，直接危害成熟期叶片，造成烟叶产量和质量的下降，若遇上适宜发病气候极易造成大面积流行，使烟草生产遭受重大的经济损失。研究烟草赤星病抗性遗传规律，选育抗病品种，是防治此病害最经济有效的手段之一。净叶黄是我国最早育成的抗赤星病烟草品种，也是我国抗赤星病育种利用的主要抗源。利用净叶黄的赤星病抗性，先后育成多个抗耐赤星病品种，包括许金4号、单育2号、中烟15、辽烟14、中烟86、中烟90等，对我国的烟草生产起到了很大的促进作用。赤星病接种鉴定工作，要在烟叶成熟期进行，而且需要保持较高的温度和湿度，接种鉴定难度大，耗时耗力。因此，如果运用分子标记辅助选择来进行抗赤星病育种，既可以免除接种鉴定等繁重工作，又能够加快抗源筛选和抗性基因鉴定，促进抗性基因合理利用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物，旨在免除接种鉴定等繁重工作，加快抗源筛选和抗性基因鉴定，促进抗性基因合理利用。

本发明是这样实现的，一种与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物，所述与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物J9扩增出的特异片段为230bp；

J9前引物 TTCAGAACATAATTACCTTTAATTGG；

J9后引物 CGTGCTAAGGTCTTTGCTGTT。

本发明的主要目的在于提供一种与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物用于以净叶黄为抗源的组合进行后代分子标记辅助选择。

本发明的另一目的在于提供一种与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记的获取方法，所述获取方法包括：

提取抗赤星病材料净叶黄和感赤星病材料NC82的DNA，以其为模板对2300对SSR引物进行多态性筛选，获得多态性引物326对；

用净叶黄和NC82作为亲本构建F₂群体，将供试材料种植在温室中。待其至成熟期时，利用划伤悬滴法接种，每株接种两片底部叶片，在用于接种叶片的主脉两侧用接种针做6个十字划伤，在伤口处悬滴一滴接种菌液，保持高温28℃、高湿相对湿度80％以上培养3周；

按以下标准调查发病情况，0级：无症状；1级：有25％的划伤略有浸染，但不扩展；2级：有50％的划伤有浸染，且稍有扩展；3级：80％的划伤有浸染，且形成病斑；4级：100％的划伤有浸染，且形成很大病斑，被浸染处坏死。免疫：病级为0级；高抗：病级为1级；中抗：病级为2级；中感：病级为3级；高感：病级为4级。即0级、1级、2级划为抗病群体，3级和4级划为感病群体；

在抗性鉴定的基础上，将F₂群体的110个单株分别提取DNA，随机选10个抗病株的DNA等量混合建立抗病基因池；随机选10个感病株的DNA等量混合建立感病基因池，以其为模板对筛选到的326对引物进行扩增检测。筛选到在抗感池间有多态的引物76对，以F₂群体的110个单株DNA为模板，对这76对引物进行扩增检测，带型统计方法如下：与净叶黄带型一致的记做0，与NC82带型一致的记做1，与F₁带型一致的记做2，建立数据库，用Windows QTL Cartographer软件的CIM模块进行数据整理分析，得到标记J9与来源于净叶黄的赤星病抗性基因间的遗传距离最近，为4cM。

播种(净叶黄×NC82)F₂群体，随机假植出400株，当烟苗生长到5叶期时，每株编号并取一片叶子提取DNA。以这些DNA为模板分别用J9进行扩增，其中得到有230bp特异片段的烟苗226株。将这226株烟苗移栽到赤星病鉴定棚中，按常规方式管理。

当这些烟株长至成熟期时，利用划伤悬滴法接种。每株接种两片底部叶片，在用于接种叶片的主脉两侧用接种针做6个十字划伤，保持高温高湿培养3周后调查发病情况。其中抗病株数为205株，感病株数为11株，抗病株数占移栽总数的90.1％。这说明用J9对以净叶黄为抗源的组合进行后代分子标记辅助选择是有效可靠的。此外，本发明可以方便快捷的对其杂交后代进行分子标记辅助选择，加强对目标性状的选择和鉴定，提高育种效率，缩短育种年限，节省人力物力。

附图说明

图1是本发明实施例提供的与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物获取流程图。

图2是本发明实施例提供的引物J9对部分F₂单株的扩增结果示意图；

图中：M：DNAMarker；1：净叶黄；2：NC82；3：F₁代；4：F₂代部分单株。

图3是本发明实例提供的部分F₂单株的扩增检测结果示意图；

图中：1-19：F₂代单株；M：DNA Marker。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实例的与抗烟草赤星病基因紧密连锁的分子标记引物获取方法包括：

S101：提取抗赤星病材料净叶黄和感赤星病材料NC82的DNA，以其为模板对2300对SSR引物进行多态性筛选，获得多态性引物326对；

S102：用净叶黄和NC82作为亲本构建(净叶黄×NC82)F₂群体。将供试材料种植在温室中。待其至成熟期时，利用划伤悬滴法接种。每株接种两片底部叶片，在用于接种叶片的主脉两侧用接种针做6个十字划伤，在伤口处悬滴一滴接种菌液，保持高温(28℃)、高湿(相对湿度80％以上)培养3周；

S103：按以下标准调查发病情况。0级：无症状；1级：有25％的划伤略有浸染，但不扩展；2级：有50％的划伤有浸染，且稍有扩展；3级：80％的划伤有浸染，且形成病斑；4级：100％的划伤有浸染，且形成很大病斑，被浸染处坏死。免疫：病级为0级；高抗：病级为1级；中抗：病级为2级；中感：病级为3级；高感：病级为4级。即0级、1级、2级划为抗病群体，3级和4级划为感病群体；

S104：在抗性鉴定的基础上，将F₂群体的110个单株分别提取DNA。随机选10个抗病株的DNA等量混合建立抗病基因池；随机选10个感病株的DNA等量混合建立感病基因池。以其为模板对筛选到的326对引物进行扩增检测。筛选到在抗感池间有多态的引物76对。以F₂群体的110个单株DNA为模板，对这76对引物进行扩增检测，带型统计方法如下：与净叶黄带型一致的记做0，与NC82带型一致的记做1，与F₁带型一致的记做2，建立数据库。用Windows QTL Cartographer软件的CIM模块进行数据整理分析，得到标记J9与来源于净叶黄的赤星病抗性基因间的遗传距离最近，为4cM；

S105：J9扩增出的特异片段为230bp。J9的前引物序列如SEQ ID NO：1和J9的后引物序列SEQ ID NO：2和扩增图片如下，引物J9对部分F₂单株的扩增结果如图2所示。

J9的引物序列

S106：分子标记与目标基因之间的遗传距离决定了分子标记辅助选择的准确率，遗传距离越小准确率越高。本发明公开一个标记J9，它与抗性基因的遗传距离仅为4cM，利用它进行辅助选择，准确率会提高很多。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的说明。

播种(净叶黄×NC82)F₂群体，随机假植出400株，当烟苗生长到5叶期时，每株编号并取一片叶子提取DNA。以这些DNA为模板分别用J9进行扩增，其中得到有230bp特异片段的烟苗226株。将这226株烟苗移栽到赤星病鉴定棚中，按常规方式管理，部分F₂单株的扩增检测结果，如图3所示。

当这些烟株长至成熟期时，利用划伤悬滴法接种。每株接种两片底部叶片，在用于接种叶片的主脉两侧用接种针做6个十字划伤，保持高温高湿培养3周后调查发病情况。其中抗病株数为205株，感病株数为11株，抗病株数占移栽总数的90.1％。这说明用J9对以净叶黄为抗源的组合进行后代分子标记辅助选择是有效可靠的。

以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。