一种检测革兰氏阳性细菌耐药基因的基因芯片试剂盒的制作方法

本发明属于核酸扩增
技术领域：
，涉及一种检测革兰氏阳性细菌耐药基因的基因芯片试剂盒。
背景技术：
：细菌耐药基因检测具有重要临床意义。临床诊断中存在抗生素的用量大、起点高、种类较为随意的缺陷，从而导致耐药菌种的产生和流行。目前用于耐药基因检测仍较为传统，大致有生理生化试验、血清学试验、药敏试验等后加以聚合酶链式反应(PCR)扩增相应基因的方法，而上述检测方法需要时间长，方法操作烦琐、报告结果慢、通量低，且往往先鉴定出菌种，才能相应的进行药敏等后续试验，因而难以适应临床治疗的需要。因此开发快速高通量的分子诊断技术检测，可以协助快速诊断，指导及时准确用药。生物芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展并成熟的一项高新技术，主要是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面构建的微型生物化学分析系统，可实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他多种生物成份的准确、快速、大量信息的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组。本发明所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组，由如下3个引物对组成：1)如下(a1)或(a2)所示的引物对，记为引物对1：(a1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(a2)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；2)如下(b1)或(b2)所示的引物对，记为引物对2：(b1)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b2)由将序列表中序列3和序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；3)如下(c1)或(c2)所示的引物对，记为引物对3：(c1)由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(c2)由将序列表中序列5和序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(c1)中所述引物对功能相同的引物对。其中，所述引物对1用于扩增mecA基因；所述引物对2用于扩增vanA基因；所述引物对3用于扩增vanB基因。本发明的第二个目的是提供一种用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的成套单链DNA。本发明所提供的用于检测细菌耐药基因的成套单链DNA，具体由探针组和所述引物对组组成；所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探针3。其中，所述单链DNA探针1用于检测所述引物对1的扩增结果；所述单链DNA探针2用于检测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA探针3用于检测所述引物对3的扩增结果。本发明的第三个目的是提供一种用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒。本发明所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒，含有所述引物对组，以及杂交芯片；所述杂交芯片是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将通式为“NH2-(T)n-杂交探针序列”的3种单链检测探针分别通过氨基与醛基的反应固定到醛基修饰化的固相载体(如玻片)上，获得所述杂交芯片；所述通式中的(T)n表示n个连续的T，n为大于等于5，且小于等于30的整数；所述通式中对应于所述3种单链检测探针的3种杂交探针序列分别如序列表中序列7-9所示。根据需要，所述试剂盒中还可含有经荧光标记的随机引物；所述随机引物的序列为5’-NX-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，6≤X≤15，且X为整数(如X＝9)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。以上所述经荧光标记的随机引物是用于对所述引物对组中的引物对的扩增产物进行荧光标记的。根据需要，也可以不采用所述经荧光标记的随机引物对扩增产物进行荧光标记，而是采用其他方法。如将所述引物对组中每个引物对的一条引物的5’末端进行荧光标记(如TAMRA)，被荧光标记的引物是存在于扩增产物中可被相应探针杂交的单链DNA上的引物。所述试剂盒中还可含有杂交液；所述杂交液中含有经荧光标记的无关单链DNA分子；所述无关单链DNA分子为非源自于所述细菌耐药基因的单链DNA分子。所述杂交芯片的制备方法还包括将表面化学质控探针QC、和/或杂交质控探针PC、和/或阴性对照探针BC通过氨基与醛基的反应固定到所述醛基修饰化的固相载体 (如玻片)上的步骤；所述表面化学质控探针QC、所述杂交质控探针PC和所述阴性对照探针均为单链探针；所述表面化学质控探针QC的一端经氨基修饰，另一端具有荧光标记(如Hex)；所述杂交质控探针PC的一端经氨基修饰，且能与所述杂交液中的所述无关单链DNA分子杂交；所述阴性对照探针BC的一端经氨基修饰，且与源自于所述革兰氏阳性细菌耐药基因的任何单链DNA分子均不能杂交。进一步，在本发明中，所述表面化学质控探针QC自5’端到3’端的结构组成为“NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex”；所述杂交质控探针PC自5’端到3’端的结构组成为“NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT”；所述阴性对照探针BC自5’端到3’端的结构组成为“NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT”。所述引物对组或所述成套单链DNA或所述试剂盒在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：(a)检测或辅助检测革兰氏阳性细菌耐药基因(非诊断目的)，或制备用于检测或辅助检测革兰氏阳性细菌耐药基因的产品；(b)检测或辅助检测含有革兰氏阳性细菌耐药基因的细菌(非诊断目的)，或制备用于检测或辅助检测含有革兰氏阳性细菌耐药基因的细菌的产品。在本发明中，所述革兰氏阳性细菌耐药基因具体可为如下中的至少一种：mecA基因、vanA基因、vanB基因。所述mecA基因的GenBank登录号为AB221119.1(update：2006-5-19)；所述vanA基因的GenBank登录号为M97297.1(update：2002-6-20)；所述vanB基因的GenBank登录号为AY655711.1(update：2005-11-7)。相应的，含有所述mecA基因的细菌具体可为金黄色葡萄球菌；含有所述vanA基因的细菌具体可为粪肠球菌或屎肠球菌；含有所述vanB基因的细菌具体可为粪肠球菌或屎肠球菌。所述引物对组或所述成套单链DNA在制备所述试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。本发明对极大样本量的革兰氏阳性细菌耐药基因进行研究。本发明提供的试剂盒支持高通量，快速、准确地检测多个革兰氏阳性细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而抗生素使用量，减少耐药产生。附图说明图1为杂交芯片的点阵排布示意图(即芯片探针布局示意图)。-表示没有固定任 何探针。图2为用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的特异性分析结果。该图对应的芯片探针布局示意图如图1所示。其中，A所示芯片检测结果对应的参考品DNA质粒为ZL-vanA(对应vanA基因)；B所示芯片检测结果对应的参考品DNA质粒为ZL-vanB(对应vanB基因)；C所示芯片检测结果对应的参考品DNA质粒为ZL-mecA(对应mecA基因)。图3为用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的临床样本检测结果。该图对应的芯片探针布局示意图如图1所示。其中，A所示芯片检测结果对应1号临床样本；B所示芯片检测结果对应2号临床样本；C所示芯片检测结果对应3号临床样本。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的制备及其使用一、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的组装与制备1、针对3个革兰氏阳性细菌耐药基因设计的引物和杂交探针针对3个细菌耐药基因设计的引物和单链杂交探针具体序列如表1和表2所示。表1针对3个革兰氏阳性细菌耐药基因设计的引物表2针对3个革兰氏阳性细菌耐药基因设计的单链杂交探针编号检测基因GenBank探针名称序列(5’-3’)1mecAAB221119.1mecA-1427GTAGCACTCGAATTAGGCAG(序列7)2vanAM97297.1vanA-379TGTAGGCTGCGATATTCAAA(序列8)3vanBAY655711.1vanB-793GTCGAGGAACGAAATCGGGT(序列9)2、将杂交探针固定于杂交芯片杂交芯片为分别固定有3种单链检测探针的基片。每种检测探针都是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，3种单链检测探针的通式为“NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-杂交探针序列”，其中“杂交探针序列”即为表2中序列7-9所示的3种单链杂交探针”。各检 测探针分别用基因点样液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440010)溶解，终浓度为10μM，重复三次点制到醛基化修饰的玻片(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.420022)上，从而通过氨基与醛基的反应将3种探针固定到杂交芯片上。另外，同样通过氨基与醛基的反应将表面化学质控探针QC、杂交质控探针PC和阴性对照探针BC也固定到杂交芯片上。QC是一端带有Hex标记，另一端具有氨基修饰的单链寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其自5’端到3’端的结构组成为NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex。PC是一段氨基修饰的单链寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的经荧光标记的无关单链DNA分子(C-PC)杂交，用于杂交过程的质控，其自5’端到3’端的结构组成为NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT。BC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交体系中的所有待检测序列均不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其自5’端到3’端的结构组成为NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT。图1为杂交芯片的点阵排布示意图。3、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的组成本发明所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因(即表1和表2中涉及的3种革兰氏阳性细菌耐药基因)的试剂盒含有：(1)步骤1中表1所示的3个引物对；(2)步骤2中固定有3种检测探针以及表面化学质控探针QC、杂交质控探针PC和阴性对照探针BC的杂交芯片；(3)经荧光标记的随机引物；所述随机引物的序列为5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，N9表示9个连续的脱氧核糖核苷酸。(4)杂交液；所述杂交液中含有经荧光标记的无关单链DNA分子(C-PC)，其核苷酸序列为5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’。二、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的使用方法1、样品聚合酶链式反应(PCR)扩增取1μL待测的DNA样品溶液，以其为模板，分别采用表1所示的3个引物对进行PCR扩增。20μLPCR扩增体系如下：10×PCRbuffer(含Mg2+)2μL；2.5mMdNTP1.6μL；10μM上游引物0.5μL；10μM下游引物0.5μL；模板1μL；5U/μLrTaq0.2μL；补水至20μL。PCR扩增程序如下：94℃5min；(94℃30s；55℃30s；72℃1min)30循环；72℃10min。PCR反应结束后共得到3份PCR扩增产物。2、PCR扩增产物的荧光标记每种PCR扩增产物取5μL，加入到不同样品管中，每个样品管中加入3μL浓度 为100μM的经TAMRA荧光标记的9N随机引物(核苷酸序列为5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，N9表示9个连续的脱氧核糖核苷酸，具体为生工生物工程(上海)股份有限公司产品)，补水至19μL，震荡混匀，瞬时离心；95℃变性后置于冰上，加入6μL荧光标记反应体系mix(组成：10×KlenowBuffer2.5μL；5U/μLKlenow酶1μL；2.5mMdNTP2.5μL)。按程序进行荧光标记，程序如下：37℃90min；70℃10min。共得到3份TAMRA荧光标记产物。3、TAMRA荧光标记产物的纯化使用Macherey-Nagel公司生产的NucleoSpinGelandPCRClean-up试剂盒(产品货号：REF740609*250)，对步骤2获得的TAMRA荧光标记产物进行纯化，具体操作按照试剂盒说明书进行。4、杂交将含有经TAMRA荧光标记的无关单链DNA分子(5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’)的杂交buffer(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440030)在50℃融化，配制3份杂交混合液(其中步骤3纯化后的TAMRA荧光标记产物溶液15μL，杂交buffer5μL)，将配制好的3份杂交混合液加入到步骤一2中的杂交芯片上，每份杂交混合液对应一个完整杂交芯片，95℃变性3min，立即放置冰上，并50℃水浴杂交2h。5、清洗用两种不同洗液(洗液I：2×SSC，0.2％SDS，预热至50℃；洗液II：0.2×SSC，预热至50℃)按照先洗液I后洗液II的顺序分别清洗4min后，把芯片放在SlideWasher_8芯片清洗仪中，选择离心程序，离心(或离心机1000rpm离心2min)，甩干。6、扫描及结果判定使用博奥晶芯LuxScan10K微阵列芯片扫描仪完成扫描(选择绿色通道，设定“Power”的参数范围为50-90和“PMT”的参数范围为500-900)，并根据扫描结果按照如下方法确定待测DNA样品中是否含有表1中涉及的3种革兰氏阳性细菌耐药基因，以及具体含有3种革兰氏阳性细菌耐药基因中的哪一种或哪几种：用于检测某革兰氏阳性细菌耐药基因的探针在芯片上的固定位置处如果检测到荧光信号，则判定对应的待测DNA样品中含有对应的革兰氏阳性细菌耐药基因；否则则不含有对应的革兰氏阳性细菌耐药基因。另外，扫描过程中软件会根据检测到的荧光信号强度赋予不同颜色，颜色由蓝色至白色，信号逐渐增强，进而可初步判断待测DNA样品中目标革兰氏阳性细菌耐药基因含量的高低。实施例2、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的特异性和灵敏度测定一、参考品DNA质粒的制备1、含有mecA基因靶标片段的质粒的构建将mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位所示DNA片段连接至pGEM-TEasyVector载体(promega公司产品)上，得到重组质粒ZL-mecA。并经测序验证正确。2、含有vanA基因靶标片段的质粒的构建将vanA基因(GenBank：M97297.1，update：2002-6-20)的第7000-7988位所示DNA片段连接至pGEM-TEasyVector载体上，得到重组质粒ZL-vanA。并经测序验证正确。3、含有vanB基因靶标片段的质粒的构建将vanB基因(GenBank：AY655711.1，update：2005-11-7)的第14-1029位所示DNA片段连接至pGEM-TEasyVector载体上，得到重组质粒ZL-vanB。并经测序验证正确。二、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的特异性分析将步骤一构建的3种参考品DNA质粒均稀释至浓度为104拷贝/μL，分别以稀释后的3种参考品DNA质粒为待测DNA样品，然后按照实施例1步骤二进行操作，检测待测DNA样品中是否含有目的革兰氏阳性细菌耐药基因，具体判定方法参见实施例1步骤二6。结果如图2所示，由图可见对于每一种参考品DNA质粒而言，均仅为固定了相应检测探针的点能够检测到明显荧光信号，其他点均没有检测到荧光信号。该结果表明本发明所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒具有较强的特异性。三、用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的灵敏度分析将上述步骤一构建的3种参考品DNA质粒分别进行梯度稀释，得到浓度依次为104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL的稀释液。分别以不同稀释度的3种参考品DNA质粒为待测DNA样品，然后按照实施例1步骤二进行操作，检测待测DNA样品中是否含有目的革兰氏阳性细菌耐药基因，具体判定方法参见实施例1步骤二6。结果显示：对于每一种参考品DNA质粒而言，浓度为104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL时相应检测探针的点都能够检测到明显荧光信号；仅浓度为101拷贝/μL的参考品DNA质粒没有检测到荧光信号。该结果表明本发明所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒具有较高的灵敏度。实施例3、实际临床样品的检测一、临床样本类型本实施例所采用临床样本来自于北京大学人民医院采集的人伤口处粘稠脓液(本着本采集者自愿的原则)，共三份。二、临床样本中DNA样品的提取1、取步骤一的临床样本1-3mL；2、加入4倍体积4％(4g/100mL)的NaOH，摇匀，室温放置30min液化；3、取0.5ml液化后脓液与0.5mL4％(4g/100mL)的NaOH，室温，10min；4、12000rpm离心15min；5、弃上清，加无菌生理盐水1mL，混匀，12000rpm离心5min；6、弃上清，沉淀用于DNA提取；7、加入50μL核酸提取液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.360090)，充分震荡混匀，使沉淀完全悬浮；8、将悬浮液转移至核酸提取管中，旋紧管盖，放入核酸提取仪或涡旋震荡仪上最大转速震荡5min；9、95℃金属浴加热5min；10、5000rpm离心1min，将上清液转移至1.5mL离心管中，-20℃保存备用。三、实际临床样品的检测将步骤二获得的三份临床样本DNA为待测DNA样品，然后按照实施例1步骤二进行操作，检测待测DNA样品中是否含有目的革兰氏阳性细菌耐药基因，具体判定方法参见实施例1步骤二6。结果如图3所示，由图可见三份样本杂交信号均清晰且单一。经与探针位置比对，1号临床样本中检测得到信号为耐药基因mecA，2号临床样本中检测得到信号为耐药基因mecA和耐药基因vanA，3号临床样本中检测得到信号为耐药基因vanB。为了进一步确定以上本发明检测结果的准确性，本发明的发明人将三份临床样本的PCR扩增产物进行了琼脂糖凝胶电泳及测序验证，结果证实：1号临床样本仅采用引物对mecA-F/mecA-R的扩增产物具有明显的电泳条带，而其他引物对的扩增产物均没有检测到明显的电泳条带，进一步对引物对mecA-F/mecA-R的扩增产物测序发现其序列正为mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位；2号临床样本仅采用引物对mecA-F/mecA-R和vanA-F/vanA-R的扩增产物具有明显的电泳条带，而其他引物对的扩增产物均没有检测到明显的电泳条带，进一步对引物对mecA-F/mecA-R和vanA-F/vanA-R的扩增产物测序发现其序列正为mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位和vanA基因(GenBank： M97297.1，update：2002-6-20)的第7000-7988位；3号临床样本仅采用引物对vanB-F/vanB-R的扩增产物具有明显的电泳条带，而其他引物对的扩增产物均没有检测到明显的电泳条带，进一步对引物对vanB-F/vanB-R的扩增产物测序发现其序列正为vanB基因(GenBank：AY655711.1，update：2005-11-7)的第14-1029位。该结果证明利用本发明试剂盒的检测结果准确可靠。当前第1页1 2 3