本发明涉及壳聚糖领域，特别是指一种两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物及其制备方法。
背景技术：
地球上存在的天然有机化合物中，数量最大的是纤维素，其次就是甲壳素(结构式如式1所示)；同时甲壳素还是地球上除蛋白之外数量最大的可再生含氮天然有机化合物[蒋挺大，壳聚糖，2006年第二版]。而壳聚糖(chitosan)则是甲壳素脱乙酰后的产物，其结构式见式2，是一种天然碱性多糖，具有优良的生物亲和性和生物可降解性，容易制成各种衍生物。因其来源极其丰富，能溶解在盐酸、醋酸和其它有机酸中，已被广泛应用于工业和医药领域。尤其是抗菌性，壳聚糖由于具有生物可降解性、生物相容性、生物无毒性和抗菌活性等特点，使其成为近年来天然抗菌剂开发的研究热点之一。但是，与传统的抗菌剂相比壳聚糖的抗菌活性低，且不溶于水，只能溶解于某些稀酸溶液，从而极大地限制了壳聚糖作为抗菌剂的推广和应用。
为了提高壳聚糖的水溶性，人们采取了多种方法使壳聚糖能溶于水。首先，控制壳聚糖的脱乙酰度可以得到水溶性壳聚糖。比如，sannan等发现[sannant.,et.al.,makromo.chem.1976,177,3589.]，当甲壳素的脱乙酰度为50％左右时，壳聚糖能溶于水。后来，kurita等又发现[kuritak.,et.al.,chem.lett.1989,1597；kuritak.,et.al.,carbohydr.res.1991,16,83.]，对脱乙酰度较高的壳聚糖进行乙酰化，控制其脱乙酰度在50-60％之间，也可以得到水溶性的壳聚糖。其次，将壳聚糖制备成各种无机酸或有机酸盐，也能得到水溶性壳聚糖，最常见的是壳聚糖盐酸盐。另外，对壳聚糖进行化学改性，还可以得到水溶性壳聚糖衍生物，比如羧甲基壳聚糖(见式3)等。虽然上述方法很好地解决了壳聚糖水溶性问题，但其抗菌性能却未有明显提高。
胍基是目前自然界发现的正电性最强的生物活性有机碱，其在生理ph介质下能够质子化，在中性、酸性和碱性条件下均能形成带正电的基团。胍基化合物广泛存在于天然产物中，溶解性强，有很强的碱性和正电性。胍基基团具有抗炎症、降压降血脂、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，同时具有强碱性、强稳定性、较好的生物活性，且易于形成氢键，从而具有很好的抗菌性能，被广泛用于医药、农业、建筑、服装、化工等领域。胍基在一般条件下都处于完全质子化状态，保持正电性[韦长梅，胍基化合物的合成与晶体结构研究，博士学位论文，2004.]。胍基能通过静电或氢键作用于受体和配体，因而可以起到很好的药物作用，胍基化合物用作药物主要有抗高血压药物、降血糖药和抗病毒药三种。而壳聚糖上的氨基具有较高的反应活性，因此通过氨基对壳聚糖进行胍基化改性赋予其与胍类化合物类似的性能，进而提高壳聚糖的抑菌和抗菌性能。hu等将三氧化硫脲与壳聚糖反应得到胍基壳聚糖亚硫酸氢盐(huy.,et.al.,carbohyd.polym.2007,67,66.)。sun等以三聚磷酸钠为交联剂，聚六亚甲基胍磷酸盐为胍化试剂合成胍基化壳聚糖(bioresourtechnol，2010，101，5693.)。zhai等人以单腈氨为胍基化试剂跟壳聚糖反应，得到了单胍壳聚糖(zhaix.,et.al.,j.appl.polym.sci.2011,121,3569.)。另外，xiao等人以精氨酸为胍基化试剂，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为催化剂，让精氨酸与壳聚糖在2-(n-n-吗啡啉)乙烷磺酸(mes)缓冲液中常温下反应，同样得到了胍基化壳聚糖(xiaob.,et.al.,carbonyd.polym.2011,83,144.)。然而，现有壳聚糖胍基化改性的方法均需酸性环境下进行，存在过程复杂、反应时间长等诸多不足，这在一定程度上影响了其进一步应用。
技术实现要素：
为了解决壳聚糖的抑菌和抗菌性能中存在的上述一种或者多种问题，本发明提供了一种两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物和两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物制备方法。
本发明在第一方面提供了一种两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物，它具有如下 所示的结构式(4)：
其中，n、x为自然数，n表示羧甲基壳聚糖重复结构单元数，x表示胍基取代重复结构单元数，n为10-107，x为1-107。
优选地，本发明的两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物，兼具羧甲基壳聚糖和胍基化合物双重特点，在改善壳聚糖水溶性的同时提高了壳聚糖的抑菌和抗菌性能。
优选地，本发明的两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物分子上的羧甲基带有阴离子负电荷，胍基带有比氨基更强的阳离子正电荷，提高了其应用范围，酸性介质、碱性介质中均可使用，使用的ph值范围变宽。
优选地，本发明的两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物作为生物可降解材料，毒性小，生物安全性高，是一种绿色产品。
本发明在第二方面提供了一种由本发明第一方面所述两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s1：将羧甲基壳聚糖加入到去离子水中，在水浴条件下进行搅拌，得第一混合液；
s2:在水浴条件下，将胍基化试剂加入到所述第一混合液中，恒温反应，得第二混合液；
s3：将所述第二混合液过滤，然后用去离子水进行透析处理，得透析液；
s4:将所述透析液进行冷冻干燥，得两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物。
本发明所述的化学反应如式5所示：
其中，n、x为自然数，n表示羧甲基壳聚糖重复结构单元数，x表示胍基取代重复结构单元数，n为10-107，x为1-107。
优选地，步骤s1中，所述羧甲基壳聚糖可选用各种市售产品，所述羧甲基壳聚糖为o-羧甲基壳聚糖。
优选地，所述o-羧甲基壳聚糖分子量为2～20万；所述o-羧甲基壳聚糖取代度为5～90％；所述o-羧甲基壳聚糖脱乙酰度为20～100％。
优选地，步骤s1中，所述第一混合液是羧甲基壳聚糖水溶液；所述羧甲基壳聚糖水溶液的浓度为1～500毫克/毫升，例如为：1、5、10、20、50、70、100或500毫克/毫升。
优选地，步骤s1中，将羧甲基壳聚糖加入到去离子水中，在水浴条件下进行机械搅拌，是为了使羧甲基壳聚糖可以完全溶解。
优选地，步骤s1中，水浴温度为10～100℃，搅拌时间为10～160min；更优选地，水浴温度为20～80℃，例如为：25、35、45、50、60或80℃；搅拌时间为30～120min；例如为：30、60或120min。
优选地，步骤s2中，所述胍基化试剂为三氧化硫脲。
优选地，步骤s2中，将胍基化试剂缓慢加入到所述第一混合液中所用的加料时间为5～100min；更优选地，所用加料时间为30～90min，例如为：30、40、50、60、80或90min。
优选地，步骤s2中，所述胍基化试剂与所述第一混合液中羧甲基壳聚糖的摩尔比为0.005～12：1；更优选地，所述胍基化试剂与所述第一混合液中羧甲基壳聚糖的摩尔比为0.01～10：1，例如为：0.01:1、0.5:1、1：1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1。
优选地，步骤s2中，将胍基化试剂加入到所述第一混合液中，恒温反应，反应时间为5～90min；更优选地，恒温反应是指在水浴条件下恒温反应，反应时间为10～60min，例如为：10、20、30、40、50或60min。
优选地，步骤s3中，将所述第二混合液过滤后装入透析袋，需将透析袋 两端扎紧放入去离子水中进行透析处理，每隔四小时换一次水，总共换八次水。
优选地，用去离子水对透析袋中的第二混合液进行透析处理，是为了去除小分子副产物或杂质，纯化样品。
优选地，步骤s4中，将所述透析液进行冷冻干燥的具体步骤是：将透析液放入-20～-90℃的冰箱冷冻1～10h，然后放入冻干机冻干；更优选地，将透析液放入-86℃冰箱冷冻1h。
另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果：
1、本发明方法制得的两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物，由于壳聚糖的分子上既有阴离子基团又有阳离子基团，具有明显的两性特征，不仅改善了壳聚糖的水溶性，而且提高了其抑菌和抗菌性能。
2、反应的主要原料羧甲基壳聚糖来源广泛，价格相对便宜。
3、本发明两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的制备方法简单，可在反应釜内一次反应制得，适用于带不同电荷的环境，使用ph范围较宽。
4、样品经透析处理，避免了醇析法所造成的杂质去除不尽的缺点。
5、采用冷冻干燥的方法来处理样品，避免了传统样品烘干过程中抑菌基团因分解而导致的抑菌效果下降。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方案做进一步说明。这些实施例只是就本发明的优选实施方式进行举例说明，本发明的保护范围不应解释为仅限于这些实施例。
实施例1
两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的制备
将100毫克羧甲基壳聚糖加入到100毫升去离子水中，在25℃的水浴条件下进行机械搅拌30min，得到浓度为1毫克/毫升的羧甲基壳聚糖水溶液；
按照三氧化硫脲与羧甲基壳聚糖的摩尔比为10:1的比例，在25℃条件下，将三氧化硫脲在30min内缓慢加入到所述羧甲基壳聚糖水溶液中，保持反应釜内反应温度为25℃，反应60min，得第二混合液；
将所述第二混合液过滤后装入透析袋中，并将透析袋两端扎紧放入去离子水中进行透析处理，每隔四小时换一次水，换八次水后将透析液放入-86℃冰 箱冷冻1小时，然后放入冻干机冻干，得到所述两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物。
所得产品元素分析结果和胍基取代度如表2所示。
实施例2至8
除了表1所示内容之外，以与实施例1相同的方式制备两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物。
表1实施例1-8中制备两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物中原料用量及制备过程参数
表2原料、实施例1-8中样品元素分析结果和胍基取代度
实施例9
两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物在抗菌性能中的应用
按照卫生部2002年版《消毒技术规范》里的涂板法进行测试，具体是将浓度为0.2mg/ml的两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的水溶液和灭菌后的45-50℃培养基按照1:9的比例混合均匀，然后趁热倒入培养皿中，培养皿约需培养基溶液20ml；然后待培养基板冷却至室温凝固后涂金黄色葡萄球菌，涂菌后在37℃的培养箱内培养36小时。
实施例10至18
除了表3所示内容之外，以与实施例9相同的方式对两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的抗菌性能进行测试。
对比例1
除了表3所示内容之外，以与实施例9相同的方式对o-羧甲基壳聚糖的抗菌性能进行测试。
对比例2
除了表3所示内容之外，以与实施例9相同的方式对o-羧甲基壳聚糖的抗菌性能进行测试。
对比例3
除了表3所示内容之外，以与实施例9相同的方式对壳聚糖的抗菌性能进行测试。
对比例4
空白组除了表3所示内容之外，以与实施例9相同的方式对抗菌性能进行测试。
表3实施例9至18和对比例1至3对金黄色葡萄球菌抗菌性能的研究
注明：以上平均菌落数是多次重复实验得到的结果，存活率是以空白组为参照计算得出的。
从表3可以看出，当培养基内两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的浓度为2mg/ml时可将金黄色葡萄球菌全部杀死，当两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物的浓度为1.8mg/ml时可将超过95％的金黄色葡萄球菌杀死；而o-羧甲基壳聚糖 浓度为10mg/ml时才可将金黄色葡萄球菌全部杀死，壳聚糖浓度为10mg/ml时可2.8％的金黄色葡萄球菌杀死，基本没有抑制性能；由此可见两性羧甲基壳聚糖胍盐衍生物具有良好的抗菌性能。