本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种融合蛋白和基于该融合蛋白的elisa方法。
背景技术：
elisa（enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附测定）作为一种成熟的抗原抗体检测技术，已经在市场上得到广泛的应用。然而，由于检测过程需要使用酶标仪或分光光度计，受制于检测仪器，应用现场环境较严格，也使得检测的时效性受到一定影响。因此，发明一种便捷、易携带、对现场环境要求低同时也兼具高灵敏度的elisa检测方法可极大地拓展检测适用的范围和提高操作的便捷程度。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种融合蛋白和基于该融合蛋白的elisa方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示：
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所述融合蛋白可用于制备elisa检测试剂及试剂盒。
基于上述融合蛋白的elisa方法包括如下步骤：
（1）将检测样品与相应抗体结合：将具有专一性的抗体固定在塑胶孔盘上，当固定稳固后洗去多余的抗体；然后加入待测的检测样品，使检测样品与抗体充分结合，待结合牢固后洗去多余的检测样品；
（2）加入生物素标记的抗体：加入生物素标记的抗体后形成抗体-待测样品-生物素标记抗体的夹心复合物；待生物素标记抗体与待测样品结合牢固后，洗去多余的生物素标记抗体；
（3）将所述的融合蛋白加入到塑胶孔盘中，使该融合蛋白与夹心复合物结合后得到最终复合物，待结合牢固后洗去多余的融合蛋白；所述的融合蛋白为链霉亲和素-蔗糖酶融合蛋白，链霉亲和素具有与某些蛋白质形成共价键的能力，根据链霉亲和素的这一特性，可以使链霉亲和素与蔗糖酶融合形成链霉亲和素-蔗糖酶融合蛋白；
（4）待测样品的检测：向最终复合物中加入浓度为50mm的蔗糖溶液，其中蔗糖溶液与最终复合物的体积比为1:1，并测定葡萄糖的量，葡萄糖的量即为检测样品。由于蔗糖在蔗糖酶的作用下可以分解成葡萄糖，所以可以根据得到的葡萄糖的量来确定构建的最终复合物的量，而最终复合物与检测样本为1：1的关系，即可以通过葡萄糖的量来确定检测样本的含量。由于检验葡萄糖的方法十分简便，可以通过血糖仪等设备及时检测，所以通过该方法可以迅速检测出检测样本的相关指标。
下面对本发明作进一步说明：
（1）生物素标记的抗体化。
应用生物素标记抗体是70年代后期发展的一类新型生物反应放大技术。生物素是动、植物中广泛分布的一种羧化酶的辅酶。它的咪哇环基是和亲和素色氨酸残基结合的部分，其戊酸侧链上的羧基是与抗体或酶结合的位点。生物素经羟基丁二酰亚胺活化为生物素-n-羟基丁二酰亚酯，其酯基可与不同的基团结合而不影响后者活性。结合于抗体分子上的生物素可与多个亲和素结合，从而产生多级放大效应。
整个过程经过单克隆抗体的提取和纯化、sds-page电泳鉴定纯化单克隆抗体的纯度、elisa法测定抗体活度、生物素标记的抗体的制备和活性测定等步骤。
在生物素标记抗体时应注意使用高纯化抗体，反应体系应不含-nh2等物质，否则这些物质会与生物素进行结合而影响生物素与抗体的交联。另外生物素如果不足放大效率低，达不到所需的敏感性。如果过多则会封闭抗体的抗原结合位点。
实验方法测试阶段，可直接购买商业化的生物素标记抗体。
（2）链霉亲和素与蔗糖酶的融合。
链霉亲和素与蔗糖酶融合蛋白的设计与表达是本项目的关键。融合蛋白的整体结构需不影响两个结构域的分别功能，即链霉亲合素的生物素结合能力和蔗糖酶水解蔗糖的能力。计划将链霉亲和素与蔗糖酶基因直接插入一段柔软的多聚丙氨酸长链，使其连接的两个结构域相对独立。
链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，是链霉亲和素菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。链霉亲和素等电点低、不含糖基。与生物素高特异性结合。
（3）抗体化生物素和链霉亲和素-蔗糖酶融合蛋白的结合
在链霉亲和素基础上建立的生物素-链霉亲和素系统（bas）在实际应用中具有显著的优越性：
ⅰ.灵敏度高。生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比适度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，bas具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
ⅱ.特异性高。亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，bas的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，bas结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
ⅲ.稳定性高。亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，bas在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
综上所述，现场检测不但可提高结果判定效率，还大大减少了在保存与运输中产生的额外成本。该改进后的elisa可用于多种传染病抗原或抗体（间接elisa法检测抗体）的现场检测，灵敏度较高，具有广泛的应用价值与前景。
本发明正是通过替换elisa方法中酶标抗体或抗原的常用的辣根过氧化物酶为蔗糖酶，常规elisa方法将待测抗原或抗体的浓度转化辣根过氧化物酶催化产生底物颜色深浅的差异，而本方法将抗原或抗体的浓度转化为更为灵敏葡萄糖浓度的信号，进而可使用便携式个人血糖仪检测其信号。该检测方法相比其他的抗原抗体检测方法更为便捷，对仪器以及环境要求较低，可以运用于现场检测。由于部分现场采集的标本不易保存运输，现场检测不但可提高结果判定效率，还大大减少了在保存与运输中产生的额外成本。该改进后的elisa可用于多种传染病抗原或抗体（间接elisa法检测抗体）的现场检测，灵敏度较高，具有广泛的应用价值与前景。
总之，本发明为了简化elisa检测的实验过程、降低监测的准入门槛，将血糖仪运用到elisa检测中，代替分光光度计。本发明将链霉亲和素-蔗糖酶融合蛋白连接到生物素标记的抗体上，再向试验体系中加入蔗糖。血糖仪通过测量蔗糖酶分解蔗糖获得的葡萄糖的量，从而获得所测抗原或抗体的量。
具体实施方式
融合蛋白的序列组成：蔗糖酶基因c端连接链霉亲和素基因，两者之间连接有一段6聚丙氨酸序列以增加柔韧性，并确保两端结构域的功能独立。此外，合成基因两端分别连接有bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点。所合成基因经双酶切后，经t4dna连接酶连入载体petduet。连接产物转化新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)，用含有100μg/ml青霉素的lb固体培养基平板筛选。使用大肠杆菌bl21(de3)对重组质粒进行诱导表达，选取乳糖做诱导剂（0.3g/100ml），37℃培养至菌液od600约为0.6时进行诱导。诱导后使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）检测所诱导蛋白的表达情况。在冰水浴条件下，对离心收集的大肠杆菌细胞以200w的功率进行超声破碎，向裂解好的菌体中加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。将超声破碎物在4℃条件下11000g离心40min，取上清液。
融合蛋白质的纯化
大肠杆菌裂解液中的包涵体以变性液（6m盐酸胍，500mmtris-hcl，ph8.5，10mm二硫苏糖醇，10mm巯基乙醇，1mm磷酸二苯酯和2mmmgcl2）溶解。
溶解后的融合蛋白装入透析袋内，于4℃在透析缓冲液（100mmtris-hcl，ph8.5，10mm二硫苏糖醇，5mm还原性谷胱甘肽,1mm氧化性谷胱甘肽，1mm磷酸二苯酯，2mmmgcl2，500mml-精氨酸）中搅拌透析，每3小时更换一次新透析液，共换5次。
使用亲和素亲和层析法来纯化蛋白。以2-亚氨基生物素琼脂糖凝胶装柱。使用ph11.0的0.05mol/l碳酸钠溶液预处理亲和层析柱。将蛋白粗提取物上样，用0.05mol/l碳酸钠溶液洗脱杂蛋白。当洗脱液的uv吸收值od280降至0.05以下后，再用ph4.0的0.1mol/l醋酸钠缓冲液解离，收集包含目的蛋白洗脱液，以得到纯化的融合蛋白。
检测方法一（检测样品中的抗原）
在包被有抗体的elisa板小孔内加入200μl待测样品或样品溶液，37℃温育30分钟后，以洗涤缓冲液（pbs-tween）洗涤塑料皿3次。再向塑料皿中加入亲和素标记的抗体200μl，37℃温育30分钟后，再次以pbs-tween洗涤3次。加入融合蛋白，10分钟后，pbs-tween洗涤3次，加入蔗糖溶液（4mmol/l）。5分钟后，取一滴液滴使用便携式血糖仪读数。读数水平正比于样品中待测抗原浓度。
检测方法二（检测样品中的抗体）
在包被有重组抗原的elisa板小孔内加入200μl待测样品或样品溶液，37℃温育30分钟后，以洗涤缓冲液（pbs-tween）洗涤塑料皿3次。再向塑料皿中加入亲和素标记的抗人iggfc端的二抗200μl，37℃温育30分钟后，再次以pbs-tween洗涤3次。加入融合蛋白，10分钟后，pbs-tween洗涤3次，加入蔗糖溶液（4mmol/l）。5分钟后，取一滴液滴使用便携式血糖仪读数。读数水平正比于样品中待测抗原浓度。
应用实例：检测口腔黏膜渗出液中的抗hiv-1抗体
1．以口腔拭子擦拭牙龈，获取口腔黏膜渗出液。
2．立即将拭子放入装有的500μlpbs的eppendorf管中以稀释样品，并将拭子紧贴管壁，上下刮擦6-10次。
3．吸取200μl上述稀释的样品，加入包被有hiv-1p24抗原的96孔板的小孔内，37℃温育30分钟。同时，设抗hiv-1p24抗体的阳性对照与非特异性抗体的阴性对照。
4．以含有0.01%tween-20的pbs洗涤96孔板3次。弃去洗涤液后，向塑料皿中加入亲和素标记的抗人igg的二抗100μl（1:20000），于37℃温育30分钟。
5．96孔板的小孔中加入链霉亲和素与蔗糖酶的融合蛋白100μl（0.01μg/l），继续置于37℃温育30分钟。
在每孔加入20μl蔗糖溶液（0.2mol/l），5分钟后，以血糖仪读数，若读数大于5mg/dl，则测试样品为阳性（含有抗hiv-1p24抗体），且读数正比于样品中抗hiv-1p24抗体浓度。
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