技术领域本发明涉及一种不饱和脂肪酸酰胺类化合物及其制备方法和作为癌症和真菌感染治疗药物的用途。
背景技术：
不饱和脂肪酸酰胺类化合物主要来源于植物。例如花椒麻素(sanshoamides)，其主要来源于芸香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥果皮。花椒麻素是花椒呈麻味的主要成分，花椒麻素中主要含有α-山椒素(α-sanshool)、β-山椒素(β-sanshool)、γ-山椒素(γ-sanshool)和α-山椒酰胺(α-sanshoamide)等多种不饱和脂肪酸酰胺类化合物，其中β-山椒素如下所示：β-山椒素的结构式花椒麻素具有多种生理功能，如麻醉、兴奋、抑菌、祛风除湿、杀虫、镇痛等。因此，其在药物、功能性食品、功能性化妆品、生物农药产品和植物保护等领域发挥着重要的作用。目前有26个不同科包括100多种植物产生不饱和脂肪酸酰胺类化合物。从植物中提取该类化合物涉及资源限制、提取工艺的复杂等多重问题，并最终阻碍了该类化合物的应用，因此开发可以代替植物资源的微生物资源具有重要的应用价值。
技术实现要素：
本发明主要涉及由链霉菌Streptomycesmaoxianensissp.nov.发酵培养得到的新的不饱和脂肪酸酰胺类化合物，及它们的制备方法和应用。本发明涉及一种新不饱和脂肪酸酰胺类化合物1，其分子结构如下：本发明还涉及一种新不饱和脂肪酸酰胺类化合物2，其分子结构如下：本发明还提供了一种上述新不饱和脂肪酸酰胺类化合物的制备方法，该方法通过发酵培养Streptomycesmaoxianensissp.nov.，然后经过提取分离得到所述新不饱和脂肪酸酰胺类化合物。上述制备方法包括如下步骤：(1)发酵培养链霉菌(Streptomycesmaoxianensissp.nov.)，并收集发酵液；(2)将步骤(1)收集得到的发酵液，通过过滤得到菌丝体，菌丝体经过有机溶剂提取得到有机溶剂提取液；(3)将步骤(2)所得有机溶剂提取液，经过浓缩、硅胶及凝胶柱层析得到含有不饱和脂肪酸酰胺类化合物的流分样品；(4)将步骤(3)中得到的流分样品进行反相制备柱层析得到不饱和脂肪酸酰胺类化合物。其中，步骤(1)涉及的菌株Streptomycesmaoxianensissp.nov.是从土壤中分离得到的产不饱和脂肪酸酰胺类化合物的链霉菌。该菌株的16SrRNA在Genbank上的登记号为KF887908。该菌由东北农业大学生物化工实验室提供，保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏号为：CGMCCNo.4.7139。上述制备方法中，其中步骤(1)所述发酵液的制备方法为：链霉菌(Streptomycesmaoxianensissp.nov.)利用可同化的碳源、氮源经液态发酵得到，其中所述的可同化的碳源优选自葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、工业糖蜜、甘油、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、麦芽糖、木聚糖或它们的组合，更优为葡萄糖与可溶性淀粉组合、葡萄糖与玉米淀粉组合；其中所述的可同化的氮源优选自酵母粉、酵母抽物、黄豆饼粉、大豆粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆干粉、麸皮、麸质粉、尿素、铵盐或它们的组合，更优选为黄豆饼粉、大豆粉或二者的组合。上述制备方法中，其中步骤(2)所述的有机溶剂优选为丙酮、甲醇、乙醇或它们的组合。上述制备方法中，其中步骤(3)所述的硅胶柱层析优选使用粒径100-200目的硅胶，优选使用二氯甲烷：甲醇＝100:0-50:50(V/V)为洗脱溶液进行洗脱；其中所述的凝胶柱层析优选使用凝胶LH-20，优选使用氯仿/甲醇＝1：1(V/V)为洗脱溶液进行梯度洗脱。上述制备方法中，其中步骤(4)所述的反相制备柱层析优选使用C18的反相填料，并且使用的洗脱溶剂优选为乙腈的水溶液，甲醇的水溶液或者甲醇、乙腈混合有机溶剂的水溶液。近一步，本发明涉及上述不饱和脂肪酸酰胺类化合物用于及其作为癌症和真菌感染治疗剂的用途；其中所述的癌症优选自肺癌、血癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等；其中所述的真菌优选自水稻纹枯菌、辣椒疫病菌、黄瓜枯萎菌、大豆菌核致病菌、番茄灰霉菌。更近一步，本发明提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的上述不饱和脂肪酸酰胺类化合物及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。具体实施方式不饱和脂肪酸酰胺类化合物产生菌Streptomycesmaoxianensissp.nov.的发酵培养及不饱和脂肪酸酰胺类化合物的提取，分离和活性实验见下面的具体实施例。以下实施例是对本发明的进一步说明但不限制本发明。实施例1菌株Streptomycesmaoxianensissp.nov.的发酵培养(1)发酵菌种：发酵菌种为链霉菌Streptomycesmaoxianensissp.nov.。(2)斜面培养：采用ISP2培养基(酵母膏4.0g,麦芽汁10.0g,葡萄糖4.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,pH值7.0-7.2)于121℃下灭菌20min，接菌后在28℃下培养6-8天。(3)种子培养：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖4，麦芽浸出粉10，酵母粉4，CaCO3g,蒸馏水1000ml，pH值7.0，用1000ml的三角瓶每瓶分装250ml，然后用12ml无菌水将斜面的链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1×107～1×108个/ml。每瓶加2ml孢子悬浮液，置于摇床上，转速250r/min，28℃培养24h。(4)发酵培养：发酵培养基组成(g/L)：酵母粉0.4，可溶性淀粉4，葡萄糖1，黄豆饼粉1，NaCl0.1，K2HPO40.2，MgSO4·7H2O0.1，CaCO30.2，pH值7.2-7.4，蒸馏水配置，于121℃下灭菌20min。按8％接种量，将种子液接入至50L发酵罐中(30L容装量)，28℃条件下培养，搅拌率为100r/min，通风率120m3/h，培养6-7天。实施例2化合物1和化合物2的提取分离按实施例1方法发酵培养得到15L发酵液，经200目筛网过滤得到菌丝体滤饼。滤饼用去离子水洗后再用10L工业甲醇浸泡过夜，过滤得甲醇提取液。所得提取液在50℃减压浓缩去除甲醇相直至干，得到33g油状物质。将所得的油状物质上硅胶柱(粒径100-200目)进行柱层析，用二氯甲烷：甲醇＝100:0-50:50(V/V)进行梯度洗脱，通过TLC检测，得到3个组分(1-3)。将组分2经凝胶LH-20柱层析(氯仿/甲醇＝1：1，V/V)得到组分2-1和2-2，然后使用半制备柱色谱，以下述色谱条件进行进一步纯化。组分2-1的半制备柱色谱条件如下：液相系统：Agilent1100半制备高压液相色谱仪；色谱柱:ZORBAXSB-C18(250mm*9.4mm)；洗脱剂：乙腈/水＝12:88(V/V)；流速：1.5mL/min；检测波长：λ＝220nm；收集保留时间为29.0min的峰得到化合物1(31.0mg)。组分2-2的半制备柱色谱条件如下：液相系统：Agilent1100半制备高压液相色谱仪；色谱柱:ZORBAXSB-C18(250mm*9.4mm)；洗脱剂：乙腈/水＝17:83(V/V)；流速：1.5mL/min；检测波长：λ＝220nm；收集保留时间为18.6min的峰得到化合物2(6.3mg)。实施例3化合物1和化合物2的结构鉴定通过1D和2DNMR、MS等波谱分析确定不饱和脂肪酸酰胺类化合物的结构如下：化合物1的结构式为：化合物2的结构式为：化合物1和化合物2的理化性质如下：化合物1性状：无色油状溶解性：易溶于甲醇，丙酮，微溶于水，不溶于石油醚分子式：C17H31NO6比旋度：(c0.25,EtOH)高分辨质谱(HRESI-MS):368.2039[M+Na]+(calcdforC17H31NO6Na368.2044)紫外吸收光谱(UVabsorptionspectrum)λmax(EtOH)nm(logε)：202(4.32)红外吸收光谱(IRabsorptionspectrum)Vmaxcm-1：3461，2966，2930，1717，1450，1381，1341，1042，988化合物2性状：无色油状溶解性：易溶于甲醇，丙酮，微溶于水，不溶于石油醚分子式：C17H31NO6比旋度：(c0.30,EtOH)高分辨质谱(HRESI-MS):346.2222[M+H]+(calcdforC17H32NO6346.2224)紫外吸收光谱(UVabsorptionspectrum)λmax(EtOH)nm(logε)：201(4.20)，红外吸收光谱(IRabsorptionspectrum)Vmaxcm-1：3354，2931，2875，1650，1541,1383，1051化合物1和化合物2的1H和13CNMR(CD3OD)数据见表1。表1化合物1和化合物2在CD3OD中的核磁数据(氢谱，400MHz；碳谱，100MHz)实施例4化合物1和化合物2对肿瘤细胞的抑制活性采用CCK-8法(TominageH等.AnalCommun，36，第47-50页(1999).)测得化合物1和化合物2对人肺腺癌细胞A549，人血癌细胞K562和人肝癌细胞HepG2的IC50(μg/mL)，结果见下表2：表2化合物1和化合物2对3株肿瘤细胞的抑制作用实施例5化合物1和化合物2对大豆菌核致病菌(sclerotiniasclerotiorum)的抑制活性采用琼脂扩散法(Iwatsuki,M等，J.Antibiot，61，第222-229页(2008).)，测得化合物1和化合物2对大豆菌核致病菌sclerotiniasclerotiorum的抑制圈大小(mm)结果如下表3：表3化合物1和化合物2对真菌的抑制作用注：抑菌圈越大活性越好。