本发明属于生物医药领域，涉及一种从大血藤分离出来的天然化合物，还涉及它的制备方法，及其在生物医药中的应用。
背景技术：
：大血藤(拉丁学名：Sargentodoxacuneata(Oliv.)Rehd.etWils.)，习称红藤，又名血藤、红皮藤等，大血藤为落叶、木质藤本植物；茎红褐色；复叶三出，互生；花单性异株，辐射对称，花瓣6，极小，花萼6，花瓣状；果实为聚合果，由多个肉质小浆果组成。生于山坡疏林、溪边；有栽培。主产湖北、四川、江西、河南、江苏；安徽、浙江亦产。性味苦，平。具有清热解毒，活血通络，祛风止痉的作用。风湿痹痛，赤痢，血淋，月经不调，疳积，虫痛，跌扑损伤。迄今为止，尚未见大血藤提取物在短暂脑缺血再灌注损伤的相关性报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从大血藤首次分离的天然化合物，同时还提供该天然化合物的制备方法，另外该天然化合物结构新颖可以单独或者协同其他药物用于开发治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种从大血藤分离出来的天然化合物，天然化合物是具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：上述天然化合物的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将大血藤粉碎，用65～75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用20％乙醇洗脱9个柱体积，再用65％乙醇洗脱10个柱体积，收集65％洗脱液，减压浓缩得65％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中65％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1、7:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为58％的甲醇水溶液等度洗脱，收集11～15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。作为优选，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。上述天然化合物在制备治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。本发明的优点：本发明提供的一种结构新颖的天然产物，该天然产物单独作用时，对短暂脑缺血再灌注损伤具有治疗作用；该天然产物还可以和其他药物联合作用时，可以开发成治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证分离方法：(a)将大血藤(2kg)粉碎，用70％乙醇热回流提取(15L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用20％乙醇洗脱9个柱体积，再用65％乙醇洗脱10个柱体积，收集65％洗脱液，减压浓缩得65％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中65％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1(9个柱体积)、35:1(10个柱体积)、15:1(8个柱体积)和7:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1(6个柱体积)、7:1(7个柱体积)和1:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为58％的甲醇水溶液等度洗脱，收集11～15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(纯度大于98％)。结构确证：HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z245.1099，结合核磁特征可得分子式为C15H16O3，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-1(2.88，s)，H-2(5.85，d，J＝12.2Hz)，H-3(5.51，d，J＝12.2Hz)，H-5(2.66，dd，J＝10.4，9.6Hz)，H-6(3.66，dd，J＝10.4，9.0Hz)，H-7(2.84，dddd，J＝9.0，8.2，3.2，2.8Hz)，H-8(4.05，dd，J＝8.3，3.0Hz)，H-9a(2.96，qd，J＝14.0，3.3Hz)，H-9b(2.17，qt，J＝14.0，5.6Hz)，H-13a(6.18，dd，J＝3.2，0.7Hz)，H-13b(6.05，dd，J＝2.8，0.7Hz)，H-14a(5.03，d，J＝1.4Hz)，H-14a(5.02，d，J＝1.4Hz)，H-15a(5.34，br，d，J＝2.2Hz)，H-15b(5.11，br，d，J＝2.2Hz)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：59.2(CH，1-C)，131.5(CH，2-C)，122.4(CH，3-C)，144.8(C，4-C)，54.6(CH，5-C)，77.9(CH，6-C)，52.6(CH，7-C)，75.8(CH，8-C)，42.9(CH2，9-C)，145.4(C，10-C)，136.6(C，11-C)，169.6(C，12-C)，124.7(CH2，13-C)，118.6(CH2，14-C)，114.2(CH2，15-C)。IR光谱表明该化合物含有羟基(3602cm-1)，γ-内酯(1770cm-1)和亚甲基基团(1664cm-1)。氢谱显示出三组末端双键质子信号[δH6.18(1H，dd，J＝3.2，0.7Hz，H-13a)和6.05(1H，dd，J＝2.8，0.7Hz，H-13b)；5.03(1H，d，J＝1.4Hz，H-14a)和5.02(1H，d，J＝1.4Hz，H-14a)；5.34(1H，br，d，J＝2.2Hz，H-15a)和5.11(1H，br，d，J＝2.2Hz，H-15b)]，一组环内双键信号[δH5.85(1H，d，J＝12.2Hz，H-2)和5.51(1H，d，J＝12.2Hz，H-3)]，以及两个含氧次甲基质子信号[δH3.66(1H，dd，J＝10.4，9.0Hz，H-6)和4.05(1H，dd，J＝8.3，3.0Hz，H-8)]。13C-NMR谱和HSQC谱显示15个碳信号，包括四个亚甲基(三个烯烃碳)，七个次甲基(两个含氧碳，两个烯烃碳)以及四个季碳(一个酯羰基碳，三个烯烃碳)。结合高分辨质谱以及核磁数据可以推测出该化合物可能为一个倍半萜类化合物。进一步的文献查阅可以发现，该化合物和2α,8α-dihydroxy-1αH,5αH,6βH,7αH-guai-4(15),10(14),11(13)-trien-6,12-olide具有相似的结构。比较两者的数据可以发现，新化合物和已知化合物的区别在于新化合物中多出了一组环内双键信号。进一步的HMBC谱的解析中，H-1与C-2，H-2与C-4以及H-3与C-2的相关性说明多出来的环内双键是位于C-3和C-2位的。NOESY谱中，H-1与H-5，H-5与H-7的相关性说明H-1，H-5和H-7是位于α位的，此外H-8与H-6的相关信号，以及H-7和H-8较大的耦合常数(J＝8.2Hz)说明H-8和H-6是位于β位的。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。该化合物化学式及碳原子编号如下：实施例2：药理作用本实施例采用阻断小鼠双侧颈总动脉10min，再灌注15min，造成小鼠短暂性脑缺血再灌注模型，观察药物改善脑缺血状况和护脑作用的效果。1、材料与方法1.1动物昆明种小鼠，清洁级，雄性，体质量18～22g，河南省实验动物中心提供。1.2试剂与样品呋喃唑酮购自中国药品生物制品检定所。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。华佗再造丸，广州奇星药业有限公司；氯化钠注射液，郑州化学药业有限公司；水合氯醛，上海山浦化工有限公司；ATP酶检测试剂盒、乳酸(LD)检测试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津市福晨化学试剂厂。1.3仪器UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司。1.4小鼠分组及模型制备取小鼠60只，随机取10只作为空白对照组，其余小鼠随机分均分为5组，采用阻断小鼠双侧颈总动脉10min，再灌注15min，造短暂性脑缺血再灌注模型。造模型5组分为模型对照组、阳性对照组(华佗再造丸2.67g/kg，用0.5％CMC-Na配成0.134g/mL的混悬液)、呋喃唑酮组(80mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)组(80mg·kg-1)、呋喃唑酮与化合物(Ⅰ)组合物组【40mg·kg-1呋喃唑酮+40mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。给药组给药容积为20mL/kg，灌胃给药，每天给药1次，连续10d。模型对照组和空白对照组均灌胃给药0.5％CMC-Na，给药容积为20mL/kg，每天给药1次，连续10d。1.5凝血时间和脑匀浆中LD含量的测定于第10天给药后1h(禁食不禁水12h)，造模小鼠以4％水合氯醛10mL/kg腹腔注射麻醉(翻正反射消失)，酒精消毒颈部，用手术刀作颈部正中切口，分离周围肌肉，见到双侧颈总动脉(CCA)，再用弯头小镊子剥离周围神经，分离CCA，微动脉夹夹闭CCA阻断血管血流，10min后取下微动脉夹，再灌注15min，造成小鼠短暂性脑缺血再灌注模型；空白组仅作假手术处理，只分离CCA，不阻断血流。再灌注15min后立即断头，用毛细血管法测定凝血时间。1.6小鼠脑匀浆ATP酶活力的测定再灌注15min后立即断头，立即在冰盘中分离脑，矢状切取，用滤纸吸干净附着的血液，称重，以脑组织(g)∶生理盐水(mL)＝1∶9的比例在盛有冰块的玻璃匀浆机中匀浆，制备10％脑匀浆，低温离心机3000r/min离心20min，取上清液于-20℃以下低温保存，测定Na+-K+-ATPase的活力(单位为μmoL·mg-1·h-1)。1.7统计学方法用SPSS13.0forwindows统计软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析，然后用LSD检验进行两两比较。等级资料用Ridit分析。2、实验结果2.1对短暂性脑缺血再灌注模型小鼠凝血时间和脑匀浆中LD含量的影响与空白对照组比，模型对照组凝血时间显著缩短(P<0.01)，脑匀浆LD含量升高(P<0.05)；与模型对照组比，呋喃唑酮与化合物(Ⅰ)组合物组和阳性对照组凝血时间显著延长(P<0.01)、脑匀浆LD含量显著降低(P<0.01)；与模型对照组比，呋喃唑酮组、化合物(Ⅰ)组凝血时间延长(P<0.05)，脑匀浆LD含量降低(P<0.05)。结果见表1。2.2对短暂性脑缺血再灌注模型小鼠脑匀浆ATP酶活力的影响与空白对照组比，模型对照组小鼠脑匀浆中Na+-K+-ATPase活力显著降低(P<0.01)，说明脑细胞能量代谢障碍；与模型对照组比，呋喃唑酮与化合物(Ⅰ)组合物组和阳性对照组小鼠脑匀浆中Na+-K+-ATPase活力显著升高(P<0.01)；与模型对照组比，呋喃唑酮组、化合物(Ⅰ)组小鼠脑匀浆中Na+-K+-ATPase活力升高(P<0.05)。结果见表1。表1对短暂性脑缺血再灌注模型小鼠凝血时间和脑匀浆中LD含量、ATP酶活力的影响组别凝血时间/sLD/mmoL·g-1Na+-K+-ATPase空白对照组341±451.394±0.2436.454±1.283模型对照组198±321.688±0.3224.316±1.357阳性对照组263±461.189±0.5137.845±1.432呋喃唑酮组235±431.236±0.5125.648±1.065化合物(Ⅰ)组232±371.245±0.4366.198±1.628呋喃唑酮与化合物(Ⅰ)组合物组268±241.072±0.4287.939±1.523缺血性脑血管病是危害人类生命与健康的常见病，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，是由于脑部供血障碍引起脑组织相应区域缺血、低氧，造成脑组织损害所出现的一系列生化代谢失常、生理功能丧失、病理形态改变等，是一种在脑组织上受到多层次、多方面损害的疾病。临床表现主要是脑组织缺血，进而导致脑髓神经受损，出现半身不遂、言语謇涩或不语、口舌歪斜、偏身麻木等临床症状，甚至出现神志障碍。当脑缺血发生时，脑组织供血不足，能量合成物质供应缺乏，首先发生能量代谢障碍，糖无氧代谢产生LD增多，ATP耗竭，红细胞膜ATP酶活性下降，凝血活性增强，可导致微血管闭塞，血流阻力增大，继而造成脑部微循环障碍，加重脑组织缺血缺氧。上述结果表明，呋喃唑酮、化合物(Ⅰ)、呋喃唑酮与化合物(Ⅰ)组合物均具有开发成治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物的潜力。化合物(Ⅰ)单独的作用时，可以降低短暂脑缺血再灌注引起的损伤；化合物(Ⅰ)配以呋喃唑酮联合作用时，开发成治疗短暂脑缺血再灌注损伤的药物效果优于化合物(Ⅰ)单独作用。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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