一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒与流程

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒。

背景技术：

近年来，随着qPCR、RNA-seq等新兴分子生物学研究技术的不断发展，在RNA水平对生命事件进行更为深入的研究已逐渐成为生命科学领域的焦点。微小RNA(MicroRNAs、miRNAs)是一类长度在17～25个碱基的小分子非编码RNA，通过与靶基因转录本的互补结合，对靶基因的表达起负调节作用，或称为基因沉默。这种基因沉默效应在信号转导、干细胞发育、肿瘤发生发展、感染与免疫等多种生理、病理过程中发挥重要作用。研究表明，miRNA基因占预测基因总数的3％～5％，调控大约20％--30％的蛋白编码基因。miRNA成熟序列在不同物种中高度保守，在不同生物个体中的表达组织和时相也具有一定的保守性。

近年来大量研究表明，微小RNA的表达水平与多种肿瘤发生密切相关。微小RNA既可以作为抑癌基因下调原癌基因活性，也可以作为癌基因下调抑癌基因活性。此外，许多研究报道微小RNA与其他疾病的发生发展具有密切联系，包括调节胰岛素分泌功能、影响神经元生成等。多种中枢神经系统疾病证明了微小RNA的病理生理作用，这些疾病包括脆性X染色体综合征、Rett综合征、唐氏综合征、孤独症、阿尔茨海默病、神经退行性疾病等。因而寻找疾病特异性miRNAs是未来分子诊断学发展的一个新方向。

循环系统中的miRNAs广泛存在且非常稳定，随着疾病发生发展，循环miRNAs表达谱也会发生特异性改变，因此有可能成为疾病诊断、预后判断及疗效评价的新型生物标志物。目前，血浆微小RNA作为其中一种重要的途径已被广泛的应用于各类疾病的研究当中。然而，血浆miRNA的提取方法主要是采用国外进口试剂盒，但试剂盒提取血浆miRNA的具有价格昂贵、提取量少等缺点，提取的RNA总量往往不能满足后续实验要求。

技术实现要素：

本申请主要解决的技术问题是提供一种从血浆中提取微小RNA的方法及其试剂盒，能够满足下游微小RNA(miRNA)芯片表达谱和其他分子生物学各项试验的质量要求。

为解决上述技术问题，本发明实施例采用的一个技术方案是：提供一种从血浆中提取微小RNA的方法，包括如下步骤：

步骤1：在血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液进行蛋白降解，得到第一混合液；

步骤2：在第一混合液中加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震荡混合，并进行低温离心分离，所得上层液体为第二混合液；

步骤3：在第二混合液中加入沉淀剂和助沉剂进行RNA沉淀，得到沉淀混合物，将沉淀混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第一沉淀；

步骤4：将第一沉淀用洗涤液进行洗涤，得到洗涤混合物，将洗涤混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第二沉淀，将第二沉淀用RNase-free的水进行溶解，所得溶液即为含有微小RNA的提取样品。

可选地，在步骤1中，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

可选地，在步骤2中，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，低温离心温度为2～6℃。

可选地，在步骤3中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为糖原，低温离心温度为2～6℃。

可选地，在步骤4中，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇溶液，低温离心温度为2～6℃。

可选地，在步骤1中，所述血浆样品与裂解液的体积比为1：1；在步骤2中，所述RNA抽提试剂与第一混合液的体积比为2：1，所述氯仿与所述抽提混合物的体积比为1：5；在步骤3中，所述沉淀剂与第二混合液的体积比为1：1。

可选地，在步骤1之前还包括由血液制备血浆的步骤。

为解决上述技术问题，本发明实施例采用的另一个技术方案是：提供一种从血浆中提取微小RNA的试剂盒，包括裂解液、去蛋白液、RNA抽提试剂、沉淀剂、助沉剂和洗涤液，其中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为15mg/ml的糖原溶液。

可选地，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇溶液。

可选地，还包括氯仿和RNase-free的水。

本申请实施例的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明实施例的提取方法首先进行样品裂解和去蛋白，再进行RNA的抽提，使的与微小RNA结合的蛋白变性释放出游离的微小RNA并保持微小RNA的完整性；本发明实施例的试剂盒中，裂解液和去蛋白试液同时使用有助于充分降解与微小RNA结合的蛋白，沉淀剂异丙醇以及助沉剂糖原同时使用极大地提高了微小RNA回收效率。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动。

图1是本发明实施例3与比较例提取RNA总量的比较图。

图2是本发明实施例3与比较例提取外参cel-miR-39效率的比较图。

图3是本发明实施例与比较例miRNA芯片扫描结果的组内比较图。

图4是本发明实施例与比较例miRNA芯片扫描结果的组间比较图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本发明实施例为了满足下游微小RNA芯片表达谱和其他分子生物学各项试验的质量要求，提供一种从血浆中提取微小RNA的方法包括如下步骤：

步骤1：在血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液进行蛋白降解，得到第一混合液；

步骤2：在第一混合液中加入RNA抽提试剂进行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震荡混合，并进行低温离心分离，所得上层液体为第二混合液；

步骤3：在第二混合液中加入沉淀剂和助沉剂进行RNA沉淀，得到沉淀混合物，将沉淀混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第一沉淀；

步骤4：将第一沉淀用洗涤液进行洗涤，得到洗涤混合物，将洗涤混合物进行低温离心分离，所得沉淀物为第二沉淀，将第二沉淀用RNase-free的水进行溶解，所得溶液即为含有微小RNA的提取样品。

在一些可选实施方式中，在步骤1中，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液。在步骤2中，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，低温离心温度为2～6℃。在步骤3中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为糖原，低温离心温度为2～6℃。在步骤4中，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇溶液，低温离心温度为2～6℃。在步骤1中，所述血浆样品与裂解液的体积比为1：1；在步骤2中，所述RNA抽提试剂与第一混合液的体积比为2：1，所述氯仿与所述抽提混合物的体积比为1：5；在步骤3中，所述沉淀剂与第二混合液的体积比为1：1。在步骤1之前还包括由血液制备血浆的步骤。

提取血浆中微小RNA的关键在于消除RNA降解酶(RNase)的污染和解离与微小RNA特异结合的蛋白。本发明实施例的方法在血浆中加入蛋白酶K主要有两个作用，一方面蛋白酶K可以灭活RNase A，另一方面蛋白酶K可以降解蛋白，使的与微小RNA结合的蛋白变性释放出游离的微小RNA，高浓度10％SDS能迅速破坏RNase，保持微小RNA的完整性。

在一些可选实施方式中，步骤1中，将混合液放入75℃水浴5分钟可有效的提升蛋白酶K和SDS去蛋白的协同作用，随后在42℃温浴1小时，目的是让蛋白酶K和SDS与血浆充分反应，彻底降解微小RNA结合蛋白。

血浆中的微小RNA及其微量，除了防止RNase的降解之外，高效获取血浆中的微小RNA的另一个关键步骤是如何充分沉淀提取液中的微小RNA，在一些可选实施方式中，在步骤3中，采用异丙醇沉淀RNA的同时，加入了1μL 15mg/mL糖原。糖原是一种有效的核酸助沉剂，能吸附核酸，极大地提高异丙醇沉淀的RNA回收效率。

在一些可选实施方式中，在步骤3中，将沉淀混合物于-80℃超低温静置，进一步抑制RNase作用的同时可提高RNA沉淀效率。

本发明实施例还提供了一种应用上述方法进行微小RNA提取的试剂盒，包括裂解液、去蛋白液、RNA抽提试剂、沉淀剂、助沉剂和洗涤液，其中，所述沉淀剂为异丙醇，所述助沉剂为15mg/ml的糖原溶液。

在一些可选实施方式中，所述裂解液为质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，所述去蛋白液为20mg/ml的蛋白酶K溶液，所述RNA抽提试剂为Trizol试剂，所述洗涤液为体积百分比为70％～80％的乙醇。在一些可选实施方式中，该试剂盒还包括氯仿和RNase-free的水。

实验材料

实验所用为健康人血浆，保存于-80℃低温冰箱。对照组采用MiRNeasy Serum/Plasma kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany,Cat no.217184)试剂盒，按照标准流程操作。Trizol试剂(Trizol LS，Ambion)，糖原(Ambion)。

实施例1

一种用于提取人血浆中微小RNA的方法，按照以下步骤：

(1)收集人抗凝全血混匀后，500rpm离心10分钟，去除血细胞，得到血浆样本保存于-80℃备用。

(2)取上述血浆样本200μL于1.5mL离心管中，加入200μL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)进行1:1混合，再加入1μL蛋白酶K20mg/ml，75℃加热5分钟；再42℃温浴消化1h。

(3)将处理后的样本加入2倍体积的Trizol试剂，混匀，室温静置5min；加入20％体积氯仿，震荡15秒，静置2分钟；12000rpm、4℃离心15分钟，取上清。

(4)加入等体积异丙醇和1μL 15mg/ml糖原，混匀，-80℃静置过夜。

(5)12000rpm、4℃离心15分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤；12000rpm、4℃，离心5分钟，收集沉淀，室温干燥，加入14μL RNase-free水溶解后，-80℃保存。

(6)用nanodrop 2000分光光度计检测RNA在260nm处的吸光值，并换算成相应浓度。

实施例2

一种用于提取人血浆中微小RNA的方法，按照以下步骤：

(1)收集人抗凝全血混匀后，500rpm离心10分钟，去除血细胞，得到血浆样本保存于-80℃备用。

(2)取上述血浆样本200μL于1.5mL离心管中，加入200μL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)，同时加入1μL蛋白酶K 20mg/ml，震荡混匀，75℃加热5分钟，42℃温浴1小时。

(3)将处理后的样本加入2倍体积的Trizol试剂，混匀，室温静置5min；加入20％体积氯仿，震荡15秒，静置2分钟；12000rpm、4℃离心15分钟，取上清。

(4)加入等体积异丙醇和1μL 15mg/ml糖原，混匀，-80℃静置过夜(8～12小时)。

(5)12000rpm、4℃离心15分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤；12000rpm、4℃，离心5分钟，收集沉淀，室温干燥，加入14μL RNase-free水溶解后，-80℃保存。

(6)用nanodrop 2000分光光度计检测RNA在260nm处的吸光值，并换算成相应浓度。

实施例3

一种用于提取人血浆中微小RNA的方法，按照以下步骤：

(1)采集人血浆200μL，加入1μL蛋白酶K 20mg/ml和等体积10％SDS，震荡混匀。

(2)75℃加热5分钟，42℃温浴1小时。

(3)加入2倍体积Trisol试剂，1/5倍体积氯仿，震荡混匀，静置15分钟。

(4)4℃,12000rpm离心15分钟，取上清，加入等体积异丙醇和1μL 15mg/ml糖原。

(5)-80℃静置过夜，4℃，12000rpm离心10分钟。

(6)收集沉淀，用75％的乙醇洗涤，4℃，12000rpm离心5分钟。

(7)收集沉淀，室温干燥，加入14μL RNase-free水溶解后，-80℃保存。

比较例

采用QIAGEN公司的MiRNeasy Serum/Plasma kit的试剂盒(Cat no.217184)，取血浆样本200μL，严格按试剂盒说明操作，提取微小RNA后-80℃保存。

RNA浓度检测

采用nanodrop 2000分光光度计检测RNA在260nm处的吸光值，并换算成相应浓度。

加标回收实验

在提取过程中加入了3.5μL cel-miR-39(1.6×108copies/μL)，采用荧光定量PCR技术检测cel-miR-39的Cq值。通过一系列梯度稀释cel-miR-39标准品的荧光定量PCR的Cq值，绘制相应的标准曲线，测算加标回收率。

制备cel-miR-39浓度和Cq值的标准曲线

1)在冰上制备反转录体系：在PCR反应管中依次加入2.2μL 1.0×108copies/μL的标准品，2μL RNA样本(～100ng)，4μL 5×mi Script Buffer，2μL 10×miScript Nucleics Mix，7.8μL RNase-free water，2μL miScript Reverse Transcriptase Mix。2)混合后简单离心，置于冰上。3)37℃水浴60分钟，95℃热激5分钟，然后置于冰上。4)加入200μL去RNase水稀释反转录产物。5)将稀释的反转录产物按梯度配成5.0×105copies/μL，5.0×104copies/μL，5.0×103copies/μL，5.0×102copies/μL浓度的cel-miR-39 cDNA稀释液。6)荧光定量PCR：各取上述稀释液2μL cel-miR-39 cDNA进行荧光定量PCR反应。反应体系：12.5μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，2.5μL 10×miScript Universal Primer，2.5μL 10×Cel-miR-39miScript Primer Assay，5.5μL RNase-free water，2μL cel-miR-39 cDNA。反应流程：先95℃热激15分钟。然后94℃，15秒；55℃，30秒；70℃，34秒；(40个循环)。测得各浓度cel-miR-39的Cq值，绘制浓度和Cq值的相关标准曲线。

检测cel-miR-39的加标回收率

1)在冰上制备反转录体系：在PCR反应管中依次加入2.2μL 1.0×108copies/μL的标准品，2μL RNA样本(～100ng)，4μL 5×miScript Buffer，2μL 10×miScript Nucleics Mix，7.8μL RNase-free water，2μL miScript Reverse Transcriptase Mix。2)混合后简单离心，置于冰上。3)37℃水浴60分钟，95℃热激5分钟，然后置于冰上。4)加入200μL去RNase水稀释反转录产物。5)荧光定量PCR：反应体系：12.5μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，2.5μL 10×miScript Universal Primer，2.5μL 10×Cel-miR-39 miScript Primer Assay，5.5μL RNase-free water，2μL上述反转录稀释产物。反应流程：先95℃热激15分钟。然后94℃，15秒；55℃，30秒；70℃，34秒；(40个循环)。检测加标cel-miR-39的Cq值，对照标准曲线计算出加标回收率。

miRNA芯片分析

1)荧光标记与ELISA质控：用FlashTag Biotin HSR试剂盒对样品总RNA中小分子量RNA进行加尾和生物素标记。标记完成后，吸取2μL标记完成的样本做ELISA质控(参考试剂盒说明)，样品孔显示蓝色，Biotin标记成功，加100μL终止液，溶液变黄，酶标仪检测吸光值，样本在450nm的吸光度比阴性对照多0.1以上，证明合格。2)miRNA芯片检测及信号分析：将标记好的样品与miRNA 4.0芯片(Affymetrix)杂交、洗染，将洗染后的芯片置于GCS3000型芯片扫描仪(Affymetrix)扫描。将扫描芯片得到的原始数据导入Expression Console软件中(Affymetrix)，扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后将数据归一化，进行组内和组间比较。

实验结果

RNA定量检测结果

本发明实施例采用nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)检测RNA在260nm处的吸光值，并换算成相应浓度。结果显示实施例3所提取的RNA总量是比较例的19.1倍(P＜0.01)，实施例3明显高于比较例，请参阅图1所示，其中，*P＜0.01。

Cel-miR-39外参回收率

本发明实施例的方法在提取过程中加入了3.5μL cel-miR-39(1.6×108copies/μL)，采用荧光定量PCR技术检测加标回收率。结果显示实施例3得到的加标回收率使比较例的13.9倍(P＜0.01)，请参阅图2所示。

miRNA芯片扫描结果

1)组内比较：如图3所示，A、B、C三图表示采用试剂盒(MiRNeasy Serum/Plasma kit,QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)提取(比较例)的血浆miRNA的芯片信号结果，D、E、F表示采用本发明实施例方法提取(实施例1、实施例2、实施例3)的血浆miRNA的芯片信号结果，坐标中对应的数字均为芯片信号值的log2对数值。对二维点阵图做线性回归，比较例斜率分别为0.9110，08731，0.8991；平均值为0.8944；实施例3斜率分别为0.7950，0.9011，0.9554；平均值为0.8838。两组斜率的均值比较接近，提示实施例和比较例的实验重现性相当(斜率越接近1.0，实验重现性越好)。

2)组间比较：如图4所示，取在实施例和比较例的平均信号值的log2对数值进行比较，从图中可以看出比较例和实施例回归显示有相关性，R2＝0.613,提示两组之间的实验结果具有相关性。

以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。