一种EYFP基因标记根瘤菌的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种EYFP基因标记根瘤菌的方法。

背景技术：

在荧光蛋白基因的实验过程中，通常将荧光蛋白基因与载体连接后导入受体菌中，由于慢生型大豆根瘤菌需要导入基因组中才可以表达，采用常规的方法很难使其有效表达，最终导致实验失败。

技术实现要素：

为了解决EYFP基因导入慢生型大豆根瘤菌的技术问题，本发明提供了一种EYFP基因标记根瘤菌的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种EYFP基因标记根瘤菌的方法，包括以下步骤：

一、将EYFP-pUC19载体酶切纯化后获得EYFP产物；

二、将EYFP产物与载体pBBR1MCS-2相连，酶切验证，将构建的EYFP-pBBR1MCS-2转入E.coli DH5α中；

三、将供体菌EYFP-pBBR1MCS-2、辅助菌pRK2013、受体菌慢生型大豆根瘤菌三亲本杂交；

四、同源重组：通过在Km^R的平板上生长，筛选重组子；

五、PCR验证，确定筛选的重组子已经插入到慢生型大豆根瘤菌的基因组中，而基因组中不含有野生株；

六、显微镜下观察EYFP蛋白基因表达。

本发明采用同源重组的方法，将EYFP与载体pBBR1MCS-2连接，通过Km^R抗性筛选重组子后，采用PCR法筛选突变株，确保插入染色中，使其稳定表达。

附图说明

图1是基因组DNA提取结果，M：DNA Marker DL10000，1:HW-05基因组DNA；

图2是酶切纯化后获得获得EYFP产物，M：DNA Marker DL10000，1：EYFP基因酶切纯化产物；

图3是EYFP-pBBR1MCS-2转化后提取结果，M：DNA Marker DL10000，1:EYFP-pBBR1MCS-2连接后转化提取结果；

图4是克隆酶切鉴定结果，M：DNA Marker DL10000，1:克隆HindⅢ和BamHⅠ双酶切产物；

图5是重组子筛选，M：DNA Marker DL10000，1:EYFP片段PCR扩增产物。

图6是EYFP基因在HW-05中表达。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

以慢生型大豆根瘤菌HW-05为例，本发明提供的EYFP基因标记根瘤菌的方法如下：

一、试验方法

1、HW-05的分离

选取个大且饱满的根瘤，用剪刀将其剪下(带部分根)，将根瘤放在清水中浸泡4～5min，洗去杂质，再用95％乙醇浸泡5min后用0.1％的HgCl₂表面灭菌5min，然后用无菌水冲洗10次。在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在YMA培养基上划线，在28℃的温箱中培养3～5d后，挑取少许菌体观察其形态、大小、透明度、粘稠度、颜色、光泽等特征与标准菌对比，将获得的菌体挑入培养基斜面上，继续培养观察，如果菌落无异常，再划线稀释反复分离，直到纯化为止。

2、酶切纯化后获得EYFP产物；

将西班牙塞维利亚大学赠予的EYFP-pUC19载体，采用限制性内切酶HindⅢ和BamHI进行双酶切，胶回收获得EYFP产物。

双酶切体系(20μl)见表1：

表1

3、纯化产物与pBBR1MCS-2连接

将纯化的EYFP产物与载体pBBR1MCS-2在16℃连接过夜，反应体系如表2：

表2

4、酶切鉴定

限制性内切酶鉴定提取的质粒。根据pBBR1MCS-2载体酶切图谱，选用HindⅢ和BamHI双酶切筛选阳性重组质粒，反应条件为37℃水浴4h。反应结束后分别取3μL酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，观察酶切结果，确定是否有外源片段以及插入片段大小是否正确，从而初步判断是否为重组克隆。

双酶切体系(20μl)见表1。

5、EYFP基因转入HW-05重组子筛选

通过同源重组，通过Km^R筛选后进行PCR检测阳性克隆，在20μLPCR反应体系中，以1μL质粒DNA(经20倍稀释)为模板，加入相应的PCR反应成分，进行PCR扩增，电泳检测是否扩出特异性条带，以确定重组子。

PCR体系(20μl)见表3：

表3

扩增反应参数见下表4：

表4

二、实验结果

1、HW-05总DNA提取

总DNA提取结果，根据总DNA提取方法获得基因组DNA，结果见图1。

2、酶切纯化后获得EYFP产物；

选用HindⅢ和BamHⅠ酶切质粒EYFP-pBBR1MCS-2，出现两个条带分别约为700bp和2.7kb，结果见图2。

3、EYFP基因连接于pBBR1MCS-2载体及鉴定

选择EYFP基因和pBBR1MCS-2载体共有的HindⅢ和BamHⅠ两种内切酶，进行酶切连接后转化，提取质粒，在约为6kb出现条带，结果见图3。

选用HindⅢ和BamHⅠ酶切进行验证，出现两个条带分别约为700bp和5kb，结果见图4。

4、EYFP转入pBBR1MCS-2重组子筛选

将EYFP基因经三亲本杂交转入HW-05后，PCR扩增EYFP基因，条带约为700bp的为重组子，结果见图5。

5、EYFP基因在HW-05中表达

显微镜下观察，看到EYFP荧光出现，结果见图6。