提取动物基因组DNA的方法与流程

本发明涉及生命科学技术领域，尤其是一种提取动物基因组DNA的方法。

背景技术：

众所周知，基因组DNA是最基本的遗传物质，是生物个体遗传信息的载体，在分子生物学、分子遗传学试验中，获取、使用高质量的基因组DNA是试验成功的基础。

自上世纪50年代，Watson和Crick成功构建DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。目前，随着分子生物技术的高速发展，研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，为此针对不同来源的DNA建立了不同的提取纯化方法。最为经典的苯酚-氯仿法虽然能获得很高质量的基因组DNA，能够满足各种分子试验的实验要求，但其操作繁琐，用时较长(3天)；玻璃棒缠绕法虽然操作简单，但实验要求较高，需要的时间也长(1天)；近年来，不少生物试剂公司研发了不少针对不同样品基因组DNA提取的试剂盒，这些试剂盒操作简单快捷，能在较短的时间内(1小时左右)获取基因组DNA，但样品质量不佳用试剂盒提取很难达到理想状态，且费用较高，一个样品约花费6元左右。因此，寻找一种高效、经济的DNA提取方法显得尤为必要。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种提取动物基因组DNA的方法，它无需纯化，所得DNA可直接用于分子试验，显著降低了DNA提取成本。

本发明是这样实现的：提取动物基因组DNA的方法，包括如下步骤：

1)样品采集：采集动物肌肉组织或毛囊，并放置在质量百分比为70％的酒精中，在-20℃进行保存；

2)细胞裂解液配制：细胞裂解液中，按浓度为3.770g/LEDTA-Na₂、1.5764g/L Tris-HCl、0.5844g/L氯化钠、2.884g/L十二烷基硫酸钠，以ddH₂O为溶剂进行配置，配置的溶液充分溶解后，在37℃孵育5min；

3)DNA萃取液配制：称取0.6041g的氯化锂溶于950mL的ddH₂O中充分溶解，然后定容至1000mL；

4)DNA提取：

a)取肌肉组织放置于的离心管中，并用充分剪碎；若是毛囊则取5-8根带毛囊的毛发，用剪去毛干部分，将毛囊置于离心管中；

b)向离心管中加入细胞裂解液，轻轻晃荡使组织样品完全浸泡在裂解液中；

c)再向离心管中加入蛋白酶K，充分吹打后，振荡18-22s，在4000-5000rpm下离心3-5s；

d)之后将离心管在20-60℃水浴10-15min；

e)向离心管中加入氯化锂，振荡10-15s，在4000-5000rpm离心下8-10s，立即冰浴10-15min；

f)在转速为13000-14000rpm离心10-15min，将上清液转移至洁净的离心管中，弃沉淀；

g)向上清液中加入预先冷冻过的无水乙醇，轻轻上下颠倒摇晃，室温静置10-15min沉淀DNA。

h)在转速为13000-14000rpm离心10-15min，弃上清，用相同体积的质量百分比为70％或75％乙醇洗涤一次；重复上述步骤；

i)弃上清，在滤纸上倒置离心管20min，使管内液体与酒精完全去除；或直接置于40-45℃烘箱烘干10min；

j)加入TE或ddH₂O溶解DNA，完成DNA的提取。

所述的预先冷冻过的无水乙醇是将无水乙醇在-20℃下放置30min以上。

所述的细胞裂解液现配现用。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明适用于任何动物，其提取效率高效、方便快捷、经济省时，尤其对于不易获得组织肉样、血液的动物，或为了减小动物应激，保护珍惜物种等。本发明成本低廉，一个样品仅需花费0.5元，且提取时间短，单个样品的提取时间为90分钟。

附图说明

附图1为本发明的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图；

附图2为本发明的PCR扩增凝胶电泳检测图。

具体实施方式

本发明的实施例1：提取动物基因组DNA的方法，包括如下步骤：

1、实验样品采集

采取新鲜肌肉组织(高坡猪)于70％酒精中，由冰盒带回实验室置于-20℃冰箱保存。

2、细胞裂解液配制

细胞裂解液配制(现配现用)：配置1000mL细胞裂解液，分别称取3.770g的EDTA-Na₂、1.5764g的Tris-HCl、0.5844g的NaC(氯化钠)l、2.884g的SDS(十二烷基硫酸钠)溶于950mL的ddH₂O中充分溶解，然后定容至1000mL，37℃孵育5min。

3、DNA萃取液配制

称取0.6041g的LiCl(氯化锂)溶于950mL的ddH₂O中充分溶解，然后定容至1000mL。

4、DNA提取操作步骤

①取10-30mg肌肉组织于1.5mL的离心管中，用眼科剪充分剪碎。

②向离心管中加入200μL的细胞裂解液，轻轻晃荡使组织样品完全浸泡在裂解液中。

③向离心管中加入20μL的蛋白酶K，用枪头充分吹打，旋涡振荡器振荡20s，简短离心(4000-5000rpm离心5s)。

④55℃水浴10min。

⑤向离心管中加入100μL的LiCl，旋涡振荡器振荡10s，简短离心(4000-5000rpm离心10s)，立即冰浴10min。

⑥13400rpm离心10min，将上清液转移至洁净的离心管中，弃沉淀。

⑥向上清液中加入400μL预先冷冻过的无水乙醇(在-20℃冰箱放置30min以上即可)，轻轻上下颠倒摇晃，室温静置10min沉淀DNA。

⑦13400rpm离心10min，弃上清，用相同体积(400μL)70％或75％乙醇洗涤一次。

⑧重复第7步。

⑨弃上清，此时可能会有白色沉淀，若看不到也不影响后续实验，在滤纸上倒置离心管20min，使管内液体与酒精完全去除；或直接置于42℃烘箱烘干10min。

⑩加入30-50μL的TE溶解DNA。

1.0％琼脂糖凝胶检测DNA(图1)。

本发明的实施例2：提取动物基因组DNA的方法，包括如下步骤：

1、实验样品采集

采取带毛囊的毛发(高坡猪)于70％酒精中，由冰盒带回实验室置于-20℃冰箱保存。

2、细胞裂解液配制

细胞裂解液配制(现配现用)：配置1000mL细胞裂解液，分别称取3.770g的EDTA-Na₂、1.5764g的Tris-HCl、0.5844g的NaC(氯化钠)l、2.884g的SDS(十二烷基硫酸钠)溶于950mL的ddH₂O中充分溶解，然后定容至1000mL，37℃孵育5min。

3、DNA萃取液配制

称取0.6041g的LiCl(氯化锂)溶于950mL的ddH₂O中充分溶解，然后定容至1000mL。

4、DNA提取操作步骤

①取5-8根毛发(带毛囊)，用剪刀剪去毛干部分，将毛囊置于1.5mL的离心管中。

②向离心管中加入200μL的细胞裂解液，轻轻晃荡使组织样品完全浸泡在裂解液中。

③向离心管中加入20μL的蛋白酶K，用枪头充分吹打，旋涡振荡器振荡20s，简短离心(4000-5000rpm离心5s)。

④55℃水浴10min。

⑤向离心管中加入100μL的LiCl，旋涡振荡器振荡10s，简短离心(4000-5000rpm离心10s)，立即冰浴10min。

⑥13400rpm离心10min，将上清液转移至洁净的离心管中，弃沉淀。

⑥向上清液中加入400μL预先冷冻过的无水乙醇(在-20℃冰箱放置30min以上即可)，轻轻上下颠倒摇晃，室温静置10min沉淀DNA。

⑦13400rpm离心10min，弃上清，用相同体积(400μL)70％或75％乙醇洗涤一次。

⑧重复第7步。

⑨弃上清，此时可能会有白色沉淀，若看不到也不影响后续实验，在滤纸上倒置离心管20min，使管内液体与酒精完全去除；或直接置于42℃烘箱烘干10min。

⑩加入30-50μL的ddH₂O溶解DNA。

直接上样进行PCR，最后用琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。