一种快速提取细菌基因组DNA的方法与流程

本发明属于微生物样品前处理领域，具体涉及一种用于现场快速提取样品细菌基因组DNA的方法，主要是利用高压放电产生等离子体直接与无菌水混合，生成等离子体活化水，通过与包括空气、水体以及人体样品等混合，快速提取样品DNA，与当前基因检测方法结合后可以快速完成细菌检测。

背景技术：

随着生物化学与分子生物学技术的进步，核酸在微生物领域的应用日益广泛，核酸检测技术发展迅速。例如，环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LMAP)等快速检测技术出现，样本检测时间大大缩短，检测限降低。这对样本的前处理提出了新的要求，低成本、耗时短、操作简便的核酸提取方法逐渐成为研究热点。

目前，细菌基因组DNA提取方法有专用DNA提取试剂盒法、碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法及其他破壁方法(超声破碎、研磨破碎、反复冻融等)。碱裂解法具有简捷、纯度高等优点，是目前应用最广泛的细菌基因组DNA的常规提取方法之一，但该方法提取时间较长，通常需要两小时以上，且具有一定的腐蚀性；应用专用DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，效果好，但成本较高，临床应用受到限制；煮沸法时间短，操作简单，收率较低，其最大的缺陷是对提取革兰氏阳性菌基因组DNA的效果不佳；SDS裂解法及其他裂解方法需要复杂的裂解体系，不仅配制麻烦，而且部分药品有毒，操作危险性大，此外部分药品及相关酶试剂价格昂贵，因此在应用上受到一定的限制。

本发明采用大气压等离子体射流喷枪制备的低温等离子体活化水(Plasma Activated Water，PAW)，该种经过处理的水具有强氧化性，在与细菌菌液混合反应后，可通过物理方法实现对细胞的裂解，提取细菌基因组DNA，具有简便、快速、材料易获得等特点，可大大缩短核酸样本提取的时间，显著降低DNA提取的费用以及对特定设备的依赖。目前国内外还没有采取这种方法提取细菌基因组DNA。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速提取细菌基因组DNA的方法，该方法可用于裂解细胞壁，将核酸从细胞中释放出来，所得核酸样品可用于分子生物学检测，例如环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)等方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种快速提取细菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)制备低温等离子体活化水(PAW)；

2)将步骤1)制备的活化水与菌液混合，震荡反应一定时间，即可实现细胞壁的裂解和DNA的提取。

上述步骤1)优选采用大气压等离子体(atmospheric pressure cold plasma)射流喷枪制备低温等离子体活化水。其中，以高频高压交流电作为大气压低温等离子体射流喷枪的激发电源，优选电源输入电压为50～100V，电流实时调整，一般在0.2～0.5A。载气优选使用5％V/V氧气和95％V/V氩气或氮气的混合气体，生成的低温等离子体从喷枪喷嘴喷出。将喷嘴置于无菌水液面上方(距离液面2cm左右)，激发低温等离子体与水反应，当水的pH至3～5之间，氧化还原电位(OPR)值在400～500mV之间，即为制备完成，通常控制反应时间在10～30min，生成低温等离子体活化水(PAW)，震荡混匀后用于后续实验。

上述步骤2)中，优选PAW与菌液按体积1∶1混合，震荡反应5～20min。

使用低温等离子体处理过的水具有强氧化性，且具有pH值低、氧化还原电位(ORP)值高，以及能长期贮存NO₂^-、NO₃^-与H₂O₂等特点。本发明利用低温等离子体活化水与细菌菌液反应，直接裂解细胞壁，释放出细菌基因组DNA。本发明方法简单易行，成本低，时间短，可现场快速提取样品中细菌基因组DNA，用于分子生物学检测。

附图说明

图1：实施例1等离子体活化水提取铜绿假单胞菌DNA后LAMP检测结果比较图。

图2：实施例2等离子体活化水提取肺炎链球菌DNA后LAMP检测结果比较图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，本领域技术人员应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：等离子体活化水用于提取革兰氏阴性菌-铜绿假单胞菌DNA

(1)制备等离子体活化水：大气压低温等离子体射流喷枪的激发电源输入电压50V，电流0.20A，载气使用氩气(含5％V/V氧气)，流速5L/min，将喷嘴置于50mL无菌水液面上2cm，激发低温等离子体与水反应，反应时间为30min，生成低温等离子体活化水(PAW)，震荡混匀10s。

(2)制备铜绿假单胞菌菌液：使用LB培养基在37℃下培养24小时。菌落长出后，用20mL无菌水将其从培养基表面刮下来，置于50mL离心管中，7000rpm下离心7min，弃上清液后加入20mL无菌水，震荡混匀；重复上述步骤两次，最后加入20mL无菌水后混匀得到待处理菌液。

(3)梯度处理：将原菌液稀释，得到10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5浓度的菌液。

(4)将上述6个浓度梯度的菌液分别按体积1∶1与PAW混合，震荡反应20min。

(5)同时使用天根细菌基因组提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京)提取步骤(3)所得梯度菌液，作为对照。

(6)将上述反应液使用环介导等温扩增(LAMP)的方法进行扩增，反应体系为25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH₂O补齐体积。将混合体系至于浊度仪(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反应60min，最后80℃加热处理2min。

结果如图1所示，高浓度时，使用PAW处理G^-细菌(铜绿假单胞菌)得到的DNA样本，LAMP反应的检测时间小于传统的吸附柱法，表明该方法提取的DNA浓度较高，菌液浓度稍低时，使用PAW方法处理细菌的效率略低于试剂盒方法。

实施例2：等离子体活化水用于提取革兰氏阳性菌-肺炎链球菌DNA

(1)制备等离子体活化水：大气压低温等离子体射流喷枪的激发电源输入电压50V，电流0.20A，载气使用氩气(含5％V/V氧气)，流速5L/min，将喷嘴置于50mL无菌水液面上2cm，激发低温等离子体与水反应，反应时间为30min，生成低温等离子体活化水(PAW)，震荡混匀10s。

(2)制备肺炎链球菌菌液：使用LB培养基在37℃下培养24小时。菌落长出后，用20mL无菌水将其从培养基表面刮下来，置于50mL离心管中，7000rpm下离心7min，弃上清液后加入20mL无菌水，震荡混匀；重复上述步骤两次，最后加入20mL无菌水后混匀得到待处理菌液。

(3)梯度稀释处理：将原菌液梯度稀释，分别得到1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5浓度的菌液。

(4)将上述6个浓度梯度的菌液分别按体积1∶1与PAW混合，震荡反应20min。

(5)同时使用天根细菌基因组提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京)提取步骤(3)所得梯度菌液，作为对照。

(6)将上述反应液使用环介导等温扩增(LAMP)的方法进行扩增，反应体系为25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH₂O补齐体积。将混合体系至于浊度仪(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反应60min，最后80℃加热处理2min。

结果如图2所示，本发明提供的细菌基因组DNA的方法，与标准的吸附柱法提取方法相比，材料简单易得，成本低，反应时间短，并且对LAMP检测没有影响，可以广泛应用于提取细菌基因组DNA。