高稳定性的人源化抗人CD3单链抗体及其制法和应用的制作方法

本发明涉及生物技术和医学领域，更具体地涉及氨基酸残基突变的、高稳定性的人源化抗人cd3单链抗体。本发明还涉及所述单链抗体的制法和用途。
背景技术：
：抗体作为重要的生物大分子，在分子生物学，生物化学以及医学检验领域得以广泛应用，其在治疗各种恶性肿瘤方面有着非常重要的作用。自二十世纪七十年代中期杂交瘤技术诞生(kohler&milstein等，(1975)，自然(nature)256(5517):495-497)到1986年第一个单抗正式用于临床治疗(jaffers等，(1986)，(transplantation)41(5):572-578)，再到2013年herceptin与化疗药物emtansine偶联的首个adc单抗，以及新近获批的治疗黑色素瘤单抗nivolumab，已经有41个治疗性抗体药物通过fda批准上市，同时有超过300种抗体产品正处于临床试验阶段，每年创造超过千亿的销售额(leavy等，(2010)，(natrevimmunol)10(5):297)。在二十一世纪的今天，抗体已成为医药行业的绝对优势组成，具有十分广阔的发展前景。目前，抗人cd3单克隆抗体已然成为医药行业研究的热点，因其能够与t细胞表面的cd3分子结合，启动t细胞信号传导级联反应，从而非特异的引起t细胞的杀伤反应。这一特性已经被广泛的应用到各种恶性肿瘤，自身免疫性疾病，移植排斥反应等多个领域的疾病治疗当中。全球第一个被美国食品药品监督管理局(fda)批准的用于治疗急性器官移植排斥的抗体药物okt3单克隆抗体就是鼠抗人cd3抗体(jaffers等，(1986)，(transplantation)41(5):572-578)。随后，鼠源抗体12f6和ucht-1等陆续被开发，它们与okt3识别同一抗原位点。如上所述，鼠抗人cd3抗体具有相当大的免疫治疗潜力，但是这些抗体的价值受到了两个关键因素的制约。其一，是人抗鼠抗体反应，该反应可加速鼠源抗体的清除，有时还会引起过敏反应。其二，是首剂综合症，给药后病人可出现一系列从轻度的发热、发冷到重度水肿的症状，偶尔甚至会出现“细胞因子风暴”引起致死。引起这一严重后果是因为t细胞表面的cd3分子与抗体的fc段交联引发一系列级联反应。在抗体分析结构改造中，不可避免的会引起抗体稳定性的降低。因此，克服这两个关键制约因素成为抗人cd3抗体发展的整体趋势，首先就是对鼠源抗体进行人源化，然后就是去除抗体的fc段。因此，本领域技术人员致力于开发稳定性好、亲和力高的抗人cd3抗体。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高稳定性的人源化抗人cd3单链抗体。本发明的第一方面，提供了一种抗人cd3抗体，所述抗人cd3抗体的氨基酸序列基于seqidno.1所示抗体的氨基酸序列，并且对seqidno.1所示抗体的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述抗人cd3抗体；并且所述抗人cd3抗体的氨基酸序列与seqidno.1所示抗体的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；并且所述抗人cd3抗体的tm值高于seqidno.1所示抗体的tm至少5℃，优选地至少8℃，更优选地至少10℃。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体的tm值≥65℃；优选地≥70℃；更优选地≥73℃；最优选地≥75℃。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体中突变的氨基酸残基位点为1、33、75-76、95-110、135-150、188-195、205-220、240-245位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用seqidno.1所示的编号。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体中突变的氨基酸残基位点为1d，33h，75s，76s，99q，102k，104e，107r，137v，139q，141g，142r，145r，190f，194f，208q，210d，213r，215e，241v，和243v中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用seqidno.1所示的编号。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤20；优选地，2≤n≤15；更优选地，2≤n≤11，如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点包括1d，和/或33h，其中氨基酸残基编号采用seqidno.1所示的编号。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括75s，和/或76s。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括99q，102k，104e，和/或107r。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括137v，139q，141g，142r，和/或145r。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括190f，和/或194f。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括208q，210d，213r，和/或215e。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括241v，和/或243v。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括选自下组的一个或多个突变后的氨基酸残基：1g，33n，75n，76k，99n，102h，104k，107n，137k或137q，139n、139k、139d或139e，141e、141q、141d或141k，142k、142q、142e或142n，145k或145q，190l，194v，208d或208n，210e或210n，213e、213h或213k，215d或215n，241i，243f，其中氨基酸残基编号采用seqidno:1所示的编号。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：1g，和/或33n。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：75n，和/或76k。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：99n，102h，104k，和/或107n。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：137k或137q，139n、139k、139d或139e，141e、141q、141d或141k，142k、142q、142e或142n，和/或，145k或145q。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：190l，和/或194v。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：208d或208n，210e或210n，213e、213h或213k，和/或，215d或215n。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体包括突变后的氨基酸残基：241i，和/或243f。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体中氨基酸残基的突变为：(ⅰ)d1g、h33n、q99n、k102h、e104k、r107n、q208d、d210e、r213h和e215d；(ⅱ)d1g、h33n、v137k、q139d、g141d、r142e和r145k；(ⅲ)d1g、h33n、v137k、q139e、g141k、r142n和r145k；(ⅳ)d1g、h33n、s75n、s76k、q208d、d210n、r213h、e215d和v243f；(ⅴ)d1g、h33n、v137k、q139k、g141q、r142q、r145q、q208d、d210n、r213k和e215n；(ⅵ)d1g、h33n、v137q、q139n、g141e、r142k、r145k、q208n和r213e；或(ⅶ)d1g、h33n、f190l、f194v、q208n、r213e、e215d和v241i。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体的氨基酸序列选自seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19或seqidno:21。在另一优选例中，相对于野生型的抗人cd3抗体(12f6)，所述抗人cd3抗体的稳定性提高至少10％，优选地15％，更优选地18％。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体是可溶性的。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体为单链抗体。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体的c或n末端结合有偶联物。在另一优选例中，所述抗人cd3抗体结合的偶联物为t细胞受体，优选地，所述t细胞受体为高亲和性t细胞受体。本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括本发明第一方面所述的抗人cd3抗体。在另一优选例中，所述融合蛋白还包括t细胞受体的α链和/或β链，优选地，所述t细胞受体为高亲和性t细胞受体(如1g4tcr)。在另一优选例中，所述融合蛋白还包括t细胞受体的α链，并且所述融合蛋白与t细胞受体的β链结合形成复合物(immtac)。在另一优选例中，所述融合蛋白还包括t细胞受体的β链，并且所述融合蛋白与t细胞受体的α链结合形成复合物(immtac)。本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的抗人cd3抗体或本发明第二方面所述的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的抗人cd3抗体或本发明第二方面所述的融合蛋白。本发明的第七方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的抗人cd3抗体的方法，包括步骤：1)培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的抗人cd3抗体；2)分离或纯化出本发明第一方面所述的抗人cd3抗体。本发明的第八方面，提供了一种本发明第一方面所述的抗人cd3抗体或本发明第二方面所述的融合蛋白的用途，用于制备治疗肿瘤、病毒性感染、和/或自身免疫疾病的药物。本发明的第九方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的抗人cd3抗体或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第六方面所述的药物组合物。在另一优选例中，所述疾病包括肿瘤、病毒性感染、和/或自身免疫疾病。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1a和1b分别为人源化抗人cd3单链抗体12f6的野生型氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:1和2)。所述氨基酸序列来源于文献资料(libohua,(2005),(immunology)116(4):487-498)，在本发明中命名为12f6-wt。图2a和2b分别为12f6的稳定性突变株l4-7的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:3和4)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图3a和3b分别为12f6的稳定性突变株l3-18的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:5和6)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图4a和4b分别为12f6的稳定性突变株l3-20的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:7和8)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图5a和5b分别为12f6的稳定性突变株sub3的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:9和10)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图6a和6b分别为12f6的稳定性突变株sub6的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:11和12)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图7a和7b分别为12f6的稳定性突变株sub9的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:13和14)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图8a和8b分别为12f6的稳定性突变株sub11的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:15和16)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图9a和9b分别为12f6的稳定性突变株l4-7-gz8的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:17和18)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图10a和10b分别为12f6的稳定性突变株l4-7-gz11的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:19和20)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图11a和11b分别为12f6的稳定性突变株l4-7-gz77的氨基酸序列和核苷酸序列(seqidno:21和22)，其中，高稳定性的突变位点以黑体字和下划线显示。图12为12f6-wt和稳定性突变体l4-7，l3-18，l3-20，sub3，sub6，sub9，sub11的dsc数据及体外复性效率百分比，其中复性效率计算方式为：(纯化后最终得到的蛋白质量/复性时加入的包涵体质量)*100％。图13为12f6-wt和稳定性突变体的dsc拟合图谱。图14为12f6-wt，稳定性突变体l4-7，高亲和性突变体gz8、gz11、gz77，以及移植了l4-7稳定性突变位点后的高亲和性、高稳定性突变体l4-7-gz8、l4-7-gz11、l4-7-gz77的tm值和dsc图谱分析。图15为12f6-wt，稳定性突变体l4-7，高亲和性突变体gz8、gz11、gz77，以及移植了l4-7稳定性突变位点后的高亲和性、高稳定性突变体l4-7-gz8、l4-7-gz11、l4-7-gz77的biacorespr数据及图谱。图16显示了将不同的12f6scfv与1g4高亲和性tcr融合制备成immtac分子的命名及相应的组成分子。图17显示图16对应的8个immtac分子复性纯化的回收率。图18显示图16对应的8个immtac分子激活t细胞，释放ifn-γelispot检测结果(elispot)。图19显示图16对应的8个immtac分子介导cd8+t细胞特异性杀伤靶细胞释放ldh的结果。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，有针对性地分别对人源化抗人cd3单链抗体12f6进行突变，通过噬菌体展示和淘选，获得7个高稳定性的突变体，其稳定性得到了大幅提升。在此基础上完成了本发明。之前的研究已经对鼠源抗体进行了人源化(libohua等，(2005)，免疫学(immunology)116(4)：487-498)，并去除了抗体的fc段。本发明中优化的初始模板就是人源化抗人cd3单链抗体12f6(libohua等，(2005)，免疫学(immunology)116(4)：487-498)。在实际应用中发现人源化抗人cd3单链抗体12f6稳定性较差，尤其是在亲和力得到提升后，稳定性会下降许多。由于抗体的稳定性对于临床应用有很重要的价值，因此迫切需要优化抗体来提高其稳定性。本发明以人源化抗人cd3单链抗体12f6作为模板，引入随机突变位点，建立4个噬菌体展示文库，经过稳定性淘选，最后得到7个稳定性大幅提高的12f6突变株。进一步，为了验证筛选到的突变体的稳定性突变位点是否同样可以提高其它scfv的稳定性，本发明人将本发明得到的高稳定性突变位点移植到其他抗人cd3抗体分子中，同样能够提高其他抗人cd3抗体分子的稳定性，这一结果表明，本发明筛选到的稳定性突变位点具有一定的可移植性。具体地，本发明中所述12f6分子在seqidno:1所示的氨基酸序列中含有突变。并且，所述12f6分子的氨基酸序列与seqidno:1所示的氨基酸序列有至少90％的序列相同性。更具体地，所述12f6的的氨基酸残基在一个或多个下列位点中发生突变：1d，33h，75s，76s，99q，102k，104e，107r，137v，139q，141g，142r，145r，190f，194f，208q，210d，213r，215e，241v，243v，其中氨基酸残基编号采用seqidno:1所示的编号。更具体地，所述12f6包含选自以下一组或多组氨基酸残基：1g，33n，75n，76k，99n，102h，104k，107n，137k或137q，139n、139k、139d或139e，141e、141q、141d或141k，142k、142q、142e或142n，145k或145q，190l，194v，208d或208n，210e或210n，213e、213h或213k，215d或215n，241i，243f，其中氨基酸残基编号采用seqidno:1所示的编号。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且其意图不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。术语dsc(differentialscanningcalorimetry)：即差示扫描量热法，一种热分析法。在程序控制温度下，测量输入到试样和参比物的功率差(如以热的形式)与温度的关系。差示扫描量热仪记录到的曲线称dsc曲线，它以样品吸热或放热的速率，即热流率dh/dt(单位毫焦/秒)为纵坐标，以温度t或时间t为横坐标，可以测定多种热力学和动力学参数，例如比热容、反应热、转变热、相图、反应速率、结晶速率、高聚物结晶度、样品纯度等。该法使用温度范围宽(-175～725℃)、分辨率高、试样用量少。适用于无机物、有机化合物及药物分析。本发明使用dsc检测12f6及突变体的tm值。稳定性：指蛋白质稳定性的任何方面。与初始野生型的蛋白质相比，经过筛选得到的高稳定性蛋白质具有一个或一个以上的下列特征：更抗解折叠、更抗不适当或不希望的折叠、复性能力更强、表达能力更强、蛋白复性收率更高、热稳定性增加、在多种环境(例如，ph值、盐浓度、存在洗涤剂、存在变性剂等)下稳定性增加。本发明突变株在热稳定性、复性能力等方面都有显著提高，为了更具体的显示出稳定性提高的数值，在本发明中，利用dsc测得的tm值对其进行计算，具体如下：稳定性的提高(％)＝(稳定性突变株的tm值－12f6-wt的tm值)/12f6-wt的tm值*100％。单链抗体：singlechainantibodyfragment(scfv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scfv能较好地保留其对抗原的结合活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。单链抗体的优点包括：1)可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性；2)易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度；3)免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应；4)在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；5)易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。缺点是稳定性低、功能单一、亲和力低。野生型12f6：是人源化的抗人cd3单链抗体，命名为12f6-wt，在本发明中做为构建噬菌体突变文库的模板。其人源化过程及结果见(libohua等，(2005),(immunology),116(4):487-498)，其重链可变区序列为rhj，轻链可变区序列为rli。原始12f6为鼠源抗体，在imgt(国际免疫遗传学信息系统)中重链可变区氨基酸序列对应的等位基因是小鼠ighv1-4*01vh，轻链可变区氨基酸序列对应的等位基因是小鼠igkv4-72*01v-kappa。在本发明中，其对应的氨基酸序列为seqidno:1，dna序列为seqidno:2。tcr：即t细胞受体(tcellreceptor，tcr)，是t细胞特异性识别和结合抗原肽-mhc分子的分子结构，通常与cd3分子呈复合物形式存在于t细胞表面。大多数t细胞的tcr由α和β肽链组成，少数t细胞的tcr由γ和δ肽链组成。本发明中所提到的tcr分子，是nyeso-1肿瘤抗原特异性的tcr分子，命名为1g4，此tcr分子已经经过亲和力的优化，相关信息已发表(li，y.等,(2005),(natbiotechnol)23(3):349-354)。其中本发明中应用到的高亲和性的1g4tcr的亲和力为26pm。immtacs：immune-mobilizingmonoclonaltcrsagainstcancer，是由高亲和性tcr与人源化抗人cd3单链抗体(scfv)结合而成的融合蛋白，cd3抗体识别t细胞表面的cd3抗原，tcr则特异的识别肿瘤表面的phla复合物，从而激活t细胞靶向杀伤肿瘤细胞(liddyn等,(2012),(natmed)18(6):980-7)。pbmc：外周血单个核细胞(pbmc)是具有圆形胞核的血细胞，如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是免疫系统抵抗感染并适应于入侵者的关键组分。淋巴细胞群体由t细胞(cd4和cd8阳性约75％)、b细胞和nk细胞(合并约25％)组成。肿瘤：指包括所有类型的癌细胞生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，不管病理类型或侵染的阶段。肿瘤的实施例非限制性地包括：实体瘤，软组织瘤，和转移性病灶。实体瘤的实施例包括：不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤，肺鳞癌和癌症。例如：感染的前列腺，肺，乳房，淋巴，肠胃(例如：结肠)，和生殖泌尿道(例如：肾脏，上皮细胞)，咽头。肺鳞癌包括恶性肿瘤，例如，多数的结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺部的非小细胞癌，小肠癌和食道癌。上述癌症的转移性病变可同样用本发明的方法和组合物来治疗和预防。药用载体：还称作赋形剂或稳定剂，使用剂量和浓度对其暴露的细胞或个体无毒。经常地，生理可接受载体是ph缓冲的水溶液。生理可接受载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如edta；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如tweentm、聚乙二醇(peg)和pluronicstm。噬菌体展示系统及高稳定性12f6的筛选：当使用噬菌体展示系统来分离抗体的时候，通常是通过两种重要的性质筛选得到最终的抗体，第一是抗体与抗原的结合强度或亲和力，第二是抗体在噬菌体表面的展示密度。第一个性质是蛋白质亲和力进化的基础，它指导产生高亲和性抗体的所有方法论的发展。一个简单的描述如下：当抗体展示文库上样于抗原时，具有更高结合强度的抗体会以更快的速度和/或更长的保留时间结合于抗原，并能够抵抗更高强度的洗涤。因此，这些抗体及其编码基因就会被捕获并在后续过程中放大。另一方面，当抗体-抗原相互作用的亲和力没被改变或改变程度不大，甚至变低，亲和力因素就对于筛选不起作用，展示密度就会主导进化结果。这就意味着当更多正确折叠的抗体分子展示在一个噬菌体粒子上面或者更多的噬菌体粒子展示一个或多个这样的抗体时，该抗体和编码基因就有更多的机会与抗原结合，在特定洗涤条件下应滞留更多的该抗体，从而被捕获并在后续的筛选过程中扩大。基于第二个性质，通过使用噬菌体展示技术或其他定向的分子展示技术可以分离出更稳定的蛋白质。本发明人已经设计出了人源化抗人cd3单链抗体12f6噬菌体展示文库，筛选更稳定的人源化抗人cd3单链抗体12f6。已证实，筛选得到的7株稳定性突变体tm值比野生型12f6至少提高了9℃，且复性效率比野生型12f6也有不同程度的提高。氨基酸序列本发明的人源化抗人cd3单链抗体12f6突变体还可包括在筛选区域之外的其他突变，包括引起亲和力提高的cdr区的突变，如l4-7-gz8，l4-7-gz11，l4-7-gz77等序列。这一筛选到的人源化抗人cd3单链抗体的突变体，其变异形式包括(但不限于)：抗人cd3单链抗体其他亲和力相关氨基酸的缺失、插入和/或取代，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸，通常为tag,酶切位点引入序列等。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单链抗体自身或者与其他功能蛋白的融合蛋白形式，如l4-7-1g4tcr组成的融合蛋白immtac等。应理解，本文中氨基酸名称用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：ala(a)、arg(r)、asn(n)、asp(d)、cys(c)、gln(q)、glu(e)、gly(g)、his(h)、ile(i)、leu(l)、lys(k)、met(m)、phe(f)、pro(p)、ser(s)、thr(t)、trp(w)、tyr(y)、val(v)。本文中氨基酸取代的书写方式如d1g代表按照本发明中给出的位置编号第1位的d(亮氨酸)被g(缬氨酸)取代，其他相同的氨基酸取代书写方式的含义参照本例。本发明还包括本发明单链抗体蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指能与配体分子结合的多肽或蛋白质。本发明的单链抗体及其衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明单链抗体与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6his等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指具有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。表a最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu发明还提供本发明单链抗体的类似物。这些类似物与本发明原单链抗体蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的单链抗体并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的改变。本发明的单链抗体还可以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。编码序列本发明还涉及编码人源化抗人cd3单链抗体12f6稳定性突变体的多核苷酸，本发明中均以编码链的形式展现。本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用但不限于pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。双特异性抗体所述术语双特异性抗体(bispecificantibody，biab)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。biab在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过biab介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是biab能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。本发明的人源化抗人cd3单链抗体12f6稳定性突变株就能够和多种其他抗体分子组成双特异性抗体，从而发挥治疗多种疾病的功效。制备方法产生本发明的人源化抗人cd3单链抗体12f6稳定性突变体的一种方法是从展示此类单链抗体的噬菌体颗粒的多样性文库中选择出高稳定性的抗人cd3单链抗体。可采用任何合适的方法进行突变，包括但不限于依据聚合酶链式反应(pcr)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(lic)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(pcr)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见sambrook和russell,(2001)分子克隆-实验室手册(molecularcloning-alaboratorymanual)(第三版)cshl出版社。lic方法的更多信息可见(rashtchian,(1995)curropinbiotechnol6(1):30-6)。本发明的蛋白序列可以是重组蛋白或合成蛋白。通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：(1)用编码本发明的多核苷酸抗人cd3单链抗体突变体(l4-7-12f6)(或简并变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。(3)从培养基或细胞中分离、纯化出本发明人源化抗人cd3单链抗体，或其他以其突变位点为基础的12f6亲和力突变体，融合蛋白等。重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。药物组合物和施用方法本发明的人源化抗人cd3单链抗体12f6突变体可直接结合人cd3分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外本发明的单链抗体可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的单链抗体通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。此外，本发明的12f6突变体可以单用，也可与其他治疗剂结合或偶联在一起使用(如配制在同一药物组合物中)。优选的可与高亲和性tcr分子联合使用。可与本发明单链抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(koppe等，2005，癌转移评论(cancermetastasisreviews)24，539)；2.生物毒素(chaudhary等，1989，自然(nature)339，394；epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(cancerimmunologyandimmunotherapy)51，565)；3.细胞因子(gillies等，1992，美国国家科学院院刊(pnas)89，1428；card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(cancerimmunologyandimmunotherapy)53，345；halin等，2003，癌症研究(cancerresearch)63，3202)；4381)；4.抗体scfv片段(zhu等，1995，癌症国际期刊(internationaljournalofcancer)62,319)；5.金纳米颗粒/纳米棒(lapotko等，2005，癌症通信(cancerletters)239，36；huang等，2006，美国化学学会杂志(journaloftheamericanchemicalsociety)128，2115)；6.病毒颗粒(peng等，2004，基因治疗(genetherapy)11，1234)；7.脂质体(mamot等，2005，癌症研究(cancerresearch)65，11631)；8.纳米磁粒；9.前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))；10.化疗剂(例如，顺铂)等。药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991))中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有针剂、口服剂等。这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明多肽可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明多肽或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。本发明人源化抗人cd3单链抗体12f6的用途本发明的12f6稳定性突变体可用作药物或细胞分离、制备、提取、检测用的产品。可通过修饰或其他改进以使其获得更适于作为药物或细胞分离、制备、提取、检测用的产品。该单链抗体用作药物，可与其他药物组合用于治疗或预防多种不同的疾病，所述疾病包括但不限于：癌症(例如肾癌、卵巢癌、头和颈癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌或黑素瘤等)、自身免疫病、病毒感染性疾病。也可单独用于治疗移植排斥和移植物抗宿主病。本发明的高稳定性12f6分子可与高亲和性t细胞受体结合，制备成融合蛋白，用于肿瘤，病毒性感染、自身免疫疾病等多个领域疾病的治疗；另外，本发明的高稳定性12f6可与抗体结合，制备成融合蛋白，用于肿瘤，病毒性感染、自身免疫疾病等多个领域疾病的治疗。具体地，本发明的12f6突变体，可组合其他靶向药物，如与特异性t细胞受体(tcr)融合成immtac分子，与cd19抗体(cn104829727(a)―2015-08-12)、组合成双特异性抗体，从而提高多种疾病的治疗效果。通过本发明12f6突变体所制备的分离、提取、检测细胞用的产品包括：介质、磁珠、荧光标记抗体、化学标记物标记抗体、放射性同位素标记抗体、胶体金标记抗体、酶标记抗体等。工业应用性本发明的12f6稳定性突变体，作为t细胞的增殖剂、免疫抑制剂等生物活性分子将会受到业界的广泛重视。在肿瘤治疗、预防和拮抗器官移植免疫排斥等临床治疗中具有极大的潜力。本发明的主要优点包括：(a)本发明12f6分子的稳定性有了显著提高，相对于12f6-wt，其稳定性提高了至少10％；(b)高稳定性的突变位点可移植。(c)本发明高稳定性的12f6与高亲和力tcr融合，得到的融合蛋白的稳定性也得到了提高，从而能够更有效的激活t细胞并具有更好的杀伤作用。下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook和russell等人，分子克隆：实验室手册(molecularcloning-alaboratorymanual)(第三版)(2001)cshl出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。下述实施例中所使用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。实施例1构建wt-12f6scfv稳定性优化文库本实施例所用的模板序列为wt-12f6scfv，其氨基酸和核苷酸序列分别如图1a和1b所示。具体的pcr诱变实验步骤如下：第一步pcr：构建突变文库1使用下列引物对l1p1/l1p2，l1p3/l1p4，lip5/lip6，lip7/lip8，l1p9/l1p10；构建突变文库2使用下列引物对l2p1/l2p2，l2p3/l2p4，l2p5/l2p6，l2p7/l2p8，l2p9/l2p10；构建突变文库3使用下列引物对l2p1/l3p2，l3p3/l3p4，l3p5/l2p10；构建突变文库4使用下列引物对l2p1/l4p2，l4p3/l4p4，l4p5/l2p10；反应程序是：98℃预变性1min；98℃10s，55℃5s，72℃10s(35cycles)；72℃10min。第二步pcr，用重叠延伸pcr(overlappcr)方法，用第一步pcr纯化后的产物为模板，各个库的首尾引物为overlap引物进行第二步pcr。其反应程序是：98℃预变性1min；98℃10s，55℃5s，72℃15s(35cycles)；72℃10min。overlappcr产物纯化后经ncoi和noti酶切后连接入噬菌体展示载体。连接产物电转tg1感受态细胞(购自lucigen公司)，初级库构建完成。构建12f6噬菌体突变文库时，设计的引物如下表1所示。表1建库的引物序列本发明中所用的简并碱基，如本领域技术人员熟知的那样，可以分别代表的碱基类型如下：b＝c或g或t；d＝a或g或t；h＝a或c或t；k＝g或t；m＝a或c；n＝a或c或g或t；r＝a或g；s＝c或g；v＝a或c或g；w＝a或t；y＝c或t。实施例212f6噬菌体文库的稳定性筛选12f6的噬菌体文库在30℃过夜展示，用peg6000进行沉淀纯化。为了筛选到稳定性较好的突变株，在筛选前将纯化好的噬菌体进行压力处理。方法：在第一、二、三轮淘选前将噬菌体在60℃+0.02％sds条件下处理1h，冰上冷却10min后开始筛选；在第四、五、六轮淘选前将噬菌体为65℃+0.02％sds条件下处理1h，冰上冷却10min后开始筛选。上述文库构建及筛选方法可以参照li等在(li等,(2005),(naturebiotech),23(3):349-354)中描述的噬菌体展示和高亲和性tcr噬菌体文库的构建及筛选方法。最终，筛选到7个高稳定性的克隆，分别是l4-7，l3-18，l3-20，sub3，sub6，sub9，sub11。实施例312f6-wt及稳定性突变体的表达、复性和纯化及复性得率对比将实施例2中得到的7个突变体l4-7，l3-18，l3-20，sub3，sub6，sub9，sub11和12f6-wt的序列插入到原核表达载体pet-28a，转化到大肠杆菌菌株bl21(de3)，测序。接菌在lb培养基，37℃培养过夜，第2天按1:100转接到含有卡那霉素培养基中，37℃培养至od600为0.6-0.8，加入终浓度0.5mmiptg诱导表达4h，5,000rpm离心15min收获细胞。用bugbustermastermix(merck)裂解菌体，6,000g15min回收包涵体沉淀物。之后用10倍稀释的bugbuster溶液洗涤包涵体3次，去除细胞碎片和膜组分。最后将包涵体溶解在盐酸胍缓冲液中(6m盐酸胍，50mmtrisph8.1，100mmnacl，10mmedta)。用bca法定量后，分装为8mg/tube，-80℃冷冻。解冻8mg包涵体，加入到100ml复性缓冲液中：100mmtris.cl，ph8.1，400mml-精氨酸，5murea，2mmedta，氧化还原对终浓度分别为1.87mm和6.5mm。溶液在4℃缓慢搅拌10min，装进分子截留量为3.5kd的透析袋，用4l预冷的纯水4℃缓慢搅拌透析复性过夜。第2天，用4l20mmpbph6.5的缓冲液透析8h，再更换4l50mmmesph6.2缓冲液透析过夜1次。将透析后的复性液过0.45μm滤膜后上阳离子交换柱spxl(5ml)(ge公司)，利用akta纯化仪(ge公司)，用50mmmesph6.2配制的1mnacl线性梯度洗脱结合的蛋白质10个柱体积，收集洗脱峰(相对分子质量约为27kd)，跑sds-page进行分析。包含目标蛋白的组分浓缩后用凝胶过滤柱(superdex7510/300,gehealthcare)进一步纯化。计算复性得率：(最终得到的蛋白质量(mg)/复性时加入的包涵体质量(mg))*100％。如图12所示，除了sub6的复性效率比12f6-wt的复性效率略低外，其余突变体与12f6-wt相比，复性得率都有不同程度的提高，其中l3-20的复性得率是12f6-wt的1.32倍，sub9的是12f6-wt的1.87倍，其余突变体l4-7，l3-18，sub3，sub11的复性得率至少是12f6-wt的2倍，复性效率显著提高。实施例412f6-wt及各突变体的稳定性检测利用美国ta(waters)公司的差示扫描量热仪(nanodsc)测定上述纯化后的蛋白12f6-wt和7个突变体l4-7，l3-18，l3-20，sub3，sub6，sub9，sub11的tm值和dh值。其扫描范围为10-100℃，升温速率为1℃/min，样品浓度为0.5mg/ml，上样量为900μl。其中，tm值是通过分析软件nanoanalyze的拟合模型twostatescaled拟合而得到。图12为检测的dsc数据。其中l3-18的tm值为75.37℃，l3-20的tm值为75.41℃，l4-7的tm值为79.66℃，sub3的tm值为74.42℃，sub6的tm值为73.65℃，sub9的tm值为75.36℃，sub11的tm值为75.84℃。与12f6-wt的tm值63.74℃相比，以上突变株的tm值分别提高了11.63℃，11.67℃，15.92℃，10.68℃，9.91℃，11.62℃，12.1℃。即稳定性分别提高了18.2％、18.3％、25.0％、16.8％、15.5％、18.2％和19.0％，稳定性大幅提高。图13为12f6-wt与7个突变体的dsc拟合曲线图。实施例5高稳定性突变株骨架的移植得到7个高稳定性突变体后，将tm值最高的突变体l4-7的突变位点分别移植到3个高亲和性的12f6突变体gz8、gz11和gz77上，得到3个新的突变体，分别命名为l4-7-gz8(seqidno:17)，l4-7-gz11(seqidno:19)和l4-7-gz77(seqidno:21)。并对移植前后的蛋白进行相关稳定性参数的检测与对比。图14是移植l4-7突变位点前后各克隆的tm值和dsc拟合图谱。其中，l4-7-gz8的tm值是71.09℃，比gz8的tm值58.47℃提高12.62℃；l4-7-gz11的tm值是71.38℃，比gz11的tm值59.30℃提高12.08℃；l4-7-gz77的tm值是76.21℃，比gz77的tm值69.46℃提高6.75℃。图15是移植l4-7突变位点前后各克隆的biacorespr数据和图谱。其中l4-7-gz8与cd3的亲和力1.039e-07，跟gz8与cd3的亲和力2.148e-07相当；l4-7-gz11与cd3的亲和力1.012e-07，跟gz11与cd3的亲和力1.695e-07相当；l4-7-gz77与cd3的亲和力7.777e-07，跟gz77与cd3的亲和力5.514e-07相当。综上所述，l4-7的稳定性突变位点分别移植到高亲和性的12f6突变体gz8、gz11和gz77后，在提高3者的稳定性的同时而不影响他们与cd3抗原的结合亲和力。可见，筛选出的稳定性突变位点可以提高其它分子的稳定性，具有可移植性。实施例6本发明高稳定性12f6分子的功能验证做为人源化抗人cd3单链抗体，12f6需与高亲和性的tcr做成融合分子immtac，才能介导t细胞特异的杀伤靶细胞。为了验证优化后的12f6是否能够使immtac复性效率得到提升且保持激活cd8+t细胞杀伤靶细胞的功能，本发明人将12f6-wt，l4-7，gz8，l4-7-gz8，gz11，l4-7-gz11，gz77，l4-7-gz77与识别ny-eso157-165(jageretal.，1998)抗原表位的高亲和tcr(1g4)的β链(li，y.等,(2005),(natbiotechnol)23(3):349-354)，用linker拼接成1条链后，克隆到pet28a载体，经诱导表达包涵体后与1g4tcr的α链共复性，经过蛋白纯化后得到完整的immtac分子。图16显示了各immtac分子的名称和组成。图17为12f6scfv-1g4immtac分子复性效率，以及移植l4-7稳定性突变位点前后对应的immtac分子复性效率的比较。结果显示，l4-7-gz8-1g4的复性效率是gz8-1g4的1.84倍，l4-7-gz11-1g4的复性效率是gz11-1g4的1.71倍，l4-7-gz77-1g4的复性效率是gz77-1g4的5.79倍；l4-7-1g4的复性效率是12f6-wt-1g4的1.85倍。该结果表明，相对于野生型，12f6的稳定性突变体更利于immtac的复性，也说明我们在稳定性优化中得到的优化位点不仅能改善不同亲和力的12f6scfv的稳定性及复性效率，也能提高融合蛋白immtac的复性效率。融合了12f6稳定性突变体的immtac分子比融合了野生型12f6的immtac分子的复性能力更强、更抗解折叠、更抗不适当或不希望的折叠、蛋白复性收率更高。l4-7稳定性突变位点移植前后的12f6scfv-1g4immtac分子的功能验证，包括ifn-γ释放检测(elispot)和immtac分子介导cd8+t细胞特异性杀伤靶细胞释放ldh。12f6scfv-1g4immtac分子激活t细胞，ifn-γ释放检测(elispot)采用huifn-gmabdelispotset10plt试剂盒(cat:bd551849)，按说明书进行操作。1)第一天活化膜，配制35％的乙醇，每孔加20ul，加入后在1分钟内弃去。然后用去离子水漂洗两次，每孔200ul，拍板几次去净残留水。2)包板：用pbs按1：200稀释抗体后包板，50ul/孔，4度过夜。3)第二天早晨弃去包板液后用pbs漂洗两次，每孔200ul；漂洗后，加入封闭液，每孔200ul,室温放置2小时，封闭液为含5％fbs的pbs。4)cellactivation：弃去封闭液后加入负载了ny-eso157-165短肽的t2细胞和cd8+t细胞(cd8+：t2＝2000：10000)。5)检测抗体：弃去细胞悬液，用去离子水漂洗3次，每孔200ul，每次间隔3—5分钟；然后再用0.05％的pbst漂洗三次，每孔200ul。在封闭液中以1:200稀释检测抗体，每孔50ul,室温放置两个小时。6)酶反应：弃去悬液，用pbst漂洗三次，每孔200ul,每次间隔1-2分钟；在封闭液中以1:100稀释酶联反应物，每孔50ul，室温放置1小时。7)底物显色：弃去悬液，用pbst漂洗四次，每孔200ul；然后用pbs漂洗两次，每孔200ul；加入底物，底物为1ml中加1滴。每孔50ul，避光放置5分钟后，加入去离子水终止。风干后计数。图18显示elispot的结果，从图中可以看出，同一浓度下，移植了本发明稳定性突变位点的immtac分子与移植前对应的immtac分子相比，激活t细胞能力更强，释放ifn-γ的量明显增多。具体的，在同一浓度下，l4-7-gz8-1g4比gz8-1g4激活t细胞释放ifn-γ的量多；l4-7-gz11-1g4比gz11-1g4激活t细胞释放ifn-γ的量多；l4-7-gz77-1g4比gz77-1g4激活t细胞释放ifn-γ的量多；l4-7-1g4比12f6-wt-1g4激活t细胞释放ifn-γ的量多。由于l4-7稳定性突变位点的移植，大大提高了12f6分子的稳定性，促进了对应的immtac分子的复性效率，正确折叠的immtac分子比例增加，相当于在同一浓度下，有活性的immtac分子更多，所以比移植前对应的immtac分子激活t细胞释放ifn-γ的能力更强。12f6scfv-1g4immtac分子介导cd8+t细胞特异性杀伤靶细胞释放ldh试验采用cytotox96non-radioactivecytotoxicityassay试剂盒(cat：promegag1780)，按说明书进行操作。1)效应细胞为cd8+t细胞，靶细胞为负载了ny-eso157-165短肽的t2细胞，效靶比1:5，若效应细胞为8000个，则靶细胞为40000个。以ucht1的immtac作为阳性对照，每组设置三个复孔。2)用生长状态良好的t2细胞(成团数较多)和新鲜复苏的t细胞，500g离心5min，重悬后用无酚红培养基稀释，于显微镜下计数。3)取96孔板圆底板，用含5％胎牛血清的无酚红1640培养基稀释t2后，于孔中加入80μlt2和ny-eso157-165短肽的混合液，短肽终浓度为2x10-6m，于37℃5％co2培养箱中负载一个小时。4)t2负载短肽的同时用上述培养基梯度稀释12f6scfv-1g4immtac分子，设置浓度梯度为10-8m、10-9m、10-10m、10-11m、10-12m、10-13m、10-14m，稀释后取50μl加入孔中，再加入70μlcd8+t细胞。37℃5％co2培养箱中过夜培养(16-20小时)。5)对照孔分别设置为t2(三个最大释放孔，用于第二天裂解细胞后测ldh的最大释放值；三个自发孔，用于检测t2自发释放的ldh)，t2+t细胞(不加入12f6scfv-1g4immtac作为杀伤孔的对照)。同时还可设置单独t细胞对照以及培养基对照。6)将过夜培养的96孔板取出后，单独取最大释放孔t2细胞，-80℃冷冻30min后于常温下15min使细胞冻融裂解完全。7)所有处理组及对照组细胞常温下250g离心4min以使细胞沉淀。8)用排枪取50μl上清加入到96孔平底(酶分析)板中，避光条件下加入50μl底物(底物的配置：12mlassaybuffer加入到一瓶substratemix中，温和颠倒混匀使底物充分溶解；存储的assaybuffer取出后可在37℃水浴中加速融化，但一旦融化就不要再放置于37℃)。9)加样完成后用铝箔纸覆盖板子或者将板子放于避光环境中室温孵育30min，未用完的底物应立即放回-20℃保存。10)在每个孔中加入50μl终止液，终止后于1小时内490nm测定吸光值。11)结果计算：％特异性杀伤＝(实验孔-效应细胞/靶细胞自发)/(靶细胞最大释放孔-靶细胞自发)x100％。图19显示12f6scfv-1g4immtac分子介导cd8+t细胞特异性杀伤靶细胞释放ldh的结果。从图中可以看出，同一浓度下，移植了l4-7稳定性突变位点的immtac分子与移植前对应的immtac分子相比，激活t细胞特异性杀伤靶细胞的能力更强，释放ldh的量明显增多。具体的，在同一浓度下，l4-7-gz8-1g4比gz8-1g4激活t细胞特异性杀伤靶细胞的能力更强，释放ldh的量更多；l4-7-gz11-1g4比gz11-1g4激活t细胞特异性杀伤靶细胞的能力更强，释放ldh的量更多；l4-7-gz77-1g4比gz77-1g4激活t细胞特异性杀伤靶细胞的能力更强，释放ldh的量更多；l4-7-1g4比12f6-wt-1g4激活t细胞特异性杀伤靶细胞的能力更强，释放ldh的量更多。由于l4-7稳定性突变位点的移植，大大提高了12f6分子的稳定性，促进了对应的immtac分子的复性效率，正确折叠的immtac分子比例增加，相当于在同一浓度下，有活性的immtac分子更多，所以比移植前对应的immtac分子激活t细胞特异性杀伤靶细胞的能力更强，释放ldh的量更多。综上所述，本发明得到的高稳定性突变位点具有一定的可移植性，优化位点不仅能提高自身分子的热稳定性，同时也能改善其它亲和力突变单链抗体分子的热稳定性；另外还促进了其与tcr融合后的复合分子immtac的复性状况，进而提高了immtac分子的生理功能。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院<120>高稳定性的人源化抗人cd3单链抗体及其制法和应用<130>p2016-1737<160>56<170>patentinversion3.5<210>1<211>245<212>prt<213>人工序列<400>1aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrmet202530histrptyrglnglnthrproglylysalaprolysprotrpiletyr354045alathrserasnleualaserglyvalproserargpheserglyser505560glyserglythrasptyrthrleuthrileserserleuglnproglu65707580aspilealathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproprothr859095pheglyglnglythrlysvalgluilelysargglyproserthrser100105110gluglyglyglysergluglyglyglysergluglyglyglyglnval115120125glnleuvalglnserglyglyglyvalvalglnproglyargserleu130135140argleusercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrthrmet145150155160histrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpileglytyr165170175ileasnproserserglytyrthrlystyrasnglnlysphelysasp180185190argphethrileseralaasplysserlysserthralapheleugln195200205metaspserleuargprogluaspthrglyvaltyrphecysalaarg210215220trpglnasptyraspvaltyrpheasptyrtrpglyglnglythrpro225230235240valthrvalserser245<210>2<211>735<212>dna<213>人工序列<400>2gacatccaaatgacccagtcgccgtccagtctgagtgcctccgtcggtgatcgtgttacc60atgacctgccgtgcttcaagtagcgtgagctatatgcattggtaccagcaaaccccgggc120aaagcaccgaagccgtggatttatgcgacgtcgaacctggccagcggtgttccgtctcgt180tttagcggttctggcagtggtaccgattacaccctgacgattagctctctgcagccggaa240gacatcgctacgtattactgccagcaatggagttccaatccgccgaccttcggccagggt300acgaaagtcgaaatcaaacgcggcccgagcacctcggaaggtggcggtagcgaaggtggc360ggttctgaaggtggcggtcaggtgcaactggttcagagcggcggtggcgtcgtccaaccg420ggtcgtagtctgcgcctgtcctgtaaggcgtcaggttatacctttacgtcctataccatg480cattgggtgcgtcaggcaccgggtaaaggtctggaatggattggctatatcaacccgtca540tcgggttacaccaagtacaaccagaagttcaaggatcgcttcaccattagtgcagacaaa600tccaagtcaacggctttcctgcaaatggattctctgcgtccggaagacaccggcgtgtac660ttctgcgcacgctggcaagactatgatgtttactttgattattggggtcagggcacgccg720gtcacggtttcgtcc735<210>3<211>245<212>prt<213>人工序列<400>3glyileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnthrproglylysalaprolysprotrpiletyr354045alathrserasnleualaserglyvalproserargpheserglyser505560glyserglythrasptyrthrleuthrileserserleuglnproglu65707580aspilealathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproprothr859095pheglyasnglythrhisvallysilelysasnglyproserth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