一种烟草腋芽生长调控基因NtBRC1及其克隆方法与应用与流程

文档序号:12743844阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种烟草腋芽生长调控基因NtBRC1,其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1,其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种权利要求1所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的克隆方法,其特征在于包括以下步骤:

A、确定NtBRC1基因序列;

(1)利用番茄基因SIBRC1b搜索烟草基因组数据库得到烟草NtBRC1的核苷酸序列,利用此序列设计基因克隆引物:

正向引物:5′- ATGTATCCGCCAAGCAACAG -3′;

反向引物:5′- GCTATTGAAATCCTAAAAAAT -3′;

B、提取烟草根组织RNA,反转录得到第一链cDNA;

C、根据NtBRC1基因序列设计合成特异性引物,以反转录得到的第一链cDNA作为模板,进行PCR扩增,选用Phusion高保真扩增酶反应体系,体系总体积50μL,包括:200ng cDNA,5×Phusion HF反应缓冲液,10mM dNTP,2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase,正反向引物各1μM,PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行,反应程序为:98℃,30秒;98℃,7秒,55℃,30秒,72℃,30秒,35个循环;72℃延伸7分钟;回收和纯化PCR产物;

D、纯化产物与载体连接,通过试剂盒反应与TOPO载体连接,连接体系与过程如下: 4μL纯化产物+1μL salt salution +1μL PCR-BluntⅡ-TOPO混匀,25℃,水浴30min;将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌,加液体培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养, 长出菌后挑取菌落进行培养,培养后取2ml菌液提取质粒,进行质粒PCR检测,筛选阳性克隆,对阳性克隆进行测序。

4.根据权利要求3所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的克隆方法,其特征在于C步骤中所述的特异性引物引物为:

正向引物:5′- ATGTATCCGCCAAGCAACAG -3′;

反向引物:5′- GCTATTGAAATCCTAAAAAAT -3′。

5.根据权利要求3所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的克隆方法,其特征在于D步骤中所述的培养基为:称取胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g 溶解于1L 蒸馏水中,高温灭菌,即121℃,25min灭菌后使用。

6.一种权利要求1所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的应用,其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1在获得降低打顶后烟草产生腋芽的发育长度的转基因植株中的应用。

7.根据权利要求6所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的应用,其特征在于所述获得NtBRC1转基因烟草的方法包括以下步骤:

A、构建过表达(OE)载体:

a、以pCR®-BluntII-TOPO载体为中间载体、pK2G7为表达载体构建NtBRC1基因的过表达(OE)载体,构建引物为:

NtBRC1-OE-F: 5’- GGATCCATGTATCCGCCAAGCAACAG -3’,

NtBRC1- OE-R: 5’- CTCGAGCTATTGAAATCCTAAAAAAT -3’,

NtBRC1- OE-F中GGATCC处为BamH I酶切位点;NtBRC1-OE-R中CTCGAG处为Xho I酶切位点;

b、以NtBRC1阳性克隆TOPO质粒DNA为模板进行PCR扩增,PCR反应体积为50μL,包括:200ng cDNA,5×Phusion HF反应缓冲液,10mM dNTP,2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase,NtBRC1- OE-F引物、NtBRC1- OE-R引物各1μM,PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行,反应程序为:98℃,30秒;98℃,7秒,55℃,30秒,72℃,30秒,30个循环;72℃延伸7分钟;回收和纯化PCR产物;

c、回收目的片段产物与TOPO载体连接:通过试剂盒反应与TOPO载体连接;

连接体系与过程如下: 4μL纯化产物+1μL salt salution +1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀,25℃,水浴30min,将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌,加培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养, 长出菌后挑取菌落进行培养,培养后取2ml菌液提取质粒,进行质粒PCR检测,筛选阳性克隆,对阳性克隆进行测序;

d、入门克隆pENTRTM2B-NtBRC1OE的构建:用上步测序对的TOPO质粒和pENTRTM2B空载体做酶切反应:BamH I+Xho I双酶切TOPO质粒和pENTRTM2B-ccdB得到目的基因片段和载体片段pENTRTM2B,切胶回收后进行连接、连接体系:连接反应总体积为10μL,含酶切目的片段的切胶回收产物4μL,pENTRTM2B(BamHI+Xho I双酶切)载体1μL,10×T4 buffer 1μL,T4 Ligase 1μL,灭菌双蒸水3μL,混匀,室温反应2小时,转化入大肠杆菌感受态细胞,加培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养,提取质粒进行PCR检测和酶切检测,以验证目的基因片段是否已经插入载体片段,入门载体是否构建成功;

e、通过LR反应得到植物表达载体:挑选检测正确的入门克隆与植物表达载体PK2G7 (Destination clone)进行LR反应,具体反应如下:体系与过程如下:

1)连上2B载体的入门克隆(50-150ng )1-7μL + 0.5μL Destination Vector + TE Buffer(up to 8μL);

2)上述体系混匀,冰浴2min,轻弹2次;

3)加入2μL LR CloneaseTMⅡ enzyme Mix 到上述体系,轻弹,混匀,离心,25℃水浴1h;

4)加入1μL Proteinase K 轻弹,混匀,37℃水浴10min;

通过热激转化转入大肠杆菌,加入培养基震荡培养后涂含100mg/L 壮观霉素的LB平板上,得到植物表达载体,挑菌提质粒后,进行PCR验证及酶切验证;

PCR反应体积为25μL,包括:100ng质粒DNA,5×Phusion HF反应缓冲液,10mM dNTP,1U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase,NtBRC1-OE-F引物、NtBRC1-OE-R引物各0.5μM,PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行,反应程序为:98℃,30秒;98℃,7秒,55℃,30秒,72℃,30秒,30个循环;72℃延伸7分钟;检测重组质粒的正确性,理论上基因上下游引物扩增的片段大小为987bp,验证PCR扩增结果是否和预期一致;酶切体系为20μL:包含质粒DNA1μg,BamHI、Xho I各0.5μL,NEB Buffer 3.1 2μL,理论上酶切检测结果分别为载体片段约12kb和目的基因片段999bp,同时满足两个条件,则表明表达载体构建成功,将检测对的质粒进行测序比对,进一步验证;

B、农杆菌转化:

从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞,在冰上溶解,并加入重组表达载体PK7G- NtBRC1OE 4μL;将混合物分别放入液氮速冻1分钟,转入37℃水浴5分钟,再冰浴2分钟,向混合物中加入1mL LB液体培养基,28℃、220rpm培养3~4小时;培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上,28℃倒置培养2~3天,可见含有目的载体的农杆菌克隆;

C、过表达(OE)载体导入烟草、培养转基因植株:

a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆,在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线,28℃培养2~3天;刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中,28℃,220rpm震荡培养,菌液浓度达到OD=0.5~0.8时进行侵染,得到含目标载体的农杆菌菌体;将菌体收集到离心管中,6,000rpm离心5分钟富集菌体,弃上清,再用20ml液体MS培养基重悬菌体,得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液;

b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中, 加入适量75%乙醇,漂洗1min;倒掉乙醇,加入0.1%的HgCl2溶液,置摇床上室温振荡15~30分钟;倒掉溶液,用无菌水冲洗6遍;

c、将烟草叶片取出,用灭菌吸水纸洗去表面液体,取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片,将切成小片的烟草叶片分别放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中,静置15~20min;取出烟草叶片,用无菌滤纸吸去多余菌液,于加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的MS培养基中25℃暗培养两天;把烟草叶片转入分化培养基中,切口接触培养基,于温室条件下分化培养;分化培养基为加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、Kan 100mg/L、头孢霉素500mg/L的MS培养基,每2~3周将其转移到新的培养基中,切口处逐渐长出愈伤组织,最后分化出芽;

d、将长至3~5cm的芽切下,转入MS培养基诱导生根,生根后的转基因植株由生根培养基中取出,用自来水净培养基,移植于灭菌的营养土中;

e、转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增,鉴定转基因阳性植株。

8.根据权利要求7所述的烟草腋芽生长调控基因NtBRC1的应用,其特征在于C步骤b中所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克,用少许酒精溶解,再加水定容至100毫升。

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