一种白血病相关的环状circRNA‑008488基因及其用途的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种与白血病相关的环状circRNA-008488基因及其用途。
背景技术：
：骨髓移植(Bonemarrowtransplantation，BMT)目前仍是各种血液系统恶性肿瘤、再生障碍性贫血、重度地中海贫血以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病的根本治疗方法。全身照射(TotalBodyIrradiation，TBI)是BMT治疗白血病前患者预处理中极为重要的手段之一。电离辐射会造成肿瘤细胞DNA损伤，进而诱导细胞凋亡，达到治疗肿瘤的效果。但是由于肿瘤细胞存在一定的辐射抗性，而且电离辐射也会使肿瘤附近的正常细胞发生损伤，很大程度上影响了肿瘤放射治疗的效果。因此，如何提高肿瘤细胞的辐射敏感度，降低对正常组织的损伤成为肿瘤放射治疗的关键。随着生物学技术的快速发展，为放射医学在肿瘤传统治疗方法中的应用提供了新的发展方向。环状RNA(circularRNA，circRNA)是一类在哺乳动物细胞中广泛存在的、对基因表达具有调控作用的内源性RNA分子。circRNA多定位于细胞质，具有miRNA应答元件(microRNAresponseelement，MRE)，能与miRNA相互作用。circRNA能够瞬间结合或释放大量miRNA，从而高效地发挥其调控作用。对细胞中基因表达有广泛调控作用的miRNA对于调节细胞辐射敏感度有非常重要的意义，且与细胞增殖、分化、凋亡和代谢密切相关。因此，circRNA可能是细胞敏感度调节的新靶点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种环状circRNA-008488基因，该基因及其表达产物作为预测BMT治疗白血病前患者TBI敏感度的标记物，为临床医生选择合理的辐照方案提供了新的思路。本发明发现白血病患者经TBI后骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)中环状circRNA-008488基因表达显著下调，通过circRNABase预测该基因的应答元件中包括多种let-7家族成员，如let-7a、let-7b、miR-98等。let-7家族是胚胎发生和细胞分化的关键调节因子。作为肿瘤治疗的重要靶点，let-7的表达调控及作用机制对肿瘤细胞辐射敏感度研究意义重大。let-7对于细胞分化有很大的促进作用，还可以和多种调控因子组成信号转导通路，如let-7/p53/miRNA-34，来调节细胞增殖分化。Let-7低表达与放疗抵抗相关。有研究指出：高表达Let-7a可以抑制k-ras的表达，增加A549肺癌细胞株的放射敏感性；如果将Let-7a过表达，克隆形成实验表明肺癌细胞株的放射敏感性大大提高；过表达增加乳腺癌细胞株的放射敏感性。因此我们根据文献和前期工作提出科学假设：白血病患者BMSCs中circRNA-008488通过“海绵作用”调节let-7水平，从而影响细胞的辐射敏感度，进而影响BMT疗效。本发明的第一个方面提供一种环状circRNA-008488基因，其cDNA序列如SEQIDNO：1所示。本发明的第二个方面提供环状circRNA-008488基因在制备诊断白血病的试剂中的应用。该环状RNA基因作为造血干细胞移植前放疗疗效的标记物。本发明的第三个方面提供环状circRNA-008488基因在制备治疗白血病药物中的应用。本发明的第四个方面提供检测所述环状circRNA-008488基因检测试剂盒，主要由DNA聚合酶、缓冲液、水、扩增引物对组成，所述的扩增引物对核酸序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。本发明的第五个方面提供扩增环状circRNA-008488基因的引物对在制备诊断白血病试剂中的应用，所述的扩增引物对核酸序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。在本发明范围内，本发明的上述技术特征和下文实施例中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的技术方案，限于篇幅，在此不一一赘述。本发明首次证实了一个新的环状circRNA-008488基因的客观存在，通过检测全身辐照病人中该基因表达情况，发现其表达水平明显降低，该环状circRNA-008488基因及其表达产物可以作为预测TBI敏感度的标记物，为临床医生选择合理的辐照方案提供了新的思路；含有该环状circRNA-008488基因及其引物对的试剂盒，可以用于TBI疗效预测；环状circRNA-008488基因也可以作为治疗全身辐照药物的靶基因，在白血病治疗中起到重大作用。附图说明图1正常组骨髓基质细胞中环状RNA芯片结果图；图2全身辐照处理组骨髓基质细胞环状RNA芯片结果图；图3正常组和全身辐照处理组骨髓基质细胞中环状RNA表达情况的聚类分析图；图中左侧为正常组骨髓基质细胞中环状RNA表达情况的聚类分析图，右侧为全身辐照处理组骨髓基质细胞中环状RNA表达情况的聚类分析图；图4内参GAPDH基因的实时定量PCR扩增曲线；图5circRNA-008488基因实时定量PCR扩增曲线；图6过表达cricRNA-008488基因腺病毒载体的骨髓基质细胞与正常组的辐照敏感性比较。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定，本发明中所用的方法及其相关的试剂，可以有其他可选择和替代方案，能够达到相同技术结果即可。实施例1：扩增环状circRNA-008488基因引物对根据环状circRNA-008488基因SEQIDNO:1所示的cDNA序列，设计扩增用引物，各引物的具体序列见表1。表1环状circRNA-008488基因扩增引物序列引物名称序列(5’→3’)SEQ.IDFGCTCCACAATGGTCAACTGC2RCTGTCCACTGGCGTTCTTCC3上述引物人工合成后，作为扩增环状circRNA-008488基因cDNA序列引物对使用。实施例2：样品中总RNA的制备按照TRIZOL法RNA提取步骤，提取对照组、全身辐照处理组的骨髓基质细胞样品中的总RNA。简述如下：1匀浆样品按照TRIZOL法说明书，根据细胞数量，加入TRIZOL试剂后，匀浆；2两相分离匀浆后的样品在15-30℃孵育5分钟后，按照每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。3RNA沉淀将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mlTRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。4RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。5重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。6总RNA质量检测提取的总RNA，使用ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。提取的总RNA质量、数质量应能满足后续试验的要求。实施例3：总cDNA序列的合成经质量检测合格的总RNA，按照下面所述的方法进行cDNA的合成。合成所用的试剂及其生产商如下：RNA酶抑制剂(Epicentre)；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)；5×RT缓冲液(Invitrogen)；2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTestLtd)；Primer(英骏生物技术有限公司)cDNA合成用热循环仪为GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)。具体的操作方法如下：1配制退火混合物混合液在65℃水浴5分钟,冰上放置2分钟。2短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液混合后37℃恒温1分钟，然后用移液枪轻轻吸打几次混合均匀。3、50℃温育60分钟。4、70℃温育15分钟使酶失活。5、总cDNA置冰浴待用或-20℃保存。实施例4：环状circRNA-008488基因cDNA扩增本发明中，环状circRNA-008488基因cDNA扩增体系如下：取实施例3合成的总cDNA样品，配置PCR反应体系，反应体系如下：轻柔的使溶液混合，5000rpm短暂离心。cDNA的扩增按照以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒)。实时荧光定量PCR信号收集在PCR循环的60℃，60秒阶段进行。反应结束PCR产物与100bpDNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实施例5：环状circRNA-008488基因检测试剂盒一种环状RNA基因检测试剂盒，包括DNA聚合酶、镁离子、缓冲液、环状RNA基因特异性引物、水。具体体系如下：使用时，加入经反转录得到的总cDNA样品，在下列PCR扩增程序中进行扩增，95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒)。实施例6：基因芯片法研究全身辐照病人中环状circRNA-008488基因表达情况取经全身辐照处理后的患者骨髓基质细胞，按照实施例2中样品中总RNA的制备，提取的总RNA进行环状RNA基因芯片检测。具体步骤如下：1总RNA的纯度和浓度检测用NanoDropND-1000检测提取的总RNA的纯度和浓度，结果如下所示：表2总RNA的纯度和浓度质量检测2RNA标记质量合格的总RNA，用Rnase富集环状RNA。富集后的circRNA经扩增后用Arraystar公司的超级RNA标记探针(Arraystar,Inc)标记。3Array杂交标记后的circRNA与Arraystar公司circRNA芯片(8*15K,Arraystar)在安捷伦分子杂交仪中65℃孵育17小时，进行杂交。4Array扫描充分洗涤后，芯片用安捷伦扫描仪G2505C进行检测。5用安捷伦数据处理软件获取数据；6circRNAs表达分析用R软件包进行一系列包括均一化的数据处理。7CircRNA的差异表达用倍数变化cutoff值或者火山图分别分析辐照组和对照组中表达差异有统计学意义的circRNA。8注释circRNA和microRNA相互作用采用Arraystar’s预测软件分析circRNA与microRNA的相互作用，所有差异表达的circRNA都详细注释了与之相互作用的microRNA。9环状RNA基因芯片检测结果正常组和全身辐照处理组骨髓基质细胞中环状RNA基因芯片检测结果如图1、2所示，表达情况的聚类分析结果如图3所示。环状circRNA芯片检测结果原始数据如下表所示表3circRNA-008488基因在环状circRNA芯片检测结果中原始荧光强度组别circRNA-008488荧光强度对照组9.283345803TBI处理组7.529271347所得荧光强度数据经用安捷伦数据处理软件处理后，得到全身辐照处理组骨髓基质细胞内circRNA-008488基因比对照组下调表达3.3730985倍。利用cytoscape生物信息学软件进行ceRNA分析，可以预测出cirRNA-008488可以通过海绵吸附作用调节let-7a水平，从而参与放疗敏感度的调控。利用TargetScan和miRanda两种生物信息软件预测分析，发现let-7a为cirRNA-008488的应答元件。实施例7：实时定量PCR验证全身辐照病人样品中环状circRNA-008488基因和let-7a基因表达情况样品总RNA提取，总cDNA合成，实时荧光定量PCR反应体系组成、扩增等参数如实施例1、2、3、4所示，采用实时荧光定量PCR分别检测对照组和实验组骨髓基质细胞内circRNA-008488基因和let-7a基因的表达情况，各样品的目的基因和管家基因分别进行实时荧光定量PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。内参GAPDH基因的实时定量PCR扩增曲线如图4所示，circRNA-008488基因的实时定量PCR扩增曲线如图5所示。其中图4、图5实时荧光定量PCR扩增曲线图中的△Rn含义是Rn扣除基线后得到的标准化结果，Rn(Normalizedreporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。对照组和实验组骨髓基质细胞内circRNA-008488和let-7a，实时定量PCR结果校正如下：表4全身辐照病人样品中环状circRNA-008488基因和let-7a基因表达情况实时荧光定量PCR结果进行数据处理后，所得的表达情况如下表所示：表5全身辐照病人样品中环状circRNA-008488基因和let-7a基因相对于内参GAPDH基因表达情况数据比较方案circRNA-008488/GAPDHlet-7a/GAPDH处理组/正常组0.463.48结果显示，经过全身辐照患者骨髓基质细胞中circRNA-008488表达下调，仅为正常组0.46倍，同时let-7a表达显著上调，较正常组高3.48倍。实施例8：环状circRNA-008488基因过表达与辐射敏感度经实施例6、7中全身辐照病人样品中环状circRNA-008488基因表达情况的数据，利用cytoscape生物信息学软件进行ceRNA分析，可以预测出circRNA-008488通过海绵吸附作用调节let-7a对辐射敏感度的调控。为验证该预测，将转染了过表达circRNA-008488基因腺病毒载体的骨髓基质细胞与转染空载体的对照骨髓基质细胞相比，发现circRNA-008488转染株对电离辐射的敏感度降低，具体如下：1circRNA-008488基因扩增根据实施例1设计环状circRNA-008488扩增引物；按照实施例2制备环状circRNA-008488基因扩增用样品；按照实施例3进行总RNA基因cDNA序列的合成；然后按照实施例4进行环状circRNA-008488基因cDNA扩增，并回收扩增的circRNA-008488基因的cDNA。2pcDNA3-circRNA-008488重组质粒和腺病毒的制备用taq酶将扩增后环状circRNA-008488基因cDNA链接到pcDNA3载体上，并包被到rAD-EGFP腺病毒中，命名为rAD-4-circRNA008488腺病毒。3细胞转染转染前24h将1×105骨髓基质细胞接种6孔板培养皿，当细胞长至70％-80％融合的时转染。转染当日弃去旧培养基，用PBS洗2次，加入无血清、无双抗的纯DMEN1ml，本实验对照组用1×105的rAD-EGFP腺病毒，实验组用1×105的rAD-4-circRNA008488腺病毒感染骨髓基质细胞，转染后将6孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中培养6h，弃去培养基，换成2ml含10％血清的DMEN培养基，培养至48h，收集细胞进行后续检测。4放射敏感性检测将实验组与对照组分别给予1Gy、2Gy、4Gy电离辐射后，检测细胞生存率，结果如图6所示，实验组生存率明显高于对照组。在本发明中，发明人发现白血病患者经TBI后BMSCs中circRNA-008488表达下调，通过circRNABase预测circRNA-008488的应答元件为let-7a，实验结果显示TBI处理后circRNA-008488通过“海绵作用”调节let-7a水平，从而影响细胞的辐射敏感度，进而影响BMT疗效。以上具体实施方式仅为本创作的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神及原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>中南大学湘雅三医院<120>一种白血病相关的环状circRNA-008488基因及其用途<130>无<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>344<212>DNA<213>circRNA-008488基因的cDNA序列<400>1gtcaactgcaacatggccccttgacccagcgaaggatgaaaagcaagggtggcggcatgt60caggctgaagcagatggggaagaacgccagtggacagacgcactacctctcgctctccgg120ctttgaactctatggcactgtgaatggcgtgtgcgaagaccaactagggaaagcagctaa180agaagcagaagctaatcttagaaggcagaggcgcctggtgcgctctcaggtcctcaagta240catggttccaggagcacgtgttatcaggggccttgattggaagtggcgagatcaggatgg300cagcccgcagggagaaggcacagtcacaggcgagctccacaatg344344<210>2<211>20<212>DNA<213>circRNA-008488基因的扩增引物F<400>2gctccacaatggtcaactgc20<210>3<211>20<212>DNA<213>circRNA-008488基因的扩增引物R<400>3ctgtccactggcgttcttcc20当前第1页1 2 3