表达H7N9亚型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHMW及构建方法与流程

本发明属于分子生物学和生物技术领域的重组病毒载体疫苗，具体涉及一种能够表达具H7N9亚型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒rHMW，该重组病毒可用于免疫家禽预防H7N9亚型禽流感病毒中的用途。

背景技术：

感染人的H7N9亚型禽流感于2013年首次在我国华东的长三角地区爆发，是一株三源重组的新型禽流感病毒，对家禽不致病或低致病性。截止目前已经扩散至全国除西藏和内蒙古自治区外的所有地区，珠江三角区是继长三角地区后的又一新的爆发疫源地。根据WHO的统计显示，截止到2016年6月13日，一共有781例人感染H7N9的案例，其中死亡313人，死亡率在40％左右。根据flutracters的追踪报道，截止到2016年7月，H7N9感染人的案例已经突破800。其增长速度直逼自从2003年以来人感染H5亚型禽流感数量已经高达851例，由此可见人感染H7N9的数量增长势头迅猛，对公共卫生的危害不容小觑。由于家禽感染不发病，感染的病例多有与活期接触的流行病史，因此，活禽市场家禽的H7N9疫情状态具有直接影响公共卫生安全。根据流行病学调查，人感染H7N9的高峰季节也与家禽的流行规律息息相关。因此亟需研制新型的疫苗来保护家禽，降低疫情对公共的危害。然而目前临床尚无针对H7N9的家禽疫苗用于防控此类疾病。

火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of Turkey,HVT)是一种典型无致病性的α疱疹病毒。因HVT与马立克病毒(Marek's disease virus，MDV)在遗传学和血清学上具有相关性，自1970年以来，HVT Fc-126株作为MD疫苗被广泛使用。该疫苗具有不会引发致瘤发生、保护效果良好、在体内持续存在、可以冻干、便于储存和运输等诸多优点，在MD的防控过程中发挥了重要的作用。近年来，HVT作为病毒载体方面的研究取得了许多进展，因HVT与其它禽病毒载体相比具有许多独特优势，包括：HVT对鸡及其他动物无致病性，安全性好；可以在动物体内持续存在、有利于外源基因的持续表达、刺激机体产生较高的抗体水平；HVT可引起高强度的细胞介导的免疫反应、免疫出现早、持续时间长、接种一次可达到终生免疫；HVT重组疫苗具有生产成本低、可以冻干、易于贮存和运输；HVT具有很强的细胞结合特性、病毒于细胞间传播、因此作为重组疫苗，可以突破母源抗体的干扰等[Bublot,M.,et al.,Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody.J Comp Pathol,2007.137Suppl 1:p.S81-4.]。目前，传染性法氏囊病毒等多种禽病保护性抗原均已在HVT载体中成功表达[Tsukamoto,K., et al.,Complete,Long-Lasting Protection against Lethal Infectious Bursal Disease Virus Challenge by a Single Vaccination with an Avian Herpesvirus Vector Expressing VP2Antigens.Journal of Virology,2002.76(11):p.5637-5645.]。应用上述水平制备的VaxxitexRHVT+IBD重组疫苗已经获得生产许可，成为商品化的以疱疹病毒为载体的动物源性疫苗，使HVT成为最具有开发前景的病毒载体。其技术核心利用同源重组原理：通过外源基因两侧的非必需区同源臂与HVT基因组相对应区段进行同源交换，从而将外源基因导入基因组中。1992年Morgan等人首次利用同源重组方法构建了表达NDV(F)基因的重组HVT，该重组病毒既能抵抗致死性MDV的攻击，又能预防新城疫，其保护率接近传统疫苗的保护效果[Morgan,R.W.,et al.,Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.Avian Dis,1992.36(4):p.858-70.]。后来，Gao等人使用上述方法将AIV H5N1(HA)基因插入到HVT基因组不同的位置中，构建了两株rHVT重组病毒，疫苗试验表明这两株重组病毒均可以同时抵抗AI和MD[Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1Virus at US2Gene Insertion Site of Turkey Herpesvirus Induced Better Protection than That at US10Gene Insertion Site.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.]。

内源性启动子具有克服针对抗原的母源抗体干扰作用。MDV基因的转录和翻译，是受到严格调控的。如当病毒感染细胞时，病毒基因的表达分为3个时期：立即早期、迟早期和晚期。但是，以MDV构建重组病毒时，异源的强启动子受到病毒的调控较少，在重组病毒免疫的早期，该启动子所控制地保护抗原基因大量表达，与机体中针对该抗原的母源抗体发生反应，使得针对该抗原的母源抗体下降，从而降低了机体对某种疾病的早期保护。Sonoda等(Sonoda,Kengo,et al."Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1in commercial chickens with maternal antibodies."Journal of virology 74.7(2000):3217-3226.)利用MDVI型自身的gB启动子构建重组病毒，表达NDV的F基因，免疫商品鸡，可以提供100％的保护，同时，并不影响重组病毒的稳定性。因此，进一步证实了MDV I型自身的gB启动子受到严格地调控，可以避免母源抗体的干扰，保证了免疫保护力。

影响外源基因表达水平的因素很多，而密码子的选择是其中重要的参数之一，基因表达水平与嗜好密码子的使用程度之间存在强的相关性。每个氨基酸平均有三个对应密码子，这使得不同的核苷酸序列可以编码出相同的氨基酸序列，而编码同一氨基酸的不同的密码子在不同的生物和不同基因中的使用频率有着显著的差异，这与在细胞中相应的tRNA的浓度是呈正相关的。使用频率极低的就是该物种或基因的稀有密码子，稀有密码子的使用已经被证实 为阻碍基因表达的一个重要因素，因此去除稀有密码子能够显著提高一个基因的翻译速度。每个物种都有对应的偏嗜密码子，因此为了提高外源基因在一个物种体内的翻译和表达水平，常常对外源基因密码子进行改造，使之符合该物种的密码子偏嗜分布。Jiang(Jiang,Yongping,et al."Enhanced protective efficacy of H5subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector."Antiviral research 75.3(2007):234-241.)等人对H5的HA密码子优化(optiHA)插入到真核表达质粒pCAGGS上免疫SPF鸡，优化后的optiHA能够显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。

鸡的组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)又称为B复合体(Bcomplex)，主要由B-F，B-L和B-G三个各局功能的基因位点组成。其中B-F所编码的抗原在结构和功能上分别类似于哺乳动物的MHCⅠ类抗原，并且存在于所有的细胞内。MHCⅠ类分子与胞内抗原蛋白结合，抗原表位被递呈至细胞表面，同时也可刺激MHCⅡ分子的抗原递呈反应。根据文献报道，分别在外源抗原的N端添加MHCⅠss(MHCⅠsectionsignal)和C端添加MITD(MHCⅠtrafficking domain)能够模仿MHC分子的抗原递呈的过程，从而不但增强抗原递呈效率，同时还能刺激CD8+和CD4+T细胞的多样性反应，这种嵌合型的抗原表达方式增强了抗原表达的效率和效果(Kreiter,Sebastian,et al."Increased antigen presentation efficiency by coupling antigens to MHC class I trafficking signals."The Journal of Immunology 180.1(2008):309-318.)。HVT是一种典型的严格的细胞结合疱疹病毒，很难分离到游离的非细胞结合毒，主要通过细胞桥的方式感染临近细胞。因此我们尝试在去除HA自身的跨膜和胞内区后，添加Gallus Gallus的MHCⅠss/MITD(Guillemot,Franpois,et al."A molecular map of the chicken major histocompatibility complex:the class II beta genes are closely linked to the class I genes and the nucleolar organizer."The EMBO journal 7.9(1988):2775.)以增强HA在HVT感染的细胞内的抗原递呈反应效率，进而促进抗体上升速度和上升水平。

除了启动子的强弱是影响基因表达的一个重要因素，增加适当的调控元件也可有效提高外源基因的表达水平。适当的调控元件也可有效提高外源基因的表达水平。在目的基因的3'端添加土拨鼠转录后调控元件(Wood chuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)，可增加外源抗原基因表达水平(Zufferey,Romain,et al."Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors."Journal of virology 73.4(1999):2886-2892.)。

此外，多家跨国公司已经研制出以HVT为载体的商品化疫苗。其中，法国梅里亚公司的 HVT用来表达传染性法氏囊病(IBD)的VP2基因，即可用来预IBD，又能预防马立克氏病(MD)，目前已经在70多个国家销售使用。诗华公司的 HVT系列产品中， ND表达新城疫病毒(NDV)的F基因，用于预防ND和MD； AI表达clade2.2(A/swan/Hungary/4999/2006)H5N1的HA蛋白，用于预防不同亚型的H5高致病性禽流感和MD，保护率在80％-100％。目前已经在埃及，蒙古，越南等多个国家的家禽养殖业中投入使用，发挥了巨大的经济效益。

技术实现要素：

本发明目的在于重组一种表达禽流感嵌合血凝素蛋白HA的重组HVT载体疫苗，为当下流行和具有巨大公共卫生安全意义的H7N9病毒提供一种从源头上保护易感动物的疫苗免疫保护策略。

一种表达H7N9亚型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白HA的重组火鸡疱疹病毒株rHMW，是火鸡疱疹病毒血清3型FC126株重组毒株，其保藏号CGMCC NO.12984。

一种构建所述重组火鸡疱疹病毒株rHMW的方法，包括过下述步骤：(1)密码子优化过后并删除HA的跨膜和胞内区与MHCIss和MITD嵌合成MOHA，带有同源臂的pCMGFP(CN105002146A)质粒经EcoRV与Kpn2I双酶切，MOHA经EcoRV和NheI双酶切，HgB经NheI与Kpn2I双酶切，将三个片段进行三分子链接，转化后的阳性质粒命名为pMOHA；在质粒pMOHA的多克隆位点MSC插入WPRE质粒元件，连接完后的质粒，转化到Takala的JM109感受态细胞内37度培养过夜，挑斑提质粒双酶切和测序鉴定，阳性的质粒命名为pHMW。(图6)

(2)将中间转移阳性质粒pHMW与rHVT-GFP的DNA进行磷酸钙共转染-同源重组，重组得到的毒株命名为rHMW(图7)。

本发明中，外源抗原为禽流感亚型为H7N9，血凝素HA来自H7N9亚型禽流感毒株JX148(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)，并删除跨膜区和胞内区的核苷酸；并在5'端添加Gallus的MHCⅠ(B complex)的信号肽(MHCⅠss)序列和在3'端添加MHCⅠ的跨膜区和胞内区MITD的核苷酸序列，嵌合后的核苷酸序列在SEQIDNO:2中显示；在外源抗原后多克隆位点(MCS)插入WPRE基因。

本发明所述的rHMW构建方法如下

根据已有的JX148HA的序列(GISAID:EPI_ISL_235293；genebank:KY005878)，以及Gallus gallus(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)的密码子偏嗜频率，交由公司进行密码子优化合成JX148-OHA(SEQ ID NO:1)。密码子优化过程中，避开两端的酶切位点和平衡全长序列的GC含量。

HVT内源性gB启动子的预测分析与克隆。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)预测分析HVT的gB启动子，其特征为含有TATABox和CAATBox等真核启动子的阅读框。并根据预测分析的结果设计带有酶切位点和保护性碱基的引物PCR扩增HgB启动子。

嵌合抗原的构建。将OHA根据SMART MODE(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)跨膜区分析后，删除跨膜和胞内区(TM)，命名为OHA-TM。将鸡的MHCⅠss/MITD通过over-lapPCR的方式与删除TM后的OHA-TM融合连接，形成融合抗原MOHA(SEQ ID NO:2)。

中间转移质粒pHMW的构建。将合成的密码子优化过的MOHA和克隆的HgB使用相应的酶切后胶回收，并在带有同源臂的pCMGFP基础上依次进行连接替换HgB启动子和表达外源的MOHA基因，将阳性质粒命名为pMOHA(pHgB-MOHA)。并在该质粒的多克隆位点(MSC)插入WPRE(SEQ ID NO:4)质粒元件。连接完后的质粒，转化到Takala的JM109感受态细胞内37度培养过夜。挑斑提质粒双酶切和测序鉴定，阳性的质粒命名为pHMW(pHgB-MOHA-WPRE)；(如图6所示)。

将中间转移阳性质粒与rHVT-GFP的DNA进行磷酸钙共转染-同源重组。使用传统的酚氯仿法提取rHVT-GFP感染后病变80％-90％CEF的全基因组DNA，与中间转移质粒磷酸钙共转染次代CEF细胞(Morgan，1990)，待4-7天后出现病变蚀斑后，在荧光显微镜下筛选不带绿色荧光的蚀斑并标记，用枪头吸取少量胰酶后消化不带荧光的蚀斑，接种到次代CEF的96孔板上。经过3-5次的纯化后纯化出完全不带荧光的蚀斑，进行IFA鉴定，并提取DNA，PCR扩增后测序鉴定。将重组得到的毒株命名为rHMW；(如图7所示)。

本发明还公开了所述的重组火鸡疱疹病毒株rHMW在制备预防H7N9亚型禽流感病毒的疫苗中的用途。

附图说明

图1质粒构建策略

图2中间转移质粒pHMW图谱

图3 pHMW双酶切鉴定，(M为1000bp的marker，1为为酶切的质粒，2为经EcoRV和Kpn2I双酶切的结果)。

图4重组毒株的PCR鉴定，(M为1000bp的Marker，1为PCR结果)。

图5 rHMW的IFA结果(B)和阴性对照(A)

图6中间质粒的构建流程图

图7转染、重组以及筛选和鉴定示意图

本发明毒株rHMW于2016年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为火鸡疱疹病毒血清3型FC126株重组毒株；保藏号CGMCC NO.12984。

具体实施方式

材料

rHVT-GFP和pCMGFP由由扬州大学农业部畜禽传染病重点实验室构建保存(参见专利申请公布号：CN105002146A)。H7N9亚型禽流感JX148(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)(GISAID：EPI_ISL_235293),由扬州大学农业部畜禽传染病重点实验室分离保存，鸡胚效价为10，血凝抑制反应证明JX148的多抗血清与其他亚型的H7N9具有较高的交叉反应性。

High fidelity DNA polymerase、T4DNA连接酶、Agarose Gel DNA Extraction Kit购自Roche公司；质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

步骤一、密码子优化与合成

根据JX148HA的序列(EPI_ISL_235293)，交由南京金斯瑞公司参照鸡(Gallus gallus)的密码子偏嗜(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)进行密码子优化与合成optiHA(OHA)，添加酶切位点后克隆到UC57载体上，命名为UC57-OHA。

步骤二、扩增HVT的内源性gB启动子

使用DNeasy Blood tissue kit抽提FC126(GenBank:AF291866)的基因组DNA。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)在线预测分析启动子含有TAAT和CAAT等真核生物启动子的顺式作用元件。并合成引物，使用引物gB-F/R克隆FC126的gB启动子(HgB，SEQ ID NO:3)，启动子在首位末端均添加EcoRv和NheI限制性内切酶位点和保护性碱基。引物序列如下

gB-F:gatatcATTGTTCAATCATGATGTCCA(SEQ ID NO:5)

gB-R:gctagcGAGTTCCACCGACCGTATGA(SEQ ID NO:6)

PCR扩增(50μL反应体系)：以含有提前的基因组基因为模板，吸至0.5mL PCR反应管中，以引物gB-F和gB-R扩增gB启动子基因，具体操作方法如下：

PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃30s，56℃45s，72℃延伸2min，20个循环后72℃延伸10min，4℃保存。将PCR产物经电泳后切割含目的大小片段的凝胶，用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收纯化后与pCR-2.1T载体相连，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，提取质粒，经EcoR I酶切鉴定正确后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将序列测定正确的阳性质粒命名HgB(图2)。

步骤三、MHCⅠss/MITD的合成

MHCⅠss/MITD的序列在参考已发表的文献(Guillemot,Franpois等，1988)基础上，在MHCⅠss的5’端添加NheⅠ酶切位点和kozak序列(GCCACC)，同时在MITD的3’端添加Kpn II酶切位点，交由南京金斯瑞公司合成，并分别连接到UC57上。

步骤四、OHA的跨膜区预测和删除

使用SMART MODE(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)预测分析跨膜及胞内区(TM)，删除OHA的跨膜区和胞内区的第525至第561位氨基酸，仅保留第1至第524位的胞外抗原区。删除跨膜胞内区的OHA命名为OHA-TM。

步骤五、Over-lapPCR连接MHCⅠss/MITD与OHA-TM

设计引物将，使用over-lapPCR将MHCⅠss/MITD与OHA-TM连接起来组成一个嵌合抗原。PCR后胶回收并测序验证，连接后的嵌合抗原序列如SEQIDNO:2所示。将其命名为MOHA。

引物设计如下

MHCⅠss-F：GCTAGCGCCACCATGGGGCCGTGCG(SEQ ID NO:7)

MHCⅠss-R：CTGTGTGTTCATGGGGGCCGCCGC(SEQ ID NO:8)

OHA-TM-F：GCGGCGGCCCCCATGAACACACAGATCCTGGT(SEQ ID NO:9)

OHA-TM-R：GTGGCGGCTCCACATCTTTGTACCCGGAGC(SEQ ID NO:10)

MITD-F：TACAAAGATGTGGAGCCGCCACAGCCCAAC(SEQ ID NO:11)

MITD-R：TCCGGATTAGATGGCGGGGTTGCTC(SEQ ID NO:12)

PCR反应体系同上。

步骤六、中间转移质粒的构建

将MOH使用Nhe I和Kpn II双酶切，电泳后胶回收备用。将pCMGFP使用EcoRv和Nhe I双酶切后，电泳胶回收备用。在专利CN105002146A中所构建带有同源臂的中间质粒pCMGFP基础上(图1)，将将MOHA和HgB分别替换到上述质粒，并将测序鉴定好的阳性质粒重新命名为pHgB-MOHA。

步骤七、WPRE元件的插入

插入在外源抗原基因片段3’端的WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调节因子，SEQIDNO:4)能够无物种特异性的增强基因表达水平和抗原表达水平。WPRE元件扩增自Bac-HAMW(Chen,Chi-Yuan,et al."Baculovirus vector as an avian influenza vaccine:hemagglutinin expression and presentation augment thevaccineimmunogenicity."Journal of biotechnology 164.1(2013):143-150.)，由台湾清华大学陈育诚教授馈赠。设计扩增WPRE的引物，并在上游5’端添加XhoI酶切位点和下游3’端添加KnpI的酶切位点。引物序列如下

WPRE-F：ccgctcgagCGATAATCAACCTCTGGATTAC(SEQ ID NO:13)

WPRE-R：ttaggtaccCAAAGGGAGATCCGACTCGT(SEQ ID NO:14)

扩增后的WPRE元件电泳后胶回收，并使用XhoI和KnpI双酶切中间转移质粒pHMOH和扩增的WPRE元件。胶回收后，T4连接酶16℃连接过夜。转化后挑斑鉴定，将阳性的质粒命名为pHMW(图2)。阳性质粒经双酶切(图3)和测序鉴定。

步骤八、重组火鸡疱疹病毒的构建和纯化

(1)rHVT-GFP感染细胞DNA的制备

原代和次代CEF细胞按常规方法制备，在每瓶T75细胞培养瓶的次代CEF中接种105空斑形成单位(PFU)的重组rHVT-GFP病毒株、培养3-5天、等80％细胞产生典型的细胞病变后收获细胞、按照传统的酚氯仿方法提取HVT基因组。

(2)转移载体pHMW和rHVT-GFP基因组DNA共转染CEF细胞

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提转移载体pHMW质粒DNA。CEF按常规方法制备，在开始转染试验1h前制备次代CEF，每个60mm培养皿铺3x10⁶细胞，于37℃、5％CO2条件下培养。

在无菌的指形管中依次加入以下试剂：

同时需设不加转移载体pCMGFP质粒的HVT对照组，体系如下：

无菌超纯水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

TE 补足至25μL

混匀上述体系后，从管底缓慢加入31μL 2mol/L CaCl2溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na2HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管轻轻从管底吹出数个气泡，室温静置30min，形成CaP04-DNA混合物。向每个铺有次代CEF细胞的60mm培养皿中加入500μL CaP04-DNA复合物，轻轻摇匀，继续培养4h。弃掉培养基，每个细胞培养皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的体系按如下：

无菌超纯水 0.9mL

甘油 0.35mL

2xHBSP 1.25mL

混匀上述体系后作用1min后弃掉休克液，用维持液(V)培养基洗涤细胞，弃掉洗涤液，加入含4％胎牛血清的生长液(G)培养基，继续培养5-7d后用倒置荧光显微镜观察。

(3)重组病毒rHMW的筛选和纯化

将转染后的CEF用倒置荧光显微镜观察，标记出不带有绿色荧光的病毒空斑。弃掉培养基，用带有少许胰酶的吸管刮取病毒空斑，转移至10mL生长液(G)培养基中进行稀释，每一个病毒空斑接种一块已铺次代CEF细胞的96孔板，每孔接种l00μL稀释的病毒空斑，置于37℃、5％CO2条件下培养。重复上述步骤，直到96孔细胞培养板上所有的病毒空斑都不带有绿色荧光，并且组成每个病毒空斑的细胞都不带有荧光，说明重组病毒纯化完全，将该重组病毒命名为rHMW。外源基因MOHA的插入到HVT上的位点同专利CN105002146A。

步骤九、重组火鸡疱疹病毒的鉴定

间接免疫荧光试验(IFA)检测rHMW对外源抗原的表达：以rHMW感染次代CEF细胞，3-5天形成病毒空斑。

(1)收取细胞，使用试剂盒抽提DNA后，在同源臂上设计引物，PCR鉴定，并测序鉴定。PCR反应条件同上，PCR结果如图4所示。引物设计如下：

A-F：GCCGATAATTTGATATACGCAC(SEQ ID NO:15)

B-R：ATCTTCCACAGCTCCAGTTATT(SEQ ID NO:16)

(2)用冷甲醇固定细胞30分钟，PBS洗涤3次；加工作浓度的抗AIV HA多克隆抗体(H7血清)，37℃作用1小时，PBS洗涤2-3次；加工作浓度的抗鸡IgG/lgM荧光单抗，37℃作用1小时，用PBS洗涤2-3次；置荧光镜下观察，结果表明组成病毒空斑的所有细胞均带荧光(图5)。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 表达H7N9亚型禽流感病毒嵌合型血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHMW及构

建方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacacac agatcctggt gttcgccctg attgctatca ttcccactaa tgctgacaag 60

atctgcctgg ggcaccacgc agtgagcaac ggcaccaaag tgaataccct gacagagaga 120

ggagtggaag tggtgaacgc aactgagacc gtggaaagga ctaatatccc tcgcatttgc 180

agcaagggga agaaaaccgt ggatctgggc cagtgcggac tgctggggac aatcactggc 240

ccccctcagt gcgaccagtt cctggagttt agcgctgatc tgatcattga gagaagggaa 300

ggatccgacg tgtgctaccc tgggaagttc gtgaacgagg aagcactgcg gcagatcctg 360

agagagagcg gcggaattga taaagaagcc atggggttta cttactccgg catcagaacc 420

aatggagcaa ccagcgcatg caggaggtcc gggagctcct tctacgccga gatgaagtgg 480

ctgctgagca acaccgacaa tgccgctttt ccccagatga ctaagagcta caaaaacacc 540

agaaaatccc ctgccctgat cgtgtggggc attcaccaca gcgtgtccac agctgaacag 600

actaagctgt acggaagcgg gaacaaactg gtgacagtgg gaagctccaa ttaccagcag 660

agcttcgtgc catccccagg agcaaggcca caggtgaacg gactgagcgg ccgcatcgac 720

tttcactggc tgatgctgaa ccctaatgat accgtgacat tcagctttaa tggcgctttc 780

atcgcaccag accgggcttc ctttctgaga ggcaagagca tgggaattca gtccggggtg 840

caggtggacg caaactgcga gggagattgc taccacagcg ggggcacaat catttccaac 900

ctgccattcc agaatatcga tagcagggca gtgggaaagt gcccaagata cgtgaaacag 960

cgctccctgc tgctggctac tggaatgaag aacgtgcctg agatcccaaa aggccgggga 1020

ctgttcggcg ctatcgcagg atttattgag aacgggtggg aaggcctgat tgacggatgg 1080

tacgggttta gacaccagaa tgctcagggg gagggcacag cagccgacta caagagcact 1140

cagtccgcaa tcgatcagat taccggaaag ctgaacaggc tgatcgaaaa aacaaatcag 1200

cagttcgagc tgattgacaa cgaatttaat gaggtggaaa aacagatcgg gaacgtgatt 1260

aattggaccc gcgatagcat cacagaagtg tggtcctaca acgccgagct gctggtggct 1320

atggaaaatc agcacaccat tgacctggcc gatagcgaga tggacaagct gtacgaaaga 1380

gtgaaaaggc agctgcgcga gaacgctgag gaagatggaa ccgggtgctt cgaaatcttt 1440

cacaagtgcg atgacgattg catggcaagc attaggaaca atacatacga tcactccaaa 1500

taccgggagg aagccatgca gaacagaatc cagattgacc ctgtgaagct gagctccggg 1560

tacaaagatg tgatcctgtg gttcagcttt ggcgcatcct gcttcatcct gctggccatt 1620

gtgatgggcc tggtgtttat ttgcgtgaag aacggaaata tgcgctgcac aatctgcatt 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 1800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggggccgt gcggggcgct gggcctgggg ctgctgctcg ccgccgtgtg cggggcggcg 60

gcccccatga acacacagat cctggtgttc gccctgattg ctatcattcc cactaatgct 120

gacaagatct gcctggggca ccacgcagtg agcaacggca ccaaagtgaa taccctgaca 180

gagagaggag tggaagtggt gaacgcaact gagaccgtgg aaaggactaa tatccctcgc 240

atttgcagca aggggaagaa aaccgtggat ctgggccagt gcggactgct ggggacaatc 300

actggccccc ctcagtgcga ccagttcctg gagtttagcg ctgatctgat cattgagaga 360

agggaaggat ccgacgtgtg ctaccctggg aagttcgtga acgaggaagc actgcggcag 420

atcctgagag agagcggcgg aattgataaa gaagccatgg ggtttactta ctccggcatc 480

agaaccaatg gagcaaccag cgcatgcagg aggtccggga gctccttcta cgccgagatg 540

aagtggctgc tgagcaacac cgacaatgcc gcttttcccc agatgactaa gagctacaaa 600

aacaccagaa aatcccctgc cctgatcgtg tggggcattc accacagcgt gtccacagct 660

gaacagacta agctgtacgg aagcgggaac aaactggtga cagtgggaag ctccaattac 720

cagcagagct tcgtgccatc cccaggagca aggccacagg tgaacggact gagcggccgc 780

atcgactttc actggctgat gctgaaccct aatgataccg tgacattcag ctttaatggc 840

gctttcatcg caccagaccg ggcttccttt ctgagaggca agagcatggg aattcagtcc 900

ggggtgcagg tggacgcaaa ctgcgaggga gattgctacc acagcggggg cacaatcatt 960

tccaacctgc cattccagaa tatcgatagc agggcagtgg gaaagtgccc aagatacgtg 1020

aaacagcgct ccctgctgct ggctactgga atgaagaacg tgcctgagat cccaaaaggc 1080

cggggactgt tcggcgctat cgcaggattt attgagaacg ggtgggaagg cctgattgac 1140

ggatggtacg ggtttagaca ccagaatgct cagggggagg gcacagcagc cgactacaag 1200

agcactcagt ccgcaatcga tcagattacc ggaaagctga acaggctgat cgaaaaaaca 1260

aatcagcagt tcgagctgat tgacaacgaa tttaatgagg tggaaaaaca gatcgggaac 1320

gtgattaatt ggacccgcga tagcatcaca gaagtgtggt cctacaacgc cgagctgctg 1380

gtggctatgg aaaatcagca caccattgac ctggccgata gcgagatgga caagctgtac 1440

gaaagagtga aaaggcagct gcgcgagaac gctgaggaag atggaaccgg gtgcttcgaa 1500

atctttcaca agtgcgatga cgattgcatg gcaagcatta ggaacaatac atacgatcac 1560

tccaaatacc gggaggaagc catgcagaac agaatccaga ttgaccctgt gaagctgagc 1620

tccgggtaca aagatgtgga gccgccacag cccaacctgg tgcccatcgt ggcgggggtg 1680

gccgtcgcca ttgtggccat tgccatcatg gttggtgttg gattcatcat ctacagacgc 1740

catgcaggga agaaggggaa gggctacaac atcgcgcccg ggagcaaccc cgccatctaa 1800

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcgttttgc ccaaccctcg aatacggctt tatatttcag tgtggaaaat gtaggcctcc 60

tgcctcactt gaaggaagaa atggcacgat ttatgttaca gtgcaacaac acatcaagtt 120

ggataataag taaatttagg gggttttacg attttggtgg agtggataat ataaccaccg 180

cacatagaat ggcatggaaa tatatacgag agttgatttt ggcgactgcc ctttttgcat 240

ccgtgttcaa atgtggcgat ttgcaggtgt gtcgtgccga tggcttacag ctaacattgg 300

ggggggagta catttgggag gatggagtat atctgacata cgagaccgat tgtcctctcg 360

tagcacttat cgggtgtagg gcttatctaa cccacaatca atccccgacc gttctcgttg 420

acacggatgt tttttccttg ctttattcta ttttgcagtt tatggctccc gctacggcgg 480

atcagttacg atcggatcgg tttagtaata gccacaccca caattgacct aggtcaatat 540

cgttaggact ttagtatttt gattcatacg gtcggtggaa ctcatgctta tgactcctac 600

aatgaagtac tttaatcggt ctttatttat ttttctcacc ccaatcttat ccatcgcgac 660

ctcagaaatt aaattaccaa atgtgacagc gcgagaaatt gtttcgggca tacagctatc 720

cgaagacgag acgacatttt ac 742

<210> 4

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 60

tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 120

ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 180

gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 240

cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 300

ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 360

gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct 420

gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 480

cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 540

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gatatcattg ttcaatcatg atgtcca 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctagcgagt tccaccgacc gtatga 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctagcgcca ccatggggcc gtgcg 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctgtgtgttc atgggggccg ccgc 24

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<212> DNA

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<400> 9

gcggcggccc ccatgaacac acagatcctg gt 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtggcggctc cacatctttg tacccggagc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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tccggattag atggcggggt tgctc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccgctcgagc gataatcaac ctctggatta c 31

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ttaggtaccc aaagggagat ccgactcgt 29

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<213> 人工序列

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gccgataatt tgatatacgc ac 22

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<213> 人工序列

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atcttccaca gctccagtta tt 22