本发明涉及一种流感病毒疫苗的生产方法，属于生物领域，特别是细胞培养领域。
背景技术：
：Vero细胞于1962年从正常的成年非洲绿猴肾细胞获得的转化细胞。该细胞是贴壁依赖性的成纤维细胞。它能支持多种病毒的增殖，包括乙型脑炎、脊髓灰质炎、狂犬病等病毒，已被准许用于生产人用病毒疫苗。Vero细胞是世界卫生组织批准的最普遍用于病毒疫苗生产的连续细胞系，早在20世纪80年代，梅里埃研究所(法国里昂)的Montagnon及其同事就已经将Vero细胞首次用于人用疫苗IPV的生产上。随后便被用于灭活狂犬疫苗，口服的活脊髓灰质炎疫苗的生产，至今已有30多年的历史。最近几年以Vero细胞为基质的疫苗生产活动日趋强化。Vero细胞的无血清培养基已经有较多的研究，但是都存在成本偏高，需要添加过多昂贵生长激素的缺点，放大培养后其密度不高。中国专利201210313363.1公开过一种适用于Vero细胞微载体悬浮培养的培养基及方法，其细胞培养密度最高达到6.5×106细胞数/毫升，但是该培养基仍然存在成分复杂，成本高的缺点，细胞培养密度也有进一步改进的需求。新橙皮苷二氢查尔酮（简称NHDC）是从柑橘类天然植物中提取的新橙皮苷经过氢化而成的黄酮类衍生物，是一种具有苦味抑制和风味改良的功能性甜味剂。产品特点：1、甜度高，热量小。其特点在于甜度大（蔗糖甜度的1500-1800倍），口感清爽，余味持久，并具有极佳的屏蔽苦味的功效。新橙皮苷二氢查尔酮外观为类白色至微黄色结晶性粉末，无臭。甜度约为蔗糖的1500～1800倍，其显甜时间略迟于糖精钠而远快于甘草甜素(5：7：23s)，三者的留甜时间为42：57：133s，也介于两者之间，故较接近于糖精钠。溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚和苯。新橙皮苷二氢查尔酮的结构式为：新橙皮苷二氢查尔酮（简称NHDC）成本低廉，本发明人意外发现该物质在Vero细胞的无血清培养基中用以生产流感病毒疫苗，可以减少昂贵生长激素的添加，具体而言，不需要添加重组人表皮生长因子，并且容易达到高密度，同时病毒效价高，病毒包膜完整，产品品质优异而生产成本低廉。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种查尔酮在vero细胞生产流感病毒中的应用，本发明人意外发现该物质在Vero细胞的无血清培养基中应用，可以减少昂贵生长激素的添加，并且容易达到高密度，同时病毒效价高，病毒包膜完整，产品品质优异而生产成本低廉。一种流感病毒疫苗的生产方法，其步骤如下:（1）制备培养基：以下含量以毫克/升计为：新橙皮苷二氢查尔酮0.8-1.5L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-异亮氨酸225L-亮氨酸80-100L-缬氨酸100L-精氨酸盐酸盐650-800L-赖氨酸320-350L-蛋氨酸60L-谷氨酸50-82L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺800-1000甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸65-68L-丝氨酸290L-苏氨酸50～300L-谷氨酰胺650-690维生素C60-99烟酰胺8核黄素0.6盐酸硫胺素3.5氯化胆碱9D-泛酸钙0.3叶酸3.8六水氯化镁50无水硫酸镁55无水氯化钙100氯化钾450氯化钠5000一水磷酸二氢钠200磷酸氢二钠150甘氨酸铁0.01五水硫酸铜0.0001～0.002；酵母浸膏8000；亚油酸0.01～0.1亚麻酸0.08-0.1；碳酸氢钠3000D-葡萄糖3000～6000次黄嘌呤钠盐6硫辛酸0.1～0.4；（2）使用上述培养基，将Vero细胞以0.3×106细胞数/毫升密度接种于5升搅拌式生物反应器中，cytodex-1微载体浓度为4克/升，在细胞密度达到10.8*106细胞数/毫升直接按照M.O.I为0.01接种流感病毒，维持70小时即收获。新橙皮苷二氢查尔酮的结构式为：本发明的有益之处在于：本发明公开了一种查尔酮在vero细胞生产流感病毒中的应用，本发明人意外发现该物质在Vero细胞的无血清培养基中应用，可以减少昂贵生长激素的添加，并且容易达到高密度，同时病毒效价高，病毒包膜完整，产品品质优异而生产成本低廉。附图说明附图为本发明实施例3达到细胞最大密度时的细胞形态电镜观察。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：实施例所用流感病毒A1(A/NEW/CALEDONIA/20/99)来自NIBSC。（1）制备下述培养基，其特征在于其包括如下组分，以下含量以毫克/升计为：新橙皮苷二氢查尔酮0.8L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-异亮氨酸225L-亮氨酸100L-缬氨酸100L-精氨酸盐酸盐650L-赖氨酸350L-蛋氨酸60L-谷氨酸50L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺1000甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸65L-丝氨酸290L-苏氨酸300L-谷氨酰胺650维生素C99烟酰胺8核黄素0.6盐酸硫胺素3.5氯化胆碱9D-泛酸钙0.3叶酸3.8六水氯化镁50无水硫酸镁55无水氯化钙100氯化钾450氯化钠5000一水磷酸二氢钠200磷酸氢二钠150甘氨酸铁0.01五水硫酸铜0.0001；酵母浸膏8000；亚油酸0.1亚麻酸0.08；碳酸氢钠3000D-葡萄糖6000次黄嘌呤钠盐6硫辛酸0.1（2）使用上述培养基，将Vero细胞以0.3×106细胞数/毫升密度接种于5升搅拌式生物反应器中，cytodex-1微载体浓度为4克/升，在细胞密度达到5.8*106细胞数/毫升直接按照M.O.I为0.01接种流感病毒，维持70小时即收获。反应器参数设置：温度为37℃、pH值为7.2、溶氧为40％饱和空气、搅拌速度为65转/分钟，依据残糖浓度更换新鲜培养液，用结晶紫法计数活细胞密度。实施例2：（1）制备下述培养基，其特征在于其包括如下组分，以下含量以毫克/升计为：新橙皮苷二氢查尔酮1.5L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-异亮氨酸225L-亮氨酸80L-缬氨酸100L-精氨酸盐酸盐800L-赖氨酸320L-蛋氨酸60L-谷氨酸82L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺800甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸68L-丝氨酸290L-苏氨酸50L-谷氨酰胺690维生素C60烟酰胺8核黄素0.6盐酸硫胺素3.5氯化胆碱9D-泛酸钙0.3叶酸3.8六水氯化镁50无水硫酸镁55无水氯化钙100氯化钾450氯化钠5000一水磷酸二氢钠200磷酸氢二钠150甘氨酸铁0.01五水硫酸铜0.002；酵母浸膏8000；亚油酸0.01亚麻酸0.1；碳酸氢钠3000D-葡萄糖3000次黄嘌呤钠盐6硫辛酸0.4。（2）使用上述培养基，将Vero细胞以0.3×106细胞数/毫升密度接种于5升搅拌式生物反应器中，cytodex-1微载体浓度为4克/升，在细胞密度达到5.8*106细胞数/毫升直接按照M.O.I为0.01接种流感病毒，维持70小时即收获。反应器参数设置：温度为37℃、pH值为7.2、溶氧为40％饱和空气、搅拌速度为65转/分钟，依据残糖浓度更换新鲜培养液，用结晶紫法计数活细胞密度。实施例3：（1）制备下述培养基，其特征在于其包括如下组分，以下含量以毫克/升计为：新橙皮苷二氢查尔酮1.0L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-异亮氨酸225L-亮氨酸90L-缬氨酸100L-精氨酸盐酸盐750L-赖氨酸340L-蛋氨酸60L-谷氨酸70L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺900甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸67L-丝氨酸290L-苏氨酸145L-谷氨酰胺670维生素C83烟酰胺8核黄素0.6盐酸硫胺素3.5氯化胆碱9D-泛酸钙0.3叶酸3.8六水氯化镁50无水硫酸镁55无水氯化钙100氯化钾450氯化钠5000一水磷酸二氢钠200磷酸氢二钠150甘氨酸铁0.01五水硫酸铜0.001；酵母浸膏8000；亚油酸0.02亚麻酸0.09；碳酸氢钠3000D-葡萄糖4000次黄嘌呤钠盐6硫辛酸0.3。（2）使用上述培养基，将Vero细胞以0.3×106细胞数/毫升密度接种于5升搅拌式生物反应器中，cytodex-1微载体浓度为4克/升，在细胞密度达到5.8*106细胞数/毫升直接按照M.O.I为0.01接种流感病毒，维持78小时即收获。反应器参数设置：温度为37℃、pH值为7.2、溶氧为40％饱和空气、搅拌速度为65转/分钟，依据残糖浓度更换新鲜培养液，用结晶紫法计数活细胞密度。实施例4：流感病毒滴度的测定将待检病毒样品在96孔组织培养板的A～G行每孔相邻5列加入90μLDMEM，10%FBS培养液。A行每孔加入10μL待检病毒样品，多通道移液器混合3～5次，然后从每孔转移10μL至B行相应孔内，再次混合，依次稀释样品至G行，然后每孔加入2．5×105MDCK细胞，置于湿化33℃，5%CO2培养箱过夜后吸除每孔培养液，加200μLDMEM/0．0002%(m/V)胰蛋白酶，置于湿化33℃，5%CO2培养箱培养3d。加50μL1%鸡血红细胞悬液至所有孔内，记录每孔样品凝集样式并计算50%细胞感染计量(TCID50)实验结果如下：病毒血凝滴度HAU实施例11:640实施例21:640实施例31：1280可见，本发明的培养的流感病毒效价高，成本低。实施例5：收获后对病毒颗粒进行电镜观察，结果如附图所示，可见流感病毒包膜结构清楚，呈现出完整、典型的流感病毒颗粒状态。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包括于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3