本发明涉及一种香豆素苯基异噁唑衍生物及其用途，该类化合物经过抗白癜风和抗菌活性筛选，化合物6a-6o用于临床上制备治疗白癜风的药物。化合物6d-6f，6i，6l-6n用于临床上制备治疗白色念珠菌(Candida albicans)感染的药物。
背景技术：
白癜风是一种常见的自发或特发性的色素脱失性皮肤病，被称为世界皮肤病三大顽症之一，困扰全世界5000万以上的患者。在世界不同地域、不同种族间发病率从0.1％-8％不等，我国一般人群患病率为0.56％左右，大约一半患者于20周岁以前发病，男性和女性的患病率相等。白癜风主要表现为皮肤、粘膜的白斑及灰/白色毛发等。西医认为白癜风是由于皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶系统的功能减退、丧失而引起的。
补骨脂为豆科一年生草本植物补骨脂(Psoralea corylifolia L.)的干燥成熟果实，收载于《中国药典》、《维吾尔药志》、《中华本草-维吾尔分卷》等，是历代传统维吾尔医治疗白癜风的主要经典药物。维吾尔医学认为白癜风主要由异常粘液质引起，治疗时主张清除异常体液，纠正异常气质，从而恢复机体自然力。补骨脂具有生干生热、清除异常黏液质、净血解毒、增加色素、杀驱肠虫等功效。此外，补骨脂还具有抗菌、雌激素样作用、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和抗抑郁等多种生物活性。
目前以植物补骨脂为主要成分的药物和制剂，临床上主要用于治疗白癜风：如复方补骨脂颗粒、补骨脂注射液、复方补骨脂酊、驱白巴布斯片、复方卡力孜然酊(维药名维阿露)等。尽管维药治疗白癜风效果显著，优势明显，但是其物质基础研究薄弱，作用机制和体内外代谢过程亦不明晰，严重的制约了其二次开发。
经过多年研究，国内外研究人员已经从补骨脂(Psoralea corylifolia L.)中分离出香豆素类化合物、黄酮类、萜类、以及少量脂类和挥发油。其中香豆素类化合物作为其中的主要化学成分，研究范围最广。
大量研究和病例证实，口服或外用香豆素类化合物后，再配合日光或长波紫外线(UVA)照射，可以治疗白癜风。此种疗法能够激活酪氨酸酶活性，催化黑素合成，促进黑素细胞的分裂及移动，最终使黑色素合成增加，白斑颜色逐渐恢复，从而达到治疗白癜风的目的。
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本发明在国内外有关专利、文献的综合分析和本课题组前期研究工作的基础上，对该植物中的抗白癜风活性化合物—香豆素，进行了进一步的改造和修饰，通过烃化反应将苯基取代的异噁唑等引入到香豆素分子中，提高其成药性，并研究了这些苯基异噁唑衍生物对小鼠B16细胞中黑素生成的影响，以期发现疗效显著、靶点明确、作用机理清晰的抗白癜风新药；除此以外，还研究了这些衍生物对白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用，以期发现具有抗菌活性的候选药物。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种香豆素苯基异噁唑衍生物及其用途。该类化合物以4′-羟基查尔酮为原料，在碳酸钾的催化下，与含有不同取代基的溴甲基异噁唑反应得到15个香豆素苯基异噁唑衍生物。并考察了这15个香豆素苯基异噁唑衍生物对小鼠B16细胞中黑素生成的影响和对白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)三种细菌的抑制作用。抗白癜风结果显示：与阴性对照相比，得到的15个化合物(6a-6o)均可促进B16细胞中黑素的生成，且促进作用从115％到390％不等；与阳性对照相比，化合物6b-6f、6j-6o对黑素生成的促进作用均优于阳性对照，其中化合物6f对黑素生成的促进作用是阳性对照的2.6倍。)均可用于临床上制备治疗白癜风的药物。抗菌结果显示：化合物(6d-6f，6i，6l-6n)对白色念珠菌(Candida albicans)有抑制作用，且6e-6f，6l-6m的活性接近阳性对照两性霉素B；香豆素苯基异噁唑衍生物6d-6f，6i，6l-6n可用于临床上制备治疗白色念珠菌(Candida albicans)感染的药物。
本发明所述的一种香豆素苯基异噁唑衍生物的结构式为：
其中：
化合物6a为7-((3-(4-氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6b为7-((3-苯基异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6c为7-((3-(4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6d为7-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6e为7-((3-(3,4-二氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6f为7-((3-(3,5-二氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6g为7-((3-(4-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6h为7-((3-(2-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6i为7-((3-(3-氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6j为7-((3-(3-三氟甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6k为7-((3-(1,4-苯并二恶烷-6-基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6l为7-((3-(3,4-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6m为7-((3-(3,5-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6n为7-((3-(3-氟-4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮；
化合物6o为7-((3-(2-氟-5-碘苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮。
本发明所述的一种香豆素查尔酮异恶唑衍生物，其结构如通式(I)所示：
其中R分别为4-氟、氢、4-氯、3-氯、3,4-二氯、3,5-二氯、4-甲氧基、2-甲氧基、3-氟、2-三氟甲氧、3,4-[1,4]e二恶烷基、3,4-二氟、3,5-二氟、3-氟-4-氯、2-氟-5-碘。
本发明所述的香豆素苯基异噁唑衍生物及其用途，其中补香豆素苯基异噁唑衍生物的制备方法，按下列步骤进行：
a、在室温条件下，将4-甲基伞形酮、含有R取代基的溴甲基异噁唑和干燥碳酸钾溶解在20ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h；
b、TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1-4∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得香豆素苯基异噁唑衍生物6a-6o，化学反应式为：
(i)盐酸羟胺，碳酸钠，30％甲醇水溶液，室温；(ii)N-氯代丁二酰亚胺，丙炔醇，三乙胺，二氯甲烷，回流；(iii)三溴化磷，二氯甲烷，温度0℃；(iv)乙酰乙酸乙酯，浓硫酸，温度60℃；(v)碳酸钾，丙酮，回流；
其中R分别为4-氟、氢、4-氯、3-氯、3,4-二氯、3,5-二氯、4-甲氧基、2-甲氧基、3-氟、2-三氟甲氧、3,4-[1,4]e二恶烷基、3,4-二氟、3,5-二氟、3-氟-4-氯、2-氟-5-碘。
具体实施方式
依据实施例对本发明进一步说明，但本发明不仅限于这些实施例；
试剂：所有试剂均为市售的分析纯；
实施例1
3-取代苯基-5-溴甲基异噁唑的制备(4a-4o)：
1.1 取代苯甲醛肟(2a-2o)的合成：
将10.0mmol含不同R取代的苯甲醛溶解在30mL 30％甲醇水溶液中，搅拌下加入695mg(10.0mmol)NH2OH·HCl，溶解后缓慢加入530mg(5.0mmol)Na2CO3，室温反应2h，然后加入30mL蒸馏水和30mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，减压蒸除溶剂得相应的取代苯甲醛肟2a-2o，未经分离纯化直接进行下步反应；
1.2 3-取代苯基-5-羟甲基异噁唑(3a-3o)的合成：
将10.0mmol含不同R取代的苯甲醛肟(2a-2o)溶于30mL二氯甲烷中，搅拌下分批加入1.60g(12.0mmol)N-氯代丁二酰亚胺(NCS)，微微加热至N-氯代丁二酰亚胺全部溶解后，滴加0.56g(10.0mmol)2-丙炔-1-醇，随后滴加1.01g(10.0mmol)三乙胺，加热回流，TLC指示反应终点，反应完成后，冷却至室温，母液水洗，无水Na2SO4干燥，过滤，减压蒸除溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1-2∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得相应的3-取代苯基-5-羟甲基异噁唑3a-3o；
1.3 3-取代苯基-5-溴甲基异噁唑(4a-4o)的合成：
将10.0mmol含不同R取代的3-取代苯基-5-羟甲基异噁唑(3a-3o)置于20ml干燥的二氯甲烷中，冰浴下搅拌使其溶解，缓慢滴加0.95mL(10.0mmol)三溴化磷，滴加完毕后继续在冰浴下反应，TLC指示反应结束后，向反应体系中加入20mL蒸馏水，并用10％NaOH调节pH至中性，30mL二氯甲烷萃取2次，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1-5∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得相应的3-取代苯基-5-溴甲基异噁唑4a-4o。
实施例2
4-甲基伞形酮(化合物5)的制备：
在冰浴条件下，将2.0g(18.2mmol)间苯二酚溶解在二氧六环溶液中，缓慢滴加0.5ml浓硫酸，并使反应液温度不超过20℃。待滴加完毕后，继续向反应液中加入2.8g(21.8mmol)乙酰乙酸乙酯，并加热至60℃，TLC检测原料全部消失后，反应液倒入冰水中，析出大量固体，过滤，干燥得粗品，甲醇重结晶后得到2.87g 4-甲基伞形酮(化合物5)。
实施例3
7-((3-(4-氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6a)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.307g(1.2mmol)3-(4-氟)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至温度56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比6∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.284g化合物6a。
7-((3-(4-氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6a)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.76(m,2H),7.55(d,J＝8.6Hz,1H),7.15(t,J＝8.6Hz,2H),6.98-6.91(m,2H),6.66(s,1H),6.18(s,1H),5.27(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.37,165.19,162.70,160.46,155.12,152.31,130.91,128.82,125.92,116.15,112.60,102.07,101.95,61.46,18.69。
实施例4
7-((3-苯基异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6b)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.286g(1.2mmol)3-苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.286g化合物6b。
7-((3-苯基异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6b)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.77(m,2H),7.54(d,J＝8.7Hz,1H),7.50-7.43(m,3H),6.98-6.91(m,2H),6.69(s,1H),6.17(s,1H),5.27(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.29,162.76,161.07,160.65,159.02,155.26,152.41,130.40,129.12,127.00,126.04,114.72,112.82,112.52,102.17,61.62,18.82。
实施例5
7-((3-(4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6c)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.328g(1.2mmol)3-(4-氯)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比6∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.301g化合物6c。
7-((3-(4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6c)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝8.5Hz,2H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.44(d,J＝8.5Hz,2H),6.97-6.90(m,2H),6.67(s,1H),6.18(s,1H),5.27(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.66,161.80,161.05,160.58,155.27,152.40,136.50,129.43,128.27,127.18,126.07,114.77,112.88,112.52,102.22,101.93,61.59,18.83。
实施例6
7-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6d)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.328g(1.2mmol)3-(3-氯)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.297g化合物6d。
7-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6d)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61-7.50(m,3H),7.48-7.40(m,1H),7.16(td,J＝8.3,2.5,1H),6.98-6.91(m,2H),6.68(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.73,164.38,161.05,160.57,155.28,152.39,130.80,126.07,122.75,117.47,117.26,114.78,114.14,113.92,112.89,112.51,102.14,61.59,18.83。
实施例7
7-((3-(3,4-二氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6e)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.368g(1.2mmol)3-(3,4-二氯)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.322g化合物6e。
7-((3-(3,4-二氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6e)的核磁谱图：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68-7.62(m,1H),7.57-7.52(m,3H),6.98-6.91(m,2H),6.67(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.93,164.86,160.74,159.36,155.13,152.24,131.07,130.23,128.67,127.31,125.93,114.67,112.78,112.35,102.05,101.68,61.42,18.68。
实施例8
7-((3-(3,5-二氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6f)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.368g(1.2mmol)3-(3,5-二氯)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.310g化合物6f。
7-((3-(3,5-二氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6f)的核磁谱图：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(d,J＝1.5Hz,2H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.45(s,1H),6.97-6.90(m,3H),6.67(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.24,161.02,160.47,159.56,155.28,152.37,135.92,131.51,130.30,126.90,126.11,125.43,114.85,112.95,112.48,102.21,101.87,61.57,18.84。
实施例9
7-((3-(4-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6g)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.322g(1.2mmol)3-(4-甲氧基)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比6∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.291g化合物6g。
7-((3-(4-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6g)的核磁谱图：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝8.8Hz,2H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.01-6.90(m,4H),6.63(s,1H),6.17(d,J＝0.6Hz,1H),5.26(s,2H),3.86(s,3H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.00,162.35,161.34,161.09,160.68,155.27,152.42,128.42,126.02,121.18,114.61,112.81,112.52,102.26,101.87,61.65,55.52,18.82。
实施例10
为7-((3-(2-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6h)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.322g(1.2mmol)3-(2-甲氧基)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.286g化合物6h。
7-((3-(2-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6h)的核磁谱图：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(dd,J＝7.7,1.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.43(td,J＝8.5,1.6Hz,1H),7.07-6.93(m,4H),6.90(s,1H),6.17(s,1H),5.26(s,2H),3.91(s,3H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.78,161.15,160.84,160.40,157.36,155.27,152.46,131.60,129.66,125.96,121.14,117.63,114.60,112.71,111.59,105.82,102.24,61.59,55.74,18.83。
实施例11
7-((3-(3-氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6i)的制备方法：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.307g(1.2mmol)3-(3-氟)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比6∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.275g化合物6i。
7-((3-(3-氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6i)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61-7.50(m,3H),7.48-7.40(m,1H),7.16(td,J＝8.3,2.5,1H),6.98-6.91(m,2H),6.68(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.73,164.38,161.05,160.57,155.28,152.39,130.80,126.07,122.75,117.47,117.26,114.78,114.14,113.92,112.89,112.51,102.14,61.59(s),18.83(s)。
实施例12
7-((3-(3-三氟甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6j)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.386g(1.2mmol)3-(3-三氟甲氧基)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h。TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.321g化合物6j。
7-((3-(3-三氟甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6j)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(s,1H),7.58-7.47(m,2H),7.35-7.29(m,1H),6.98-6.91(m,2H),6.70(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.93,161.59,161.05,160.55,159.49,155.28,152.39,149.83,130.66,126.09,125.36,122.73,119.60,114.80,112.90,112.50,102.23,101.99,61.58,18.83。
实施例13
7-((3-(1,4-苯并二恶烷-6-基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6k)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.355g(1.2mmol)3-(1,4苯并二恶烷-6-基)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.348g化合物6k。
7-((3-(1,4-苯并二恶烷-6-基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6k)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73-7.67(m,1H),7.53(d,J＝8.8,2H),7.35-7.26(m,2H),6.97-6.90(m,2H),6.59(s,1H),6.17(s,1H),5.24(s,2H),4.29(s,4H),2.40(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.89,167.02,162.23,161.10,160.67,155.26,152.43,145.53,143.99,132.59,131.01,128.94,126.02,122.00,120.38,117.96,116.04,114.69,112.80,112.51,102.26,101.96,64.65,64.43,61.62,18.82。
实施例14
7-((3-(3,4-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6l)的制备方法：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.329g(1.2mmol)3-(3,4-二氟)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.317g化合物6l。
7-((3-(3,4-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6l)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70-7.62(m,1H),7.58-7.51(m,2H),7.30-7.22(m,1H),6.98-6.90(m,2H),6.64(s,1H),6.18(s,1H),5.27(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.97,161.03,160.53,155.27,152.39,126.09,123.45,118.26,118.08,116.31,116.12,114.80,112.90,112.50,102.20,101.84,61.56,18.82。
实施例15
7-((3-(3,5-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6m)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.329g(1.2mmol)3-(3,5-二氟)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.308g化合物6m。
7-((3-(3,5-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6m)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.34(d,J＝6.2Hz,2H),6.99-6.87(m,3H),6.66(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.20,161.02,160.49,155.28,152.38,126.10,114.84,112.94,112.50,110.26,110.00,106.01,105.76,105.51,102.21,101.93,77.48,77.16,76.84,61.55,18.83。
实施例16
7-((3-(3-氟-4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6n)的制备方法：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.348g(1.2mmol)3-(3-氟-4-氯)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.293g化合物6n。
7-((3-(3-氟-4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6n)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝9.7Hz,1H),7.58-7.46(m,3H),6.98-6.90(m,2H),6.66(s,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.07,161.03,160.51,155.28,152.38,131.46,126.10,123.39,115.27,115.04,114.82,112.93,112.50,102.21,101.87,61.56,18.83。
实施例17
7-((3-(2-氟-5-碘苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6o)的制备：
在室温条件下，将0.176g(1mmol)4-甲基伞形酮、0.457g(1.2mmol)3-(2-氟-5-碘)苯基-5-溴甲基异噁唑和0.414g(3.0mmol)干燥碳酸钾溶解在50ml干燥的丙酮中，加热至56℃，使其回流反应4h，用TLC检测反应完全后，停止反应并过滤，滤液真空脱溶剂，将残渣采用洗脱剂为体积比8∶1的石油醚∶乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得0.333g化合物6o。
7-((3-(2-氟-5-碘苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(化合物6o)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(dd,J＝6.7,2.0Hz,1H),7.76-7.69(m,1H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.01-6.90(m,3H),6.82(d,J＝3.3Hz,1H),6.18(s,1H),5.28(s,2H),2.41(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.51,161.12,160.58,156.88,155.24,152.48,140.73,137.75,136.42,126.05,118.80,117.65,114.74,112.59,104.52,102.18,61.47,18.82。
实施例18
所述的香豆素苯基异噁唑衍生物在制备治疗白癜风药物中的用途，将实施例2-17获得的化合物5和化合物6a-6o对B16黑素瘤细胞的黑素合成的作用测定：
(1)筛选模型：小鼠B16黑素瘤细胞；
(2)细胞来源：中科院细胞库提供；
(3)培养条件：10％胎牛血清、1％双抗的高糖DMEM培养基来培养细胞24h后加入不同浓度的药物和阳性对照，分别在48h和72h测定酪氨酸活性和黑素含量；
(4)测定方法：
蛋白定量用Bradford法测定：
完全溶解蛋白标准品(5mg/mlBSA)，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％NaCl或PBS稀释标准品；将稀释后标准品(0.5mg/mlBSA)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液将所有标准品补足到20μl；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μl；各孔加入200μl Bradford染色液，用加样枪轻轻吹打混匀(注意不要弄出气泡影响读数)室温放置3-5分钟；用酶标仪测定A595；根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度；
黑素的含量用碱消化法进行测定：
正处于对数生长期的B16黑素瘤细胞接种于6cm培养皿中、浓度为2×105个/ml，各孔加5ml细胞悬浮液；接种12h后、待细胞完全贴壁后用药，用药浓度分别为5、10、20和40μg/ml；在72h后收集细胞；在不破碎细胞的情况下加入200μl的1MNaOH/10％DMSO溶液，置80℃水浴中2h后在470nm处测定吸收值A。未用药组(阴性对照组)作为对照组与用药组进行对比见表1：
表1香豆素苯基异噁唑衍生物6a-6o对细胞中黑素合成和三种细菌的抗菌活性结果
实施例19
所述的香豆素苯基异噁唑衍生物在制备抗菌药物中的用途，将实施例2-17获得的化合物5和化合物6a-6o对白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用测定：
(1)融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的菌液，使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固。
(2)用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。
(3)样品浓度为100mg/ml(100mM)；每孔加样品溶液20μl，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录。化合物和阳性对照组对三种菌株的抑制作用见表1。
(4)评价
抑菌作用的判断:
抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用。
抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用。