一种基因工程菌生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因工程菌生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。

背景技术：

β-胡萝卜素是一种橘黄色的脂溶性的类胡萝卜素，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类的营养食品添加剂。在人体中，β-胡萝卜素是维生素A的前体；可以作为抗氧化剂清除体内的自由基，降低老年人心力衰竭的风险；激发免疫系统，有防癌和抗癌的功能。此外β-胡萝卜素还可以用于食品色素、动物饲料添加剂、保健品、化妆品及药品中。目前β-胡萝卜素的市场需求不断增加，它的应用领域也从食品着色转向营养食品、保健品和药品三大领域。

β-胡萝卜素制备生产有三种方法：化学合成法；天然提取法；微生物发酵法。采用化学合成法人工合成的β-胡萝卜素几乎完全是反式异构体形式，不具备许多天然β-胡萝卜素的生理功能，不能完全被人体吸收，长期服用会对人体产生一定程度的毒副作用，随着人们对绿色天然食品的重视化学合成的β-胡萝卜素不被大多数食品科学家所接受。从植物中提取天然β-胡萝卜素受原料含量、气候、产地等条件限制，且工艺复杂，难以大量生产，应用也收到限制。

微生物发酵法因不受环境等条件的影响，并且容易培养，产量高而广泛受到国内外的重视，是生产β-胡萝卜素的最好方法。发酵常用的菌株主要分为三类：藻类、酵母和真菌。藻类和酵母的产量相对较低无法达到工业化生产的要求。

三孢布拉霉(Blakeslea trispora)是目前生产β-胡萝卜素的首选菌株，但是以三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的培养基成分复杂、成本相对较高。三孢布拉霉是异宗结合菌，进行有性生殖的方式是异宗接合，即由来源和性质不同的“+”“-”菌株才能相互融合，进行有性生殖。接合孢子产生时通常进行减数分裂，于是产生含有单倍体孢子的孢子囊。诱导配囊柄的激素成为三孢酸，三孢酸的主要功能是诱导有性生殖，促进β-胡萝卜素的生物合成。在工业生产中，常常要考虑“+”“-”菌株的配比，发酵条件相对复杂，这也给工业生产带来许多不必要的困难。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素产量较低的不足，提供一种一种基因工程菌生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌，该基因工程菌生产β-胡萝卜素产量较高，发酵条件简单。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种含有茄红素合酶与番茄红素环化酶(carRA)基因/茄红素脱氢酶(carB)基因的耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)基因工程菌。

其中，所述的茄红素合酶/番茄红素环化酶(carRA)基因是常规的，较佳的是来源于三孢布拉霉β-胡萝卜素合成途径的carRA(茄红素合酶与番茄红素环化酶)基因，更佳的，是根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优化后的，最佳的其核苷酸见序列表中SEQ ID NO.3所示。

其中，所述的茄红素脱氢酶(carB)基因是常规的，较佳的是来源于三孢布拉霉β-胡萝卜素合成途径的carB(茄红素脱氢酶)基因；更佳的，是根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优化后的，最佳的其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO.4所示。

其中，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法是常规的，较佳的用基因工程手段构建而得，更佳的包括以下步骤：将含有carRA基因和carB基因重组载体导入耶罗维解脂酵母即可。

较佳的，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步含有双香儿基焦磷酸合酶(GGS)基因。

其中，所述的双香儿基焦磷酸合酶(GGS)基因是常规的，较佳的来源于耶罗维解脂酵母ATCC20362，更佳的其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

其中，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法是常规的，较佳的用基因工程手段构建而得，更佳的包括以下步骤：将含有carRA基因、carB基因和GGS基因的重组载体导入耶罗维解脂酵母即可。

其中，所述的含有carRA基因、carB基因和GGS基因的重组载体，较佳的，由包括以下步骤的方法构建而得：克隆来源于三孢布拉霉的carRA基因、carB基因，在其上游和下游连接来源于耶罗维解脂酵母的启动子和终止子，使其成为完整的表达元件，并与GGS基因的表达元件整合到一个质粒上，即获得的重组载体。该重组载体可一次性将基因整合到耶罗维解脂酵母基因组上。较佳的，所述的重组载体是质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)。

进一步更佳的，所述的carB基因，carRA基因和GGS基因在所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌中的拷贝数大于1个，较佳的为2-100个，甚至1000个。

其中，获得高拷贝数的carB基因，carRA基因和GGS基因的耶罗维解脂酵母基因工程菌的方法是常规的，较佳的可以导入多拷贝数外源基因的重组表达载体，或者用具有多整体位点的重组表达载体导入外源基因。

进一步更佳的，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步含有HMG-CoA还原酶的活性部位基因(HMG^cata)。

其中，所述的HMG-CoA^cata还原酶是常规的，较佳的来自耶罗维解脂酵母的HMG-CoA还原酶，更佳的是HMG-CoA还原酶的催化部位。

其中，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌的制备方法同常规，较佳的，用基因工程手段构建而得，更佳的，包括以下步骤：用含有HMG-CoA还原酶活性部位基因(HMG^cata)的重组表达载体导入耶罗维解脂酵母即可。其中，所述的重组表达载体较佳的是质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。

进一步更佳的，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步敲除了3-磷酸甘油脱氢酶(Gut2)基因。所述的敲除方法是常规的，较佳的，包括以下步骤：采用质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)敲除，该质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示。

进一步更佳的，所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌还进一步敲除了过氧化物酶(Pox2)基因。所述的敲除方法是常规的，较佳的包括以下步骤：采用质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)敲除，该质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示。

本发明中，所述的耶罗维解脂酵母是常规的。

本发明的技术方案之二，一种基因工程菌生产β-胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

1)制备含有carRA(茄红素合酶与番茄红素环化酶)基因与carB(茄红素脱氢酶)基因的耶罗维解脂酵母基因工程菌；

2)发酵培养步骤1)所得的耶罗维解脂酵母基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素。

本发明步骤1)所述的耶罗维解脂酵母基因工程菌如上所述。

本发明步骤2)所述的发酵培养骤1)所得的耶罗维解脂酵母基因工程菌的方法的常规的耶罗维解脂酵母发酵方法，在常规的耶罗维解脂酵母发酵液中发酵即可，发酵条件和参数是常规的。较佳的包括在YPD液体培养基中28℃震荡培养所述耶罗维解脂酵母基因工程菌即可。步骤2)所述的从发酵液中获得β-胡萝卜素的方法也是常规的。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过基因工程方法向耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)引入来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)β-胡萝卜素基因茄红素合酶与番茄红素环化酶(carRA)和茄红素脱氢酶(carB)基因，进一步增强双香儿基焦磷酸合酶(GGS)和3-羟基3-甲基乙酰辅酶A还原酶(HMG-CoA^cata reductase)的表达，更进一步敲除3-磷酸甘油脱氢酶(Gut2)与过氧化物酶(Pox2)，获得了异源表达β-胡萝卜素耶罗维解脂酵母菌株。本发明选择耶罗维解脂酵母为表达宿主，异源表达来自三孢布拉霉的β-胡萝卜素合成途径，发酵条件简单，β-胡萝卜素产量较高，具有重要的生产价值。

附图说明

下面用附图进一步说明本发明。

图1显示β-胡萝卜素合成途径。其中方框内为酵母体内的合成途径，方框外为外源表达的合成途径。

图2为pSK-HMG^cata-URA3.5N-3N质粒图谱。

图3为pS-B-RA-GGS-F-U(L)质粒图谱。

图4为pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB质粒图谱。

图5为pS-B-RA-GGS-Gut2-Ura3(L)质粒图谱。

图6为pS-B-RA-GGS-Pox2-Ura3(L)质粒图谱。

图7为pS-B-RA-GGS-rDNA-Ura3(L)质粒图谱。

具体实施方式

本发明人通过克隆来源于三孢布拉霉β-胡萝卜素合成途径的carRA(茄红素合酶与番茄红素环化酶)与carB(茄红素脱氢酶)基因，在其上游和下游连接来源于耶罗维解脂酵母的启动子和终止子，使其成为完整的表达元件，并与GGS基因的表达元件整合到一个质粒上，一次性将基因整合到耶罗维解脂酵母基因组上，得到异源产β-胡萝卜素的菌株。而后克隆表达HMG-CoA^cata，增强甲羟戊酸代谢，使β-胡萝卜素的产量得到大幅提升。敲除3-磷酸甘油脱氢酶(Gut2)与过氧化物酶(Pox2)基因分别降低3-磷酸甘油的产生和过氧化物的β氧化，获得β-胡萝卜素的高产耶罗维解脂酵母菌株。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

1、材料和方法

应用在实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，相关描述可参见：(1)由Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，NY(1989)出版Sambroo,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.所著的Molecular Cloning:A Laboratory Manual；(2)由Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984)出版T.J.Silhavy.M.L.Bennan和L.W.Enquist所著的Experiments with Gene Fusions；(3)由Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)出版Ausubel,F.M等人所著的Current Protocols in Molecular Biology。

适用于微生物培养的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下述实施例的技术可参见American Society for Microbiology:Washington,D.C.(1994)出版的Manual of Methods for General Bacterioloy或Thomas D.Brock在Sinauer Associates:Sunderland,MA(1989)出版的第二版Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology中所述的相关内容。耶罗维解脂酵母的操作参见Barth G,Gaillardin C.1996.Yarrowia lipotica,p 313–388.In Wolf KE(ed),Nonconventional yeasts in biotechnology。

2、耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)的培养

耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)该菌株一般在28℃下培养，采用的培养基主要有以下几种，固体培养基添加20g/L的琼脂。

YPD培养基：10g/L酵母浸出物(OXOID)，20g/L蛋白胨(OXOID)，20g/L葡萄糖(国药)。

MM培养基：20g/L葡萄糖，6.7g/L YNB培养基(无氨基酸)。

YNB培养基购自BIOSHARP。

MM+5-FOA培养基：20g/L葡萄糖，6.7g/L YNB培养基(无氨基酸)，1g/L 5-FOA(5-氟乳清酸)，0.075g/L尿嘧啶，0.075g/L尿苷。

酵母单菌落接种于YPD斜面上，28℃培养72h；接种斜面上的酵母菌落于20ml YPD液体培养基(pH 5.5)中，28℃，200rpm培养72h；取1ml培养液，12000rpm离心1min；弃上清加入1ml丙酮，超声波破碎30min后12000rpm离心；取上清用于液相检测。

3、β-胡萝卜素的HPLC检测

检测方法参见Shao Z,Zhao H,Zhao H(2009)DNA assembler,an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.Nucleic Acid Res 37:e16。采用注射器5μl进样量，检测柱为Agilent Diamonsil SB-C18column，在472nm处采集。乙腈和四氢呋喃洗脱，具体洗脱程序见表1。

表1.HPLC洗脱程序

A：乙腈；

B：四氢呋喃。

实施例1耶罗维解脂酵母基因的导入

该实施例主要描述耶罗维解脂酵母的基因转化方法。

感受态细胞制备过程

1.接种耶罗维解脂酵母单菌落至5ml YPD液体培养基(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH至4.0)中，28℃，220rpm振荡培养10-12h；

2.将50-100μL上述培养液转移至10ml YPD液体培养基(pH4.0)中，28℃，220rpm过夜培养直至细胞OD₆₀₀约为5.5左右；

3.培养液28℃，3500rpm离心5min；

4.弃上清，用10ml 1×TE缓冲液冲洗细胞2次；

5.用20ml左右0.1M LiAc(pH6.0)稀释悬浮，使细胞浓度达到5×10⁷/ml；

6.悬浮液在28℃，100rpm轻柔孵育1h；

7.培养液28℃，3500rpm离心5min后弃上清，用2ml 100mM LiAc(pH6.0)重新悬浮，使细胞浓度达到5×10⁸/ml；

注：感受态细胞可以在4℃下保存一周，使用前需离心弃上清后重悬；长时间保存需加25％甘油在-80℃下保存，取用时需在冰上融化，使用前用0.1M LiAc冲洗重悬。

转化过程

1.取5μL carrier DNA(carrier DNA为鲑鱼精DNA，10mg/ml溶于50mM Tris，5mM EDTA溶液中，长度约为500bp)100℃孵育5min放置在冰上，1μg线性化载体置于2mL EP管底部，60℃孵育5min后放在冰上，然后将二者混匀；

2.将100μL感受态细胞与上述DNA混匀，28℃，100rpm孵育15min，然后加700μL 40％PEG4000(用0.1M LiAc溶解，过滤除菌)混匀，28℃，100rpm孵育1h；

3.细胞39℃热激10min，然后加入1.2mL 100mM LiAc，200ml悬浮液涂布在筛选平板上平板上，28℃培养3～4后待菌落长出(充足的O₂)。

实施例2URA3缺失株的获得

HMG-CoA还原酶是甲羟戊酸途径中重要的限速酶，催化HMG-CoA到甲羟戊酸的转化。为了增加β-胡萝卜素的产量，我们通过克隆表达HMG-CoA还原酶的催化部位使碳代谢流向类异戊二烯途径。克隆来自耶罗维解脂酵母的HMG-CoA还原酶基因，共3000bp，截取其催化部位1500-3000bp，并在起始部位添加ATG起始密码子。为了使该序列正常表达，在其上游和下游分别添加Exp1启动子和Aco终止子，得到完整的克隆表达元件Exp1-HMG-CoA^cata-Aco，然后整合URA3基因的上下游同源片段，得到质粒pSK-HMG^cata-URA3.5N-3N，该质粒的序列见SEQ ID NO1(参见表2，图2)。将PmeI/SphI线性化的该质粒转化进入耶罗维解脂酵母ATCC20362(购自ATCC)，获得菌株株Y2224。，故而经采用URA3同源臂获得了Y2224，同时导入了催化部位。

表2.质粒pSK-HMG^cata-URA3.5N-3N的描述

实施例3三孢布拉霉β-胡萝卜素基因的表达

该实施例主要描述三孢布拉霉β-胡萝卜素在耶罗维解脂酵母菌株的构建和表达(见图1)。

构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)主要包括来源于三孢布拉霉的carB(茄红素脱氢酶)，carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。

GGS基因克隆于耶罗维解脂酵母ATCC20362，GGS基因具体序列见SEQ ID NO.2。

CarRA基因克隆自三孢布拉霉，根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优化，优化后的CarRA基因序列见SEQ ID NO.3。

CarB基因克隆自三孢布拉霉，根据耶罗维解脂酵母的密码子偏好性做相应的优化，优化后的CarB基因序列见SEQ ID NO.4。将上述基因添加启动子与终止子构建功能组件，然后整合IntF同源片段，得到pS-B-RA-GGS-F-U(L)质粒(见表3、图3)，该质粒的序列见SEQ ID NO.5。该质粒的同源片段为IntF基因，该质粒整合至耶罗维解脂酵母IntF位点。

表3.质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)的描述

将质粒pS-B-RA-GGS-F-U(L)用AscI/SphI酶切，包含表2序列的线性片段，根据实施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株Y2224(Ura3^-)。转化细胞涂布于MM培养基平板上，28℃培养48-72h，得到转化子YH202。将长出的黄色单菌落YH202重新在MM培养基上划线，培养48-72h后接种于YPD斜面上。待斜面生长72h后，转移到20ml YPD液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养72h后液相检测，得到该菌株β-胡萝卜素产量为4.35mg/L。

实施例4HMG-CoA还原酶催化部位的克隆及表达

HMG-CoA还原酶是甲羟戊酸途径中重要的限速酶，催化HMG-CoA到甲羟戊酸的转化。为了增加β-胡萝卜素的产量，我们通过克隆表达HMG-CoA还原酶的催化部位使碳代谢流向类异戊二烯途径。克隆来自耶罗维解脂酵母的HMG-CoA还原酶基因，共3000bp，截取其催化部位1500-3000bp，并在起始部位添加ATG起始密码子。为了使该序列正常表达，在其上游和下游分别添加Exp1启动子和Aco终止子，得到完整的克隆表达元件Exp1-HMG-CoA^cata-Aco。将该元件连接到表达载体上，得到质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB(表4、图4)。该质粒整合至耶罗维解脂酵母Int B位点。该质粒具体序列见SEQ ID NO.6。

表4.质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB的描述

将质粒pSK-Hmg(y)-Ura3-IntB用PmeI/SphI酶切，回收含上述序列的片段，根据实施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH202(Ura3^-)中。转化细胞涂布于MM培养基平板上，28℃培养48-72h得到转化子YH306。将长出的黄色单菌落重新再MM培养基上划线，培养48-72h后接种于YPD斜面上。待斜面生长72h后，转移到20ml YPD液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养72h后液相检测。YH306产量为7.13mg/L，说明过表达HMG-CoA^cata能够增强类异戊二烯途径，增加β-胡萝卜素的产量。然后将YH306单菌落接种于20ml YPD培养基中培养24h，涂布于MM+5-FOA平板上，培养48-72h后得到URA3缺失的菌株YH306(Ura3^-)。

实施例5敲除Gut2基因增加β-胡萝卜素产量

构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)(表5、图5)。主要包括carB(茄红素脱氢酶)，carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。该质粒的同源臂为Gut2基因的上下游片段，目的是敲除Gut2基因，并且补入第二个carB(茄红素脱氢酶)，carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。该质粒具体序列见SEQ ID NO.7。

表5.质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)的描述

将质粒pS-B-RA-GGS-Gut2-U(L)用AscI/SphI酶切，包含表5序列的线性片段，根据转化方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH306(Ura3^-)中。转化细胞涂布于MM培养基平板上，28℃培养48-72h得到转化子YH413。将长出的黄色单菌落重新再MM培养基上划线，培养48-72h后接种于YPD斜面上。待斜面生长72h后，转移到20ml YPD液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养72h后液相检测。YH413的β-胡萝卜素的产量为37.4mg/L。说明敲除Gut2可以降低3-磷酸甘油的产生，提升乙酰CoA的产量，增加β-胡萝卜素的产量。然后将YH413单菌落接种于20ml YPD培养基中培养24h，涂布于MM+5-FOA平板上，培养48-72h后得到URA3缺失的菌株YH413(Ura3^-)。

实施例6敲除Pox2基因增加β-胡萝卜素产量

构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)(表6、图6)。主要包括carB(茄红素脱氢酶)，carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。该质粒的同源臂为Pox2基因的上下游片段，目的是敲除Pox2基因，并且补入第二个carB(茄红素脱氢酶)，carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)。该质粒具体序列见SEQ ID NO.8。

表6.质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)的描述

将质粒pS-B-RA-GGS-Pox2-U(L)用AscI/SphI酶切，包含表6序列的线性片段，根据实施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH413(Ura3^-)中。转化细胞涂布于MM培养基平板上，28℃培养48-72h得到转化子YC511。将长出的黄色单菌落重新再MM培养基上划线，培养48-72h后接种于YPD斜面上。待斜面生长72h后，转移到20ml YPD液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养72h后液相检测。菌株YC511的β-胡萝卜素的产量为53.0mg/L，说明敲除Pox2可以降低过氧化物，提升乙酰CoA的产量，增加β-胡萝卜素的产量。然后将YH511单菌落接种于20ml YPD培养基中培养24h，涂布于MM+5-FOA平板上，培养48-72h后得到URA3缺失的菌株YH511(Ura3^-)。

实施例7一次性补入多个基因增加β-胡萝卜素产量

本实施例主要描述一次性补入多个carB(茄红素脱氢酶)，carRA(茄红素合酶和番茄红素环化酶)和GGS基因(焦磷酸双香叶儿基合酶)对β-胡萝卜素产量的影响。酵母基因组的rDNA有多个100-200个重复单元，以此为整合位点提高整合拷贝数的应用策略在酵母中常被应用。依赖于rDNA的整合可以一次性导入几个甚至几十个的拷贝，从而实现高效表达。构建的整合质粒pS-B-RA-GGS-rDNA-U(L)(表7、图7)具体序列见SEQ ID NO.9。

表7.质粒pS-B-RA-GGS-rDNA-U(L)的描述

将质粒pS-B-RA-GGS-rDNA-U(L)用AscI/SphI酶切，根据实施例1中的方法将该片段转化到耶罗维解脂酵母菌株YH504(Ura3^-)中。转化细胞涂布于MM培养基平板上，28℃培养48-72h得到YC607。将长出的黄色单菌落重新再MM培养基上划线，培养48-72h后接种于YPD斜面上。待斜面生长72h后，转移到20mlYPD液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养72h后液相检测。YC607的β-胡萝卜素的产量为72.9mg/L。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110> 上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院

<120> 一种基因工程菌生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌

<130> P1611257C

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7201

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSK-HMGcata-URA3.5N-3N

<400> 1

cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60

ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120

cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180

ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240

accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300

gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360

gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420

caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600

ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcgc 660

tgagctggcg cgcctctaga aacgtacgtt gtaactattt aaattccttg gtgtttaaac 720

ctttggagta cgactccaac tatgagtgtg cttggatcac tttgacgata cattcttcgt 780

tggaggctgt gggtctgaca gctgcgtttt cggcgcggtt ggccgacaac aatatcagct 840

gcaacgtcat tgctggcttt catcatgatc acatttttgt cggcaaaggc gacgcccaga 900

gagccattga cgttctttct aatttggacc gatagccgta tagtccagtc tatctataag 960

ttcaactaac tcgtaactat taccataaca tatacttcac tgccccagat aaggttccga 1020

taaaaagttc tgcagactaa atttatttca gtctcctctt caccaccaaa atgccctcct 1080

acgaagctcg agctaacgtc cacaagtccg cctttgccgc tcgagtgctc aagctcgtgg 1140

cagccaagaa aaccaacctg tgtgcttctc tggatgttac caccaccaag gagctcattg 1200

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tcttcctgtt cgaggacaga aagttcgcag atattggcaa cactgtcaag caccagtacc 1380

ggtgtcaccg aatcgccgag tggtccgata tcaccaacgc ccacggtatc gatacgcgag 1440

agaattcatg ctgttcatcg tggttaatgc tgctgtgtgc tgtgtgtgtg tgttgtttgg 1500

cgctcattgt tgcgttatgc agcgtacacc acaatattgg aagcttatta gcctttctat 1560

tttttcgttt gcaaggctta acaacattgc tgtggagagg gatggggata tggaggccgc 1620

tggagggagt cggagaggcg ttttggagcg gcttggcctg gcgcccagct cgcgaaacgc 1680

acctaggacc ctttggcacg ccgaaatgtg ccacttttca gtctagtaac gccttaccta 1740

cgtcattcca tgcgtgcatg tttgcgcctt ttttcccttg cccttgatcg ccacacagta 1800

cagtgcactg tacagtggag gttttggggg ggtcttagat gggagctaaa agcggcctag 1860

cggtacacta gtgggattgt atggagtggc atggagccta ggtggagcct gacaggacgc 1920

acgaccggct agcccgtgac agacgatggg tggctcctgt tgtccaccgc gtacaaatgt 1980

ttgggccaaa gtcttgtcag ccttgcttgc gaacctaatt cccaattttg tcacttcgca 2040

cccccattga tcgagcccta acccctgccc atcaggcaat ccaattaagc tcgcattgtc 2100

tgccttgttt agtttggctc ctgcccgttt cggcgtccac ttgcacaaac acaaacaagc 2160

attatatata aggctcgtct ctccctccca accacactca cttttttgcc cgtcttccct 2220

tgctaacaca aaagtcaaga acacaaacaa ccaccccaac ccccttacac acaagacata 2280

tctacagcaa tggccatggc cacccagtct gtgaaggtgg ttgagaagca cgttcctatc 2340

gtcattgaga agcccagcga gaaggaggag gacacctctt ctgaagactc cattgagctg 2400

actgtcggaa agcagcccaa gcccgtgacc gagacccgtt ctctggacga cctagaggct 2460

atcatgaagg caggtaagac caagcttctg gaggaccacg aggttgtcaa gctctctctc 2520

gagggcaagc ttcctttgta tgctcttgag aagcagcttg gtgacaacac ccgagctgtt 2580

ggcatccgac gatctatcat ctcccagcag tctaatacca agactttaga gacctcaaag 2640

cttccttacc tgcactacga ctacgaccgt gtttttggag cctgttgcga gaacgttatt 2700

ggttacatgc ctctccccgt tggtgttgct ggccccatga acattgatgg caagaactac 2760

cacattccta tggccaccac tgagggttgt cttgttgcct caaccatgcg aggttgcaag 2820

gccatcaacg ccggtggcgg tgttaccact gtgcttactc aggacggtat gacacgaggt 2880

ccttgtgttt ccttcccctc tctcaagcgg gctggagccg ctaagatctg gcttgattcc 2940

gaggagggtc tcaagtccat gcgaaaggcc ttcaactcca cctctcgatt tgctcgtctc 3000

cagtctcttc actctaccct tgctggtaac ctgctgttta ttcgattccg aaccaccact 3060

ggtgatgcca tgggcatgaa catgatctcc aagggcgtcg aacactctct ggccgtcatg 3120

gtcaaggagt acggcttccc tgatatggac attgtgtctg tctcgggtaa ctactgcact 3180

gacaagaagc ccgcagcgat caactggatc gaaggccgag gcaagagtgt tgttgccgaa 3240

gccaccatcc ctgctcacat tgtcaagtct gttctcaaaa gtgaggttga cgctcttgtt 3300

gagctcaaca tcagcaagaa tctgatcggt agtgccatgg ctggctctgt gggaggtttc 3360

aatgcacacg ccgcaaacct ggtgaccgcc atctaccttg ccactggcca ggatcctgct 3420

cagaatgtcg agtcttccaa ctgcatcacg ctgatgagca acgtcgacgg taacctgctc 3480

atctccgttt ccatgccttc tatcgaggtc ggtaccattg gtggaggtac tattttggag 3540

ccccaggggg ctatgctgga gatgcttggc gtgcgaggtc ctcacatcga gacccccggt 3600

gccaacgccc aacagcttgc tcgcatcatt gcttctggag ttcttgcagc ggagctttcg 3660

ctgtgttctg ctcttgctgc cggccatctt gtgcaaagtc atatgaccca caaccggtcc 3720

caggctccta ctccggccaa gcagtctcag gccgatctgc agcgtctaca aaacggttcg 3780

aatatttgca tacggtcata ggcggccgca tggagcgtgt gttctgagtc gatgttttct 3840

atggagttgt gagtgttagt agacatgatg ggtttatata tgatgaatga atagatgtga 3900

ttttgatttg cacgatggaa ttgagaactt tgtaaacgta catgggaatg tatgaatgtg 3960

ggggttttgt gactggataa ctgacggtca gtggacgccg ttgttcaaat atccaagaga 4020

tgcgagaaac tttgggtcaa gtgaacatgt cctctctgtt caagtaaacc atcaactatg 4080

ggtagtatat ttagtaagga caagagttga gattctttgg agtcctagaa acgtattttc 4140

gcgttccaag atcaaattag tagagtaata cgggcacggg aatccattca tagtctcaat 4200

cctgcaggtg agttaattaa aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga 4260

ctacgagaac tcccagtaca aggagttcct agtcccctct cccaacgaga agctggccag 4320

aggtctgctc atgctggccg agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc 4380

caagcagacc attgagcttg cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca 4440

gaaccgacct aagggcgact ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga 4500

cgacaaggga gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg 4560

aacggatatc ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga 4620

ggccaagcga taccagaagg ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt 4680

agactatgga tatgtaattt aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt 4740

tcagcttgta tgatggtcag acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct 4800

gtgtatccgc atgatctgtc caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct 4860

gggtacagtg ctaatacgtt gaactactta tacttatatg aggctcgaag aaagctgact 4920

tgtgtatgac gcatgcgacg ccacccatgg actctaagcg gccgcatgga cctgtcgact 4980

tggctcgagg gggggcccgg taccagcttt tgttcccttt agtgagggtt aatttcgagc 5040

ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 5100

cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 5160

ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 5220

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 5280

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5340

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 5400

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 5460

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 5520

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 5580

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 5640

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 5700

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 5760

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 5820

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 5880

tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 5940

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6000

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6060

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6120

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6180

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6240

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6300

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6360

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6420

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 6480

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 6540

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 6600

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 6660

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 6720

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 6780

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 6840

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 6900

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 6960

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7020

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7080

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7140

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 7200

c 7201

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> Yarrowia lipotica

<220>

<223> 双香儿基焦磷酸合酶基因，GGS

<400> 2

atggattata acagcgcgga tttcaaggag atatggggca aggccgccga caccgcgctg 60

ctgggaccgt acaactacct cgccaacaac cggggccaca acatcagaga acacttgatc 120

gcagcgttcg gagcggttat caaggtggac aagagcgatc tcgagaccat ttcgcacatc 180

accaagattt tgcataactc gtcgctgctt gttgatgacg tggaagacaa ctcgatgctc 240

cgacgaggcc tgccggcagc ccattgtctg tttggagtcc cccaaaccat caactccgcc 300

aactacatgt actttgtggc tctgcaggag gtgctcaagc tcaagtctta tgatgccgtc 360

tccattttca ccgaggaaat gatcaacttg catagaggtc agggtatgga tctctactgg 420

agagaaacac tcacttgccc ctcggaagac gagtatctgg agatggtggt gcacaagacc 480

ggtggactgt ttcggctggc tctgagactt atgctgtcgg tggcatcgaa acaggaggac 540

catgaaaaga tcaactttga tctcacacac cttaccgaca cactgggagt catttaccag 600

attctggatg attacctcaa cctgcagtcc acggaattga ccgagaacaa gggattctgc 660

gaagatatca gcgaaggaaa gttttcgttt ccgctgattc acagcatacg caccaacccg 720

gataaccacg agattctcaa cattctcaaa cagcgaacaa gcgacgcttc actcaaaaag 780

tacgccgtgg actacatgag aacagaaacc aagagtttcg actactgcct caagaggata 840

caggccatgt cactcaaggc aagttcgtac attgatgatc tagcagcagc tggccacgat 900

gtctccaagc tacgagccat tttgcattat tttgtgtcca cctctgactg tgaggagaga 960

aagtactttg aggatgcgca gtga 984

<210> 3

<211> 1829

<212> DNA

<213> Blakeslea trispora

<220>

<223> carRA, 茄红素合酶和番茄红素环化酶基因

<400> 3

atggcttcca ttctcaccta tctggagttt catctctact acacactgcc tgtccttgcg 60

gcattgtgtt ggctgctgaa gccgtttcac tcgcagcaag acaatctcaa gtacaaattt 120

ctgatgttga tggccgcctc gaccgcatcg atttgggaca attacatcgt ttatcatcga 180

gcttggtggt actgtcctac ctgtgttgtg gctgtcattg gctacgtgcc tctggaagag 240

tacatgttct ttatcatcat gactctgatg actgtcgcgt tctcgaactt tgttatgcgt 300

tggcacttgc acaccttctt tattagaccc aacacctcgt ggaagcagac actgctggtg 360

cgacttgtgc ctgtttctgc tctgttggca atcacctatc acgcttggca cttgacactg 420

ccaaataaat cctcgtttta cggttcgtgc atcctttggt atgcttgtcc tgtgttggct 480

attctttggc tgggtgctgg cgagtacatc ttgcgtcgac ctgtggctgt ccttttgtcg 540

attgttatcc cttccgtgta cctgtgttgg gctgacatcg tcgctatttc cgctggcaca 600

tggcacattt ctcttagaac aagcactggc aaaatggtgg tgcccgatct gcctgtggaa 660

gagtgcctgt tttttacctt gatcaacaca gtcttggttt ttgctacctg tgctattgac 720

cgagcccagg ccatcctcca tctgtacaaa tcgtctgttc agaatcagaa ccctaaacaa 780

gccatttccc ttttccagca cgtcaaagag ctggcatggg ccttctgtct tcctgaccag 840

atgctcaaca atgagttgtt tgatgatctt accatcagct gggacattct gcgtaaagcc 900

tcgaagtcgt tctacactgc atctgccgtt tttccatcct atgtgcgtca agacttgggt 960

gttctctatg ctttctgtag agctaccgat gacctgtgcg atgatgagtc caaatctgtt 1020

caagagagaa gagaccagct ggatcttact cgacagtttg ttcgtgatct ctttagccag 1080

aagacctccg cgcctattgt gattgactgg gagttgtatc agaaccagct tcctgcttcg 1140

tgtatttctg cctttagagc ctttactcga cttcgacatg tccttgaagt ggaccctgtg 1200

gaggagctgc tggatggtta caaatgggat cttgagcgtc gtcctatcct tgatgaacaa 1260

gacttggagg catactccgc ttgtgtggcc tcctccgtgg gtgaaatgtg cacacgtgtg 1320

attcttgctc aagaccagaa ggagaatgat gcttggatta ttgaccgtgc acgtgagatg 1380

ggcctggtgc tgcaatacgt taacattgct cgtgacattg tgaccgacag cgagactctg 1440

ggtcgatgtt atctgcctca gcagtggctt agaaaagaag agacagaaca gattcagcaa 1500

ggcaacgccc gtagcctggg tgatcagaga ctgttgggct tgtctctgaa gctcgtggga 1560

aaggcagacg ctatcatggt gagagctaag aagggcattg acaagttgcc ggcaaactgt 1620

caaggcggtg tgcgagctgc ttgccaagtg tacgctgcaa ttggatctgt gctcaagcag 1680

cagaagacaa catatcctac aagagcccat ctgaaaggaa gcgaacgtgc caagattgct 1740

ctgttgtccg tgtacaacct ctatcagtct gaagacaagc ctgtggctct ccgtcaagct 1800

agaaagatta agtccttttt tgttgacta 1829

<210> 4

<211> 1752

<212> DNA

<213> Blakeslea trispora

<220>

<223> carB, 茄红素脱氢酶基因

<400> 4

atggcttccg atcagaagaa gcacattgtt gtcattggtg ccggtattgg cggaactgct 60

actgctgctc gtcttgctcg tgaaggtttt cgagttactg ttgttgagaa gaacgacttt 120

tccggtggcc gttgttcttt cattcatcac gacggtcatc gatttgatca gggtccctct 180

ctctacttga tgcctaagct ctttgaagac gcatttgctg acttggacga gcgtattggt 240

gatcacttgg acttgctgcg atgtgacaat aactataagg ttcactttga cgacggtgat 300

gccgtgcagc tctcttccga tctgaccaag atgaagggcg agttggaccg tattgagggt 360

ccccttggat ttggtagatt cttggacttc atgaaggaga cacatgtcca ctatgaacaa 420

ggtacattta ttgctatcaa gcgaaacttt gagaccattt gggatttgat tcgtctccag 480

tatgtgcctg agatctttcg attgcacttg tttggtaaga tctatgaccg agcctctaaa 540

tacttccaga ccaagaaaat gcgtatggct tttacctttc agacaatgta catgggtatg 600

tcgccttacg atgctccagc agtttactct ttgctccagt acaccgagtt tgctgaaggt 660

atctggtatc ctcgtggtgg tttcaacatg gttgttcaga agctggagtc tatcgcctcc 720

aaaaagtacg gtgctgagtt cagataccag tcgcctgttg ctaaaattaa cactgtcgac 780

aaagacaagc gtgtgaccgg tgtcaccttg gagagcggag aagtcattga agccgatgca 840

gtcgtgtgta atgcggatct tgtttacgct tatcaccatc tgctgcctcc ttgcaattgg 900

acaaagaaga cactggcctc taagaaactc acctcttctt ctatttcgtt ttactggtcc 960

atgtctacaa aggtgcctca gctggacgtg cacaatatct tcttggctga agcctacaag 1020

gagtcttttg acgagatttt caacgacttc ggtttgccct ctgaagcgtc tttctatgtc 1080

aacgttccat ctcgaattga tgagtctgcc gcacctccca acaaggactc cattattgtg 1140

ttggttccaa ttggccacat gaagtctaag acaggaaact ctgctgaaga gaattatcct 1200

gagttggtga accgtgcacg aaagatggtt ctggaagtta tcgagcgtcg tttgggagtg 1260

aacaactttg ctaatttgat tgaacatgaa gaagtgaatg atccttctgt ttggcagagc 1320

aagtttaacc tctggagagg ttctattctt ggtctgtctc atgacgtgtt ccaagttctc 1380

tggttcagac cttctaccaa ggactccaca aaccgttatg acaatctgtt ctttgtcgga 1440

gcttctacac atccaggtac tggtgttcct atcgttcttg ctggatctaa gctgacctcc 1500

gaccaagtct gtaagagctt tggccagaat cccctgccaa gaaagctgca agacagccag 1560

aagaagtacg ctcctgagca gactcgaaag accgagagcc actggatcta ctactgtctt 1620

gcttgttact ttgttacctt cctctttttc tatttcttcc caagagatga caccacaact 1680

cctgcttctt tcattaacca actgctgcct aacgttttcc aagtgcagaa cagcaacgac 1740

attcgaattt ag 1752

<210> 5

<211> 16313

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pS-B-RA-GGS-F-Ura3(L)

<400> 5

cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60

ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120

cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180

ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240

accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300

gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360

gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420

caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600

ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcgc 660

tgagctggcg cgccgccaaa gaacccatag cctctttaga acaatttgca caagcctctc 720

tataatcttt tcttcatctt cacatgctca aagcgtctgt tctgttgtaa ttatgttcga 780

gacctctcgt gacaaacaag cgacgagggg aaacatgtgc agagagccgg caagaaggaa 840

cagatataca cgagacaggg cggagatacc ggttacggaa taataaatga aggctgcaac 900

cgcttgggga caccccccca tagtcctttt taagcaatgg tgttatattt cttcttgtag 960

ccagctctct tagctcattc caattgccct cgacatcgcg ctctcttgtt tcgccctttt 1020

gtcttgacag aatacaattt ttttgtctct cgactgccta cagtagggtt tcaaccagcc 1080

ttaggttaga gttgagtgcg gggtatggct gtgcatacac caaaaagcca gaagtccaga 1140

tggtgtgcaa ctccaggttt ccatgggcta atctccttcc tgcgacacaa gcaagctgtc 1200

tcagagtcgg aatcgggtgt aacctacttg tagggtagac atcgactttc ggctttaccg 1260

agctccagag cgggtcgatc gtgtttcaga gactgaaaaa aggagaaaaa aaaagacttc 1320

caaggggcct attccgggaa tccgagagac attggatatg gacttgcaaa caacatctgg 1380

gctaataatg ggcctcagat ttagcggata tttcgtagct cattttgaac gtctactgat 1440

aaccaaattt ctactgtaaa gctgctcttc cttgaagatg tagtcgtctt tcgcttggag 1500

ggagaggtac catgttggta gtatatacac acggcatgta actgaggccc gatgagcctg 1560

tctgctgctc tgtctgcact ccaggttcgt tattgtcact cttctggcga tgatgcaact 1620

cgtattgaag ccctcagacg cgttccacat cagagttttg tatcaccatt attattgccg 1680

agtctccgat ttaacgcaaa tagactaagt tgagtgtcgt atatccacaa cgatcgacac 1740

tacccctcat accaatggct tttgttcgtg ttgttgttgg atgaggacct gaaacgtacg 1800

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 1860

gccaagctcg attaattaac tcacctgcag gattgagact atgaatggat tcccgtgccc 1920

gtattactct actaatttga tcttggaacg cgaaaatacg tttctaggac tccaaagaat 1980

ctcaactctt gtccttacta aatatactac ccatagttga tggtttactt gaacagagag 2040

gacatgttca cttgacccaa agtttctcgc atctcttgga tatttgaaca acggcgtcca 2100

ctgaccgtca gttatccagt cacaaaaccc ccacattcat acattcccat gtacgtttac 2160

aaagttctca attccatcgt gcaaatcaaa atcacatcta ttcattcatc atatataaac 2220

ccatcatgtc tactaacact cacaactcca tagaaaacat cgactcagaa cacacgctcc 2280

atgcggccgc tcactgcgca tcctcaaagt actttctctc ctcacagtca gaggtggaca 2340

caaaataatg caaaatggct cgtagcttgg agacatcgtg gccagctgct gctagatcat 2400

caatgtacga acttgccttg agtgacatgg cctgtatcct cttgaggcag tagtcgaaac 2460

tcttggtttc tgttctcatg tagtccacgg cgtacttttt gagtgaagcg tcgcttgttc 2520

gctgtttgag aatgttgaga atctcgtggt tatccgggtt ggtgcgtatg ctgtgaatca 2580

gcggaaacga aaactttcct tcgctgatat cttcgcagaa tcccttgttc tcggtcaatt 2640

ccgtggactg caggttgagg taatcatcca gaatctggta aatgactccc agtgtgtcgg 2700

taaggtgtgt gagatcaaag ttgatctttt catggtcctc ctgtttcgat gccaccgaca 2760

gcataagtct cagagccagc cgaaacagtc caccggtctt gtgcaccacc atctccagat 2820

actcgtcttc cgaggggcaa gtgagtgttt ctctccagta gagatccata ccctgacctc 2880

tatgcaagtt gatcatttcc tcggtgaaaa tggagacggc atcataagac ttgagcttga 2940

gcacctcctg cagagccaca aagtacatgt agttggcgga gttgatggtt tgggggactc 3000

caaacagaca atgggctgcc ggcaggcctc gtcggagcat cgagttgtct tccacgtcat 3060

caacaagcag cgacgagtta tgcagaatct tggtgatgtg cgaaatggtc tcgagatcgc 3120

tcttgtccac cttgataacc gctccgaacg ctgcgatcaa gtgttctctg atgttgtggc 3180

cccggttgtt ggcgaggtag ttgtacggtc ccagcagcgc ggtgtcggcg gccttgcccc 3240

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gttggttgta gggaagaatc aaaggccggt ctcgggatcc gtgggtatat atatatatat 3360

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aatctttcta gcttgacgga gagccacagg cttgtcttca gactgataga ggttgtacac 4320

ggacaacaga gcaatcttgg cacgttcgct tcctttcaga tgggctcttg taggatatgt 4380

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ttacaacttc tacctcaact atctacttta ataaatgaat atcgtttatt ctctatgatt 9840

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<210> 8

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pS-B-RA-GGS-Pox2-Ura3(L)

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ctcaaaaatc acacaagcaa cgacgcccgt acgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa 1560

tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc tcgattaatt aactcacctg 1620

caggattgag actatgaatg gattcccgtg cccgtattac tctactaatt tgatcttgga 1680

acgcgaaaat acgtttctag gactccaaag aatctcaact cttgtcctta ctaaatatac 1740

tacccatagt tgatggttta cttgaacaga gaggacatgt tcacttgacc caaagtttct 1800

cgcatctctt ggatatttga acaacggcgt ccactgaccg tcagttatcc agtcacaaaa 1860

cccccacatt catacattcc catgtacgtt tacaaagttc tcaattccat cgtgcaaatc 1920

aaaatcacat ctattcattc atcatatata aacccatcat gtctactaac actcacaact 1980

ccatagaaaa catcgactca gaacacacgc tccatgcggc cgctcactgc gcatcctcaa 2040

agtactttct ctcctcacag tcagaggtgg acacaaaata atgcaaaatg gctcgtagct 2100

tggagacatc gtggccagct gctgctagat catcaatgta cgaacttgcc ttgagtgaca 2160

tggcctgtat cctcttgagg cagtagtcga aactcttggt ttctgttctc atgtagtcca 2220

cggcgtactt tttgagtgaa gcgtcgcttg ttcgctgttt gagaatgttg agaatctcgt 2280

ggttatccgg gttggtgcgt atgctgtgaa tcagcggaaa cgaaaacttt ccttcgctga 2340

tatcttcgca gaatcccttg ttctcggtca attccgtgga ctgcaggttg aggtaatcat 2400

ccagaatctg gtaaatgact cccagtgtgt cggtaaggtg tgtgagatca aagttgatct 2460

tttcatggtc ctcctgtttc gatgccaccg acagcataag tctcagagcc agccgaaaca 2520

gtccaccggt cttgtgcacc accatctcca gatactcgtc ttccgagggg caagtgagtg 2580

tttctctcca gtagagatcc ataccctgac ctctatgcaa gttgatcatt tcctcggtga 2640

aaatggagac ggcatcataa gacttgagct tgagcacctc ctgcagagcc acaaagtaca 2700

tgtagttggc ggagttgatg gtttggggga ctccaaacag acaatgggct gccggcaggc 2760

ctcgtcggag catcgagttg tcttccacgt catcaacaag cagcgacgag ttatgcagaa 2820

tcttggtgat gtgcgaaatg gtctcgagat cgctcttgtc caccttgata accgctccga 2880

acgctgcgat caagtgttct ctgatgttgt ggccccggtt gttggcgagg tagttgtacg 2940

gtcccagcag cgcggtgtcg gcggccttgc cccatatctc cttgaaatcc gcgctgttat 3000

aatccatggt tgtgaattag ggtggtgaga atggttggtt gtagggaaga atcaaaggcc 3060

ggtctcggga tccgtgggta tatatatata tatatatata tacgatcctt cgttacctcc 3120

ctgttctcaa aactgtggtt tttcgttttt cgttttttgc tttttttgat ttttttaggg 3180

ccaactaagc ttccagattt cgctaatcac ctttgtacta attacaagaa aggaagaagc 3240

tgattagagt tgggcttttt atgcaactgt gctactcctt atctctgata tgaaagtgta 3300

gacccaatca catcatgtca tttagagttg gtaatactgg gaggatagat aaggcacgaa 3360

aacgagccat agcagacatg ctgggtgtag ccaagcagaa gaaagtagat gggagccaat 3420

tgacgagcga gggagctacg ccaatccgac atacgacacg ctgagatcgt cttggccggg 3480

gggtacctac agatgtccaa gggtaagtgc ttgactgtaa ttgtatgtct gaggacaaat 3540

atgtagtcag ccgtataaag tcataccagg caccagtgcc atcatcgaac cactaactct 3600

ctatgataca tgcctccggt attattgtac catgcgtcgc tttgttacat acgtatcttg 3660

cctttttctc tcagaaactc cagactttgg ctattggtcg agataagccc ggaccatagt 3720

gagtctttca cactctacat ttctcccttg ctccaactat ttaaatcgag gaagaggaca 3780

agcggctgct tcttaagttt gtgacatcag tatccaaggc accattgcaa ggattcaagg 3840

ctttgaaccc gtcatttgcc attcgtaacg ctggtagaca ggttgatcgg ttccctacgg 3900

cctccacctg tgtcaatctt ctcaagctgc ctgactatca ggacattgat caacttcgga 3960

agaaactttt gtatgccatt cgatcacatg ctggtttcga tttgtcttag aggaacgcat 4020

atacagtaat catagagaat aaacgatatt catttattaa agtagatagt tgaggtagaa 4080

gttgtaaaga gtgataaata gcggccgcta gtcaacaaaa aaggacttaa tctttctagc 4140

ttgacggaga gccacaggct tgtcttcaga ctgatagagg ttgtacacgg acaacagagc 4200

aatcttggca cgttcgcttc ctttcagatg ggctcttgta ggatatgttg tcttctgctg 4260

cttgagcaca gatccaattg cagcgtacac ttggcaagca gctcgcacac cgccttgaca 4320

gtttgccggc aacttgtcaa tgcccttctt agctctcacc atgatagcgt ctgcctttcc 4380

cacgagcttc agagacaagc ccaacagtct ctgatcaccc aggctacggg cgttgccttg 4440

ctgaatctgt tctgtctctt cttttctaag ccactgctga ggcagataac atcgacccag 4500

agtctcgctg tcggtcacaa tgtcacgagc aatgttaacg tattgcagca ccaggcccat 4560

ctcacgtgca cggtcaataa tccaagcatc attctccttc tggtcttgag caagaatcac 4620

acgtgtgcac atttcaccca cggaggaggc cacacaagcg gagtatgcct ccaagtcttg 4680

ttcatcaagg ataggacgac gctcaagatc ccatttgtaa ccatccagca gctcctccac 4740

agggtccact tcaaggacat gtcgaagtcg agtaaaggct ctaaaggcag aaatacacga 4800

agcaggaagc tggttctgat acaactccca gtcaatcaca ataggcgcgg aggtcttctg 4860

gctaaagaga tcacgaacaa actgtcgagt aagatccagc tggtctcttc tctcttgaac 4920

agatttggac tcatcatcgc acaggtcatc ggtagctcta cagaaagcat agagaacacc 4980

caagtcttga cgcacatagg atggaaaaac ggcagatgca gtgtagaacg acttcgaggc 5040

tttacgcaga atgtcccagc tgatggtaag atcatcaaac aactcattgt tgagcatctg 5100

gtcaggaaga cagaaggccc atgccagctc tttgacgtgc tggaaaaggg aaatggcttg 5160

tttagggttc tgattctgaa cagacgattt gtacagatgg aggatggcct gggctcggtc 5220

aatagcacag gtagcaaaaa ccaagactgt gttgatcaag gtaaaaaaca ggcactcttc 5280

cacaggcaga tcgggcacca ccattttgcc agtgcttgtt ctaagagaaa tgtgccatgt 5340

gccagcggaa atagcgacga tgtcagccca acacaggtac acggaaggga taacaatcga 5400

caaaaggaca gccacaggtc gacgcaagat gtactcgcca gcacccagcc aaagaatagc 5460

caacacagga caagcatacc aaaggatgca cgaaccgtaa aacgaggatt tatttggcag 5520

tgtcaagtgc caagcgtgat aggtgattgc caacagagca gaaacaggca caagtcgcac 5580

cagcagtgtc tgcttccacg aggtgttggg tctaataaag aaggtgtgca agtgccaacg 5640

cataacaaag ttcgagaacg cgacagtcat cagagtcatg atgataaaga acatgtactc 5700

ttccagaggc acgtagccaa tgacagccac aacacaggta ggacagtacc accaagctcg 5760

atgataaacg atgtaattgt cccaaatcga tgcggtcgag gcggccatca acatcagaaa 5820

tttgtacttg agattgtctt gctgcgagtg aaacggcttc agcagccaac acaatgccgc 5880

aaggacaggc agtgtgtagt agagatgaaa ctccagatag gtgagaatgg aagccatggt 5940

tgatgtgtgt ttaattcaag aatgaatata gagaagagaa gaagaaaaaa gattcaattg 6000

agccggcgat gcagaccctt atataaatgt tgccttggac agacggagca agcccgccca 6060

aacctacgtt cggtataata tgttaagctt tttaacacaa aggtttggct tggggtaacc 6120

tgatgtggtg caaaagaccg ggcgttggcg agccattgcg cgggcgaatg gggccgtgac 6180

tcgtctcaaa ttcgagggcg tgcctcaatt cgtgcccccg tggctttttc ccgccgtttc 6240

cgccccgttt gcaccactgc agccgcttct ttggttcgga caccttgctg cgagctaggt 6300

gccttgtgct acttaaaaag tggcctccca acaccaacat gacatgagtg cgtgggccaa 6360

gacacgttgg cggggtcgca gtcggctcaa tggcccggaa aaaacgctgc tggagctggt 6420

tcggacgcag tccgccgcgg cgtatggata tccgcaaggt tccatagcgc cattgccctc 6480

cgtcggcgtc tatcccgcaa cctctaaata gagcgggaat ataacccaag cttctttttt 6540

ttcctttaac acgcacaccc ccaactatca tgttgctgct gctgtttgac tctactctgt 6600

ggaggggtgc tcccacccaa cccaacctac aggtggatcc ggcgctgtga ttggctgata 6660

agtctcctat ccggactaat tctgaccaat gggacatgcg cgcaggaccc aaatgccgca 6720

attacgtaac cccaacgaaa tgcctacccc tctttggagc ccagcggccc caaatccccc 6780

caagcagccc ggttctaccg gcttccatct ccaagcacaa gcagcccggt tctaccggct 6840

tccatctcca agcacccctt tctccacacc ccacaaaaag acccgtgcag gacatcctac 6900

tgcgtgttta aacaacaatt gccccggaga agacggccag gccgcctaga tgacaaattc 6960

aacaactcac agctgacttt ctgccattgc cactaggggg gggccttttt atatggccaa 7020

gccaagctct ccacgtcggt tgggctgcac ccaacaataa atgggtaggg ttgcaccaac 7080

aaagggatgg gatggggggt agaagatacg aggataacgg ggctcaatgg cacaaataag 7140

aacgaatact gccattaaga ctcgtgatcc agcgactgac accattgcat catctaaggg 7200

cctcaaaact acctcggaac tgctgcgctg atctggacac cacagaggtt ccgagcactt 7260

taggttgcac caaatgtccc accaggtgca ggcagaaaac gctggaacag cgtgtacagt 7320

ttgtcttagc aaaaagtgaa ggcgctgagg tcgagcaggg tggtgtgact tgttatagcc 7380

tttagagctg cgaaagcgcg tatggatttg gctcatcagg ccagattgag ggtctgtgga 7440

cacatgtcat gttagtgtac ttcaatcgcc ccctggatat agccccgaca ataggccgtg 7500

gcctcatttt tttgccttcc gcacatttcc attgctcggt acccacacct tgcttctcct 7560

gcacttgcca accttaatac tggtttacat tgaccaacat cttacaagcg gggggcttgt 7620

ctagggtata tataaacagt ggctctccca atcggttgcc agtctctttt ttcctttctt 7680

tccccacaga ttcgaaatct aaactacaca tcacacaatg cctgttactg acgtccttaa 7740

gcgaaagtcc ggtgtcatcg tcggcgacga tgtccgagcc gtgagtatcc acgacaagat 7800

cagtgtcgag acgacgcgtt ttgtgtaatg acacaatccg aaagtcgcta gcaacacaca 7860

ctctctacac aaactaaccc agctctatgt ccgatcagaa gaagcacatt gttgtcattg 7920

gtgccggtat tggcggaact gctactgctg ctcgtcttgc tcgtgaaggt tttcgagtta 7980

ctgttgttga gaagaacgac ttttccggtg gccgttgttc tttcattcat cacgacggtc 8040

atcgatttga tcagggtccc tctctctact tgatgcctaa gctctttgaa gacgcatttg 8100

ctgacttgga cgagcgtatt ggtgatcact tggacttgct gcgatgtgac aataactata 8160

aggttcactt tgacgacggt gatgccgtgc agctctcttc cgatctgacc aagatgaagg 8220

gcgagttgga ccgtattgag ggtccccttg gatttggtag attcttggac ttcatgaagg 8280

agacacatgt ccactatgaa caaggtacat ttattgctat caagcgaaac tttgagacca 8340

tttgggattt gattcgtctc cagtatgtgc ctgagatctt tcgattgcac ttgtttggta 8400

agatctatga ccgagcctct aaatacttcc agaccaagaa aatgcgtatg gcttttacct 8460

ttcagacaat gtacatgggt atgtcgcctt acgatgctcc agcagtttac tctttgctcc 8520

agtacaccga gtttgctgaa ggtatctggt atcctcgtgg tggtttcaac atggttgttc 8580

agaagctgga gtctatcgcc tccaaaaagt acggtgctga gttcagatac cagtcgcctg 8640

ttgctaaaat taacactgtc gacaaagaca agcgtgtgac cggtgtcacc ttggagagcg 8700

gagaagtcat tgaagccgat gcagtcgtgt gtaatgcgga tcttgtttac gcttatcacc 8760

atctgctgcc tccttgcaat tggacaaaga agacactggc ctctaagaaa ctcacctctt 8820

cttctatttc gttttactgg tccatgtcta caaaggtgcc tcagctggac gtgcacaata 8880

tcttcttggc tgaagcctac aaggagtctt ttgacgagat tttcaacgac ttcggtttgc 8940

cctctgaagc gtctttctat gtcaacgttc catctcgaat tgatgagtct gccgcacctc 9000

ccaacaagga ctccattatt gtgttggttc caattggcca catgaagtct aagacaggaa 9060

actctgctga agagaattat cctgagttgg tgaaccgtgc acgaaagatg gttctggaag 9120

ttatcgagcg tcgtttggga gtgaacaact ttgctaattt gattgaacat gaagaagtga 9180

atgatccttc tgtttggcag agcaagttta acctctggag aggttctatt cttggtctgt 9240

ctcatgacgt gttccaagtt ctctggttca gaccttctac caaggactcc acaaaccgtt 9300

atgacaatct gttctttgtc ggagcttcta cacatccagg tactggtgtt cctatcgttc 9360

ttgctggatc taagctgacc tccgaccaag tctgtaagag ctttggccag aatcccctgc 9420

caagaaagct gcaagacagc cagaagaagt acgctcctga gcagactcga aagaccgaga 9480

gccactggat ctactactgt cttgcttgtt actttgttac cttcctcttt ttctatttct 9540

tcccaagaga tgacaccaca actcctgctt ctttcattaa ccaactgctg cctaacgttt 9600

tccaagtgca gaacagcaac gacattcgaa tttagtattt atcactcttt acaacttcta 9660

cctcaactat ctactttaat aaatgaatat cgtttattct ctatgattac tgtatatgcg 9720

ttcctctaag acaaatcgaa accagcatgt gatcgaatgg catacaaaag tttcttccga 9780

agttgatcaa tgtcctgata gtcaggcagc ttgagaagat tgacacaggt ggaggccgta 9840

gggaaccgat caacctgtct accagcgtta cgaatggcaa atgacgggtt caaagccttg 9900

aatccttgca atggtgcctt ggatactgat gtcacaaact taagaagcag ccgcttgtcc 9960

tcttcctcgg aattcaggag gacgagaagg tcaacaaggg tgaggcctgg agagagttct 10020

acaagggtcc ccgggatcgg ctgtacagaa ctggagatcc aggcagacaa ggtatagggc 10080

ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt 10140

gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag 10200

ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc 10260

gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa 10320

cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc 10380

gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc 10440

gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa 10500

aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat 10560

aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc 10620

tctcaagggc atcggtcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 10680

tagatttctg gtggtattgt gactggggat gtagttgaga ataagtcata cacaagtcag 10740

ctttcttcaa gcctcatata agtataagta gttcaatcgt attagctact tgtacccagc 10800

atctccgtat cgagaaacac aacaacatgc cccattggac agatcatgcg gatacacagg 10860

ttgtgcagta tcatacatac tcgatcagac aggtcgtctg accatcatac aagctgaaca 10920

agcgctccat acttgcacgc tctctatata cacagttaaa tgacatatcc atagtctaac 10980

ctctaacagt taatcttctg gtaagcctcc cagccagcct tctggtatcg cttggcctcc 11040

tcaataggat ctcggttctg gccgtacaga cctcggccga caattatgat atccgttccg 11100

gtagacatga catcctcaac agttcggtac tgctgtccga gagcgtctcc cttgtcgtca 11160

agacccaccc cgggggtcag aataagccag tcctcagagt cgcccttagg tcggttctgg 11220

gcaatgaagc caaccacaaa ctcggggtcg gatcgggcaa gctcaatggt ctgcttggag 11280

tactcgccag tggccagaga gcccttgcaa gacagctcgg ccagcatgag cagacctctg 11340

gccagcttct cgttgggaga ggggaccagg aactccttgt actgggagtt ctcgtagtca 11400

gagacgtcct ccttcttctg ttcagagaca gtttcctcgg caccagctcg caggccagca 11460

atgattccgg ttccgggtac accgtgggcg ttggtgatat cggaccactc ggcgattcgg 11520

tagacaccgt tcttgtactg gtgcttgaca gtgttgccaa tatctgcgaa ctttctgtcc 11580

tcgaacagga agaaaccgtg cttaagagca agttccttga gggggagcac agtgccggcg 11640

taggtgaagt cgtcaatgat gtcgatatgg gtcttgatca tgcacacata aggtccgacc 11700

ttatcggcaa gctcaatgag ctccttggtg gtggtaacat ccagagaagc acacaggttg 11760

gttttcttgg ctgccacgag cttgagcact cgagcggcaa aggcggactt gtggacgtta 11820

gctcgagctt cgtaggaggg cattttggtg gtgaagagga gactgaaata aatttagtct 11880

gcagaacttt ttatcggaac cttatctggg gcagtgaagt atatgttatg gtaatagtta 11940

cgagttagtt gaacttatag atagactgga ctatacggct atcggtccaa attagaaaga 12000

acgtcaatgg ctctctgggc gtcgcctttg ccgacaaaaa tgtgatcatg atgaaagcca 12060

gcaatgacgt tgcagctgat attgttgtcg gccaaccgcg ccgaaaacgc agctgtcaga 12120

cccacagcct ccaacgaaga atgtatcgtc aaagtgatcc aagcacactc atagttggag 12180

tcgtactcca aaggcggcaa tgacgagtca gacaggaggc agacaaggta tagggcggcg 12240

cctacaatcc atgccaaccc gttccatgtg ctcgccgagg cggcataaat cgccgtgacg 12300

atcagcggtc cagtgatcga agttaggctg gtaagagccg cgagcgatcc ttgaagctgt 12360

ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg 12420

ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt cgcgaacgcc 12480

agcaagacgt agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg cttctcgccg 12540

aaacgtttgg tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa gattccgaat 12600

accgcaagcg acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc gccgaaaatg 12660

acccagagcg ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac agtcataagt 12720

gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc 12780

aagggcatcg gtcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtatc 12840

gatagagacg gagtcactgc cttaattaac tttgatcttg ctgctaacat ctcttctact 12900

gctacttgtg atgactgtct tgtccacaat ggcttcatcc agtcctacaa caacacctac 12960

aatcagatcg gccccaagct cgactctgtg attgagcagt atcccgacta ccagattgct 13020

gtcaccggtc actctctcgg aggagctgca gcccttctgt tcggaatcaa cctcaaggtt 13080

aacggccacg atcccctcgt tgttactctt ggtcagccca ttgtcggtaa cgctggcttt 13140

gctaactggg tcgataaact cttctttggc caggagaacc ccgatgtctc caaggtgtcc 13200

aaagaccgaa agctctaccg aatcacccac cgaggagata tcgtccctca agtgcccttc 13260

tgggacggtt accagcactg ctctggtgag gtctttattg actggcccct gatccaccct 13320

cctctctcca acgttgtcat gtgccagggc cagagcaata aacagtgctc tgccggtaac 13380

actctgctcc agcaggtcaa tgtgattgga aaccatctgc agtacttcgt caccgagggt 13440

gtctgtggta tctaagctat ttatcactct ttacaacttc tacctcaact atctacttta 13500

ataaatgaat atcgtttatt ctctatgatt actgtatatg cgttcctcta agacaaatcg 13560

aaaccagcat gcgacgccac ccatggactc taagcggccg catggacctg tcgacttggc 13620

tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt tcgagcttgg 13680

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 13740

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 13800

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 13860

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 13920

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 13980

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 14040

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 14100

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 14160

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 14220

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 14280

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 14340

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 14400

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 14460

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 14520

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 14580

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 14640

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 14700

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 14760

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 14820

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 14880

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 14940

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 15000

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 15060

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 15120

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 15180

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 15240

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 15300

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 15360

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 15420

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 15480

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 15540

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 15600

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 15660

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 15720

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 15780

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgc 15837

<210> 9

<211> 15603

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120

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ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240

accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300

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gtacgtttac aaagttctca attccatcgt gcaaatcaaa atcacatcta ttcattcatc 1740

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gaggtggaca caaaataatg caaaatggct cgtagcttgg agacatcgtg gccagctgct 1920

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cgtttttcgt tttttgcttt ttttgatttt tttagggcca actaagcttc cagatttcgc 3000

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agagttggta atactgggag gatagataag gcacgaaaac gagccatagc agacatgctg 3180

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cgatattcat ttattaaagt agatagttga ggtagaagtt gtaaagagtg ataaatagcg 3900

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cttcagactg atagaggttg tacacggaca acagagcaat cttggcacgt tcgcttcctt 4020

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ccagctcttt gacgtgctgg aaaagggaaa tggcttgttt agggttctga ttctgaacag 4980

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gaatatagag aagagaagaa gaaaaaagat tcaattgagc cggcgatgca gacccttata 5820

taaatgttgc cttggacaga cggagcaagc ccgcccaaac ctacgttcgg tataatatgt 5880

taagcttttt aacacaaagg tttggcttgg ggtaacctga tgtggtgcaa aagaccgggc 5940

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tccatctcca agcacaagca gcccggttct accggcttcc atctccaagc acccctttct 6660

ccacacccca caaaaagacc cgtgcaggac atcctactgc gtgtttaaac aacaattgcc 6720

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aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 13620

agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 13680

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 13740

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 13800

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 13860

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 13920

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 13980

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 14040

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 14100

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 14160

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 14220

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 14280

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agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 15240

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ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 15360

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