一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法与流程

本发明涉及一种生物技术领域的PCR检测方法，具体是一种能同时检测金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR检测方法。

背景技术：

现有的国家标准《实验动物微生物学等级及监测》GB 14922.2-2011中对病原体的检测方法——以传统的分离培养、生化鉴定、血清型分析和特殊鉴定实验为主。在临床实践中，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体是实验动物的常见重要病原体，且易混合感染。传统的诊断技术如分离培养、免疫学试验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查的现状传统方法存在过程繁琐，费时，检出率低和漏检等缺陷。为了满足大样本的多种病原体的快速检测，急需一种快速、简便、准确率高的多重PCR检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法，其步骤简单，检测快速，准确性高，易于标准化，克服了现有技术的不足。

本发明的构思是这样的。随着PCR的核酸检定技术成功的在临床医学等领域的应用，建立多重PCR新技术检测成为可能。多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction)是在普通PCR的基础上加以改进，一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的片段的PCR技术。其可在同一PCR反应体系中同时加入多种病原体的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或不同型病原体。基于此，本发明本着一次性检测就可以检出样品中五种病原体的目标，首先从已发表的文献中筛选出具有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的保守性序列的基因，作为PCR检测的靶点，分别合成扩增对应保守序列的特异性引物，将5对引物同时放在一个PCR反应体系中，通过各项优化，建立直接从样本中一次性检测五种病原体的五重PCR检测方法。本发明还通过检测粪便改进取材，进一步实现利用该五重PCR方法快速检测实际样品的目的。

具体的，本发明的一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)筛选出具有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的保守性序列的基因，作为PCR检测的靶点，分别合成扩增对应保守序列的特异性引物；

(2)将5对引物同时放在一个PCR反应体系中，扩增出目的基因片段；

(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中，扩增金黄色葡萄球菌上游引物的序列如表1a所示，下游引物的序列如表1b所示；扩增绿脓杆菌上游引物的序列如表1c所示，下游引物的序列如表1d所示；扩增肺支原体上游引物的序列如表1e所示，下游引物的序列如表1f所示；扩增多杀巴氏杆菌上游引物的序列如表1g所示，下游引物的序列如表1h所示；扩增支气管败血性波氏杆菌上游引物的序列如表1i所示，下游引物的序列如表1j所示。具体见表1。

表1：引物序列及PCR产物

本发明中，步骤(1)，由于对引物的退火温度，片段长度等要求，最终选定金黄色葡萄球菌的nuc基因、绿脓杆菌的LasI基因、多杀巴氏杆菌的KMT1基因、支气管败血性波氏杆菌的Fla基因和肺支原体的16S rRNA基因设计特异性引物。

本发明中，步骤(2)，PCR反应体系为50μl，包括：Mix 25μl，引物7μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA每种1μl DNA，其余无菌水补足；反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环；72℃终延伸7min。

本发明中，步骤(3)，PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。

本发明中，实际检测样品前先选择人工掺病原体阳性标本验证体系检测能力，再取待检测样本粪便和气管分泌物，提取被检病原体的DNA，作为模板，进行五重PCR检测，全过程仅需要4h；并且通过检测粪便改进取材，进一步达到利用该五重PCR方法快速无创检测无创实际样品的目的。而常规的检测方法需要培养基接种，一般需24h长出菌落，再生化接种，此过程时间较长，并且对检测人员的技能要求高。本发明较常规方法缩短了检测时间，能进一步达到快速检测和检测标准化的目的。

本发明取得如下有益效果：

(1)较常规的PCR检测方法，本发明的五重PCR检测方法具有快速、灵敏、简便、准确的特点，同时降低了对检测人员的要求、检测平台和检测成本，提高了检测效率。

(2)该方法体系通过检测粪便改进取材，进一步达到利用该五重PCR方法快速无创检测无创实际样品的目的。

附图说明

图1是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR体系引物浓度的优化结果；其中：M为100bp DNA Ladder；泳道1-4：多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为1μl，0.5μl，0.25μl，0.125μl。

图2是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR体系退火温度的优化结果；其中：M为100bp DNA Ladder；泳道1：56℃；泳道2：58℃；泳道3：60℃；泳道4：62℃。

图3是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR人工样本的检测结果；其中：M为100bp DNA Ladder；泳道1：五重PCR阳性对照；泳道2：五重PCR阴性对照；泳道3：粪便阴性对照；泳道4：金黄色葡萄球菌；泳道5：绿脓杆菌；泳道6：金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌；泳道7：气管分泌物阴性对照；泳道8：多杀巴氏杆菌；泳道9：支气管败血性波氏杆菌；泳道10：肺支原体；泳道11：多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体；泳道12：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体。

图4是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR样本的检测结果；其中：M为100bp DNA Ladder；泳道1：五重PCR阳性对照；泳道2：五重PCR阴性对照；泳道3-17：样本的粪便和气管分泌物。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1 金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR体系退火温度的优化

(1)样品前处理

将标准的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体分别在相应的培养基或培养液中培养，其中金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌培养24h，多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌培养36h，肺支原体培养7d，收集菌液或菌落提取相应的DNA样本。

(2)细菌DNA提取

本发明采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，步骤如下：

①将上述5种病原体菌液或菌落溶于缓冲液GA,震荡悬浮；

②加入20μl Proteinase K溶液，混匀，加入220μl缓冲液GB，震荡15s，70℃10min，加入220μl无水乙醇，充分震荡混匀；

③将溶液和沉淀都加入一个吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液；

④向吸附柱加500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液；

⑤向吸附柱加600μl缓冲液PW，12000rpm离心30s，弃废液；重复一次；

⑥收集沉淀，30μl TE溶解。

(3)多重PCR反应体系建立

在PCR反应体系中，尤其是多重PCR反应体系中，引物浓度和退火温度是关键的影响因素。本发明为了找到合适的五重PCR体系的引物浓度和退火温度，进行如下实验：

①引物浓度的优化：反应体系：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌上下游引物各为1μl，多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为1μl、0.5μl、0.25μl、0.125μl，Mix 25μl，DNA每种1μl DNA，其余用无菌水补足至50μl；反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环；72℃终延伸7min；PCR产物10μl在2.5％琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。结果如图1显示2泳道较好。

②退火温度的优化：PCR反应体系为50μl，包括：Mix 25μl，引物7μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌上下游引物各为1μl，多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为0.5μl，DNA每种1μl DNA，其余无菌水补足。反应条件仅将退火温度分别设置为56℃,58℃,60℃,62℃，其余不变。结果如图2显示3泳道较好。

(4)结果

PCR反应体系为50μl，包括：Mix 25μl，引物7μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA每种1μl DNA，其余无菌水补足。反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环；72℃终延伸7min。

实施例2 金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR人工样本的检测

(1)样品前处理

取待检测动物的样本粪便和气管分泌物。

(2)细菌DNA提取

同实施例1

(3)多重PCR反应体系建立

PCR反应体系为50μl，Mix 25μl，引物7μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA分别为阳性对照5μl，阴性对照0μl，样本粪便和气管分泌物各2μl，其余无菌水补足至50μl。反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环；72℃终延伸7min。PCR产物10μl在2.5％琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。

(4)结果

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR样本的检测结果如图3所示：1阳性对照；2阴性对照；3、7粪便和气管分泌物的阴性对照；4金黄色葡萄球菌；5绿脓杆菌；6金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌；8多杀巴氏杆菌；9支气管败血性波氏杆菌；10肺支原体；11多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体；12金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体。由结果看出，该五重PCR检测体系可以检出金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体。

实施例3 金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR样本的检测

(1)样品前处理

取待检测动物的样本粪便和气管分泌物。

(2)细菌DNA提取

同实施例1

(3)多重PCR反应体系建立

PCR反应体系为50μl，Mix 25μl，引物7μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体上下游引物各为1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA分别为阳性对照5μl，阴性对照0μl，样本粪便和气管分泌物各2μl，其余无菌水补足至50μl。反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环；72℃终延伸7min。PCR产物10μl在2.5％琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。

(4)结果

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的五重PCR样本的检测结果如图4所示：1阳性对照；2阴性对照；3-17样本的粪便和气管分泌物。阳性对照和阴性对照良好，样本的检测为阴性，与传统方法的检测结果一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学

<120> 一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

cacctgaaac aaagcatcct aa 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 2

tatacgctaa gccacgtcca t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 3

atgatcgtac aaattggtcg g 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 4

gtcatgaaac cgccagtc 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Bordetella bronchiseptica

<400> 5

aggctcccaa gagagaaagg ctt 23

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Bordetella bronchiseptica

<400> 6

tggcgcctgc cctatc 16

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 7

agcgtttgct tcactttgaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 8

gggcatttcc ctccctagct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida

<400> 9

gtgagtgggc ttctcggtag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida

<400> 10

gctgtaaacg aactcgccac 20