一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法与流程

文档序号:12097998阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法,其特征在于包括以下步骤:

(1)筛选出具有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的保守性序列的基因,作为PCR检测的靶点,分别合成扩增对应保守序列的特异性引物;

(2)将5对引物同时放在一个PCR反应体系中,扩增出目的基因片段;

(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物;其中,扩增金黄色葡

萄球菌上游引物的序列如表1 a所示,下游引物的序列如表1 b所示;扩增绿脓杆菌上游引物的序列如表1 c所示,下游引物的序列如表1 d所示;扩增肺支原体上游引物的序列如表1 e所示,下游引物的序列如表1 f所示;扩增多杀巴氏杆菌上游引物的序列如表1 g所示,下游引物的序列如表1 h所示;扩增支气管败血性波氏杆菌上游引物的序列如表1 i所示,下游引物的序列如表1 j所示;。

2.根据权利要求1所述的五重PCR检测方法,其特征在于步骤(1)中,

金黄色葡萄球菌的保守性序列的基因为nuc基因、绿脓杆菌的保守性序列的基因为LasI基因、多杀巴氏杆菌的保守性序列的基因为KMT1基因、支气管败血性波氏杆菌的保守性序列的基因为Fla基因、肺支原体的保守性序列的基因为16S rRNA基因。

3.根据权利要求1所述的五重PCR检测方法,其特征在于步骤(2)中,PCR反应体系为50ml,包括:Mix 25ml,引物 7ml,引物起始浓度为10mM,每条引物金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体加入体积分别为1ml、1ml、0.5ml、0.5ml、0.5ml,其余无菌水补足;反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,60℃ 30s,72℃ 30s,共30个循环; 72℃ 7 min。

4.根据权利要求1所述的五重PCR检测方法,其特征在于步骤(3)中,PCR产物在2.5% 琼脂糖凝胶中,120 V 电泳30 min。

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