一种检测MAPT基因突变的探针和试剂盒及其方法与流程
本发明涉及生物医学领域，具体是涉及一种检测MAPT基因突变的探针和试剂盒及其方法。
背景技术：
进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)又称Steele-Richardson-Olszewski综合征，是一种临床少见的中枢神经系统变性疾病。PSP是继帕金森病(PD)之后最常见的退行性帕金森综合征，其发病率约占PD的6％～10％。1904年由Posey首先发现并描述其临床表现，1964年Steele等(Steele JC,Richardson JC,et al.Progressive supranuclear palsy:a heterogeneous degeneration involving the brainstem,basal ganglia and cerebellum with vertical supranuclear gaze and pseudobulbar palsy,nuchal dystonia and dementia.Arch Neurol,1964,10:333-359.)将此病列为独立的神经系统疾病。PSP主要临床特征为早期出现姿势不稳、垂直性核上性麻痹、假性球麻痹、核上性眼球运动障碍、颈部肌张力障碍、构音障碍、假性延髓麻痹、轻度痴呆和帕金森综合征类似症状等。
PSP的发病年龄在55～70岁之间，少数可早至45岁发病，平均初诊年龄66.4±7岁。PSP的发病率有随年龄增长而增高的趋势，50～59岁为1.7/10万，80-99岁为14.7/10万，各年龄组中男性多于女性，男女之比约为5：3。有关PSP的流行病学的研究报道较少，Schrag等对英国伦敦约12万人的流行病学调查显示，PSP的患病率约为6.4/10万，年发病率(1.14～1.21)/10万；自出现症状后可生存1.2～16.6年，平均5.3年。患者多死于肺炎等并发症(Schrag A,Ben-Shlomo Y,et al.Prevalance of progerssive supranuclear palsy and multiple system atrophy:a cross-sectional study.Lancet,1999,354:1771-1775.)。
目前认为PSP是一种Tau蛋白病(tauopathy)，病理上可见丘脑底核、脑干以及小脑上脚萎缩、黒质脱色等表现，镜下可见在基底节、间脑和脑干有Tau蛋白病理性聚集形成的神经元纤维缠结、线型神经纤维网结构、丛状星形细胞以及少突胶质细胞螺旋小体等结构(Dickson DW,Rademakers R,et al.Progressive supranuclear palsy:pathology and genetics.Brain Pathol,2007；17(1):74-82.)。确诊PSP需要依靠上述组织病理学检查结果，而临床诊断主要依靠其临床表现。目前，在PSP发病后期可以通过CT、MRI和PET检测等功能影像学方法辅助诊断，但没有在早期较好地客观辅助医生进行确诊的技术方法。PSP与原发性PD及其他非典型帕金森综合征，如多系统萎缩(MSA)、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆(DLB)等都具有相似的症状，且早期临床症状不典型，鉴别诊断非常困难，极易造成误诊和漏诊(Armstrong RA.Visual signs and symptoms of progressive supranuclear palsy.Clin Exp Optom,2011；94(2):150-160.)，PSP患者从症状首发到获得正确诊断的平均时间是3.6～4.9年(Barsottini OG,Felício AC,et al.Progressive supranuclear palsy:new concepts.Arq Neuropsiquiatr,2010；68(6):938-946.)。此外，近年来发现PSP具有明显的临床异质性(clinical heterogeneity)，许多尸检病理证实的PSP患者生前并不具备上述典型临床表现，各种临床变异型相继得到确认，这不仅推动了PSP疾病分类学的研究，同时也使得PSP的临床诊断变得愈加复杂，面临更大的挑战。
Tau蛋白属于微管相关蛋白家族成员，主要分布在神经元轴突中，具有促进微管组装和稳定微管的生理功能。Tau蛋白是由位于人的17q21染色体上的MAPT基因编码，正常成人脑内存在6种Tau蛋白的异构体。在病理状态下，过度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神经元纤维缠结，最终导致神经细胞死亡。PSP疾病的一个重要的病理特征是神经细胞内有Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结，而MAPT基因突变是引发神经纤维缠结的主要因素之一(Longoni G,Agosta F,et al.MRI measurements of brainstem structures in patients with Richardson's syndrome,progressive supranuclear palsy-parkinsonism,and Parkinson's disease.Mov Disord,2010Dec 15.[Epub ahead of print]PubMed PMID:21162106.)。目前许多研究发现，发生在编码Tau蛋白的MAPT基因上的一些突变，包括R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V，都与PSP的发病密切相关。
由于MAPT基因突变是PSP发病因素之一，且PSP具有发病隐匿和明显的异质性等特点，早期利用基因诊断进行快速检测非常重要。它可直接检测被检者的MAPT基因结构或功能是否异常，相对于常规诊断，更注重个体基因状态，不仅可以对患者做出进一步诊断，也可以对表型正常但携带MAPT基因某种突变或者对疾病的易感性做出判断，为PSP的快速诊断和早期筛查提供技术支撑。目前应用于PSP风险基因突变检测的技术主要是聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)法。该方法是根据MAPT基因突变后碱基的不同选择一种限制性内切酶，该种内切酶只对其中的一种多态性具有切割的作用，而对另一种多态性不会产生切割。这种方法首先通过引物对MAPT基因的突变位点进行PCR反应，然后对PCR产物使用限制性内切酶进行酶切反应，再把酶切产物进行电泳分析，根据所得到的片断大小来对MAPT基因多态性位点进行分析。但该方法存在许多不足：首先，该方法依靠限制性内切酶的活性，在酶切过程中容易产生假阳性和假阴性的结果；其次，电泳的方法容易造成PCR产物污染，导致结果的误判；再次，该方法费时(约5～6h)，耗工，至少包括PCR扩增、酶切、电泳、凝胶成像分析四个步骤，需要大量人工操作，自动化程度低，人为误差大。
实时荧光PCR具有快速、准确、无污染的特点，已成为分子诊断实验室的常规仪器平台。目前，尚未见到利用实时荧光PCR的方法来对MAPT基因R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突变进行研究的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供快速、灵敏、特异的一种检测MAPT基因突变的探针。
本发明的第二目的在于提供一种检测MAPT基因突变的试剂盒。
本发明的第三目的在于提供一种检测MAPT基因突变的方法。
所述检测MAPT基因突变的探针包括但不限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针、双环探针等中的至少一种。
所述荧光探针的5’端标记荧光基团，3’端标记相应的淬灭基团。用于检测MAPT基因编码蛋白R5L突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于检测MAPT基因编码蛋白A152T突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于检测MAPT基因编码蛋白L284R突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于检测MAPT基因编码蛋白S285R突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；用于检测MAPT基因编码蛋白N296del突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；用于检测MAPT基因编码蛋白G303V突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；探针序列可由其碱基互补序列替换。
所述检测MAPT基因突变的试剂盒包括扩增引物、荧光探针、扩增试剂和参照试剂；
所述扩增引物包括特异性扩增MAPT基因编码蛋白R5位点的引物，其碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；特异性扩增MAPT基因编码蛋白A152位点的引物，其碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；特异性扩增MAPT基因编码蛋白L284、S285、N296和G303位点的引物，其碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；引物序列可由其碱基互补序列替换。
所述试剂盒采用两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内可以同时指示两个目标片段的存在情况。常用的荧光基团包括但不限于现有的各种荧光标记物，如ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5等。常用的淬灭基团包括但不限于现有的各种淬灭剂，如DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE等。
所述荧光探针的5’端标记荧光基团，3’端标记相应的淬灭基团。用于检测MAPT基因编码蛋白R5L突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于检测MAPT基因编码蛋白A152T突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于检测MAPT基因编码蛋白L284R突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于检测MAPT基因编码蛋白S285R突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；用于检测MAPT基因编码蛋白N296del突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；用于检测MAPT基因编码蛋白G303V突变的探针，其碱基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；探针序列可由其碱基互补序列替换。
所述荧光探针包括但不限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针、双环探针等中的至少一种。
所述扩增试剂包括：PCR反应缓冲液；MgCl2；热启动Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。所述MgCl2的浓度可为1～5mmol/L；所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的浓度均可为50～400μmol/L；所述热启动Taq酶的单位可为1～3U/反应。
所述参照试剂包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为分别包含MAPT基因编码蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位点的阳性标准品1(正常DNA片段)、阳性标准品2(突变DNA片段)和阳性标准品3(由阳性标准品1和阳性标准品2等量混合)；所述阴性对照可自选ddH2O、Nuclease-free Water、Tris-HCl缓冲液等中的一种。
所述检测MAPT基因突变的方法，包括以下步骤：
1)样本的选择
MAPT基因编码蛋白R5位点基因型为WT/WT的样本，基因型为R5L/R5L的样本，基因型为WT/R5L的样本，所有的样本均已通过DNA测序的方法进行验证；
2)基因组DNA的提取
用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA；
3)实时荧光PCR扩增与检测
实时荧光PCR反应体系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L Mg2+，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.5μmol/L的上、下游引物，0.5μmol/L各荧光探针，1U热启动Taq酶，25ng人基因组DNA；
实时荧光PCR反应在Roche LightCycler 480Ⅱ仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：
第一阶段：95℃2min；
第二阶段：95℃20sec，64℃20sec(荧光采集)，72℃30sec，38个循环；
两个荧光检测频道分别为FAM和HEX；
4)结果分析
MAPT基因编码蛋白R5位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为R5L/R5L突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/R5L杂合子。
与现有检测方法及相关技术相比，本发明具有以下突出优点：
(1)应用实时荧光PCR技术结合荧光探针，可以实时观察实验结果。同时检测更加灵敏、快速，操作更加简便，易于自动化，大大减少了交叉污染的几率，提高了检测的准确性。
(2)在一个反应管中就可以对MAPT基因的一个或多个突变位点进行基因分型，节省成本的同时又提高了通量。
附图说明
图1为利用本发明对已知MAPT基因编码蛋白R5位点基因型的对照样本和一未知的人基因组样本进行PCR扩增分析的荧光结果图。其中(A)为WT/WT阳性标准品1，(B)为R5L/R5L阳性标准品2，(C)为WT/R5L阳性标准品3，(D)为纯水样本作为阴性对照，(E)为未知的人基因组样本。
图2为利用本发明对已知MAPT基因编码蛋白A152位点基因型的对照样本和一未知的人基因组样本进行PCR扩增分析的荧光结果图。其中(A)为WT/WT阳性标准品1，(B)为A152T/A152T阳性标准品2，(C)为WT/A152T阳性标准品3，(D)为纯水样本作为阴性对照，(E)为未知的人基因组样本。
图3为利用本发明对已知MAPT基因编码蛋白L284位点基因型的对照样本和一未知的人基因组样本进行PCR扩增分析的荧光结果图。其中(A)为WT/WT阳性标准品1，(B)为L284R/L284R阳性标准品2，(C)为WT/L284R阳性标准品3，(D)为纯水样本作为阴性对照，(E)为未知的人基因组样本。
图4为利用本发明对已知MAPT基因编码蛋白S285位点基因型的对照样本和一未知的人基因组样本进行PCR扩增分析的荧光结果图。其中(A)为WT/WT阳性标准品1，(B)为S285R/S285R阳性标准品2，(C)为WT/S285R阳性标准品3，(D)为纯水样本作为阴性对照，(E)为未知的人基因组样本。
图5为利用本发明对已知MAPT基因编码蛋白N296位点基因型的对照样本和一未知的人基因组样本进行PCR扩增分析的荧光结果图。其中(A)为WT/WT阳性标准品1，(B)为N296del/N296del阳性标准品2，(C)为WT/N296del阳性标准品3，(D)为纯水样本作为阴性对照，(E)为未知的人基因组样本。
图6为利用本发明对已知MAPT基因编码蛋白G303位点基因型的对照样本和一未知的人基因组样本进行PCR扩增分析的荧光结果图。其中(A)为WT/WT阳性标准品1，(B)为G303V/G303V阳性标准品2，(C)为WT/G303V阳性标准品3，(D)为纯水样本作为阴性对照，(E)为未知的人基因组样本。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，本发明并不限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的技术人员，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的MAPT基因突变的检测。
实施例1实时荧光PCR检测MAPT基因编码蛋白R5L突变位点的基因型
一.材料
1.仪器：
实时荧光PCR仪、移液器、离心机。
2.引物、探针设计：
本发明设计了可以特异扩增包含MAPT基因编码蛋白R5位点的引物，以及特异识别MAPT基因编码蛋白R5位点野生型和突变型的探针。野生型探针5’端标记为FAM，3’端标记为BHQ1；野生型探针5’端标记为HEX，3’端标记为BHQ1。
用到的引物和探针信息如表1所示。
表1引物与探针信息列表
3.试剂：
1×PCR buffer：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl；MgCl2；热启动Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
二.方法
1.样本的选择
MAPT基因编码蛋白R5位点基因型为WT/WT的样本，基因型为R5L/R5L的样本，基因型为WT/R5L的样本。所有的样本均已通过DNA测序的方法进行验证。
2.基因组DNA的提取
用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA。
3.实时荧光PCR扩增与检测
实时荧光PCR反应体系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L Mg2+，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.5μmol/L的上、下游引物，0.5μmol/L各荧光探针，1U热启动Taq酶，25ng人基因组DNA。
实时荧光PCR反应在Roche LightCycler 480Ⅱ仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：
第一阶段：95℃2min；
第二阶段：95℃20sec，64℃20sec(荧光采集)，72℃30sec，38个循环；
两个荧光检测频道分别为FAM和HEX。
4.结果分析
MAPT基因编码蛋白R5位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为R5L/R5L突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/R5L杂合子。
从图1可以看出，(A)为已知MAPT基因型的阳性标准品1，只在FAM频道中有扩增信号产生，为WT/WT纯合子，与实际情况相符；(B)为已知MAPT基因型的阳性标准品2，只在HEX频道中有扩增信号产生，为R5L/R5L突变纯合子，与实际情况相符；(C)为已知MAPT基因型的阳性标准品3，在FAM和HEX频道中均有扩增信号产生，为WT/R5L杂合子，与实际情况相符；(D)为纯水作为阴性对照，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生；(E)为未知人基因组样本，可以看出与(A)结果相同，只在FAM频道中有扩增信号产生，即为WT/WT纯合子，可以判断该未知样本的MAPT基因没有R5L突变。
实施例2实时荧光PCR检测MAPT基因编码蛋白A152T突变位点的基因型
按照实施例1的方法和步骤，进行实时荧光PCR扩增。
用到的引物和探针信息如表1所示。
结果分析：
MAPT基因编码蛋白A152位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为A152T/A152T突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/A152T杂合子。
从图2可以看出，(A)为已知MAPT基因型的阳性标准品1，只在FAM频道中有扩增信号产生，为WT/WT纯合子，与实际情况相符；(B)为已知MAPT基因型的阳性标准品2，只在HEX频道中有扩增信号产生，为A152T/A152T突变纯合子，与实际情况相符；(C)为已知MAPT基因型的阳性标准品3，在FAM和HEX频道中均有扩增信号产生，为WT/A152T杂合子，与实际情况相符；(D)为纯水作为阴性对照，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生；(E)为未知人基因组样本，可以看出与(A)结果相同，只在FAM频道中有扩增信号产生，即为WT/WT纯合子，可以判断该未知样本的MAPT基因没有A152T突变。
实施例3实时荧光PCR检测MAPT基因编码蛋白L284R突变位点的基因型
按照实施例1的方法和步骤，进行实时荧光PCR扩增。
用到的引物和探针信息如表1所示。
结果分析：
MAPT基因编码蛋白L284位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为L284R/L284R突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/L284R杂合子。
从图3可以看出，(A)为已知MAPT基因型的阳性标准品1，只在FAM频道中有扩增信号产生，为WT/WT纯合子，与实际情况相符；(B)为已知MAPT基因型的阳性标准品2，只在HEX频道中有扩增信号产生，为L284R/L284R突变纯合子，与实际情况相符；(C)为已知MAPT基因型的阳性标准品3，在FAM和HEX频道中均有扩增信号产生，为WT/L284R杂合子，与实际情况相符；(D)为纯水作为阴性对照，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生；(E)为未知人基因组样本，可以看出与(A)结果相同，只在FAM频道中有扩增信号产生，即为WT/WT纯合子，可以判断该未知样本的MAPT基因没有L284R突变。
实施例4实时荧光PCR检测MAPT基因编码蛋白S285R突变位点的基因型
按照实施例1的方法和步骤，进行实时荧光PCR扩增。
用到的引物和探针信息如表1所示。
结果分析：
MAPT基因编码蛋白S285位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为S285R/S285R突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/S285R杂合子。
从图4可以看出，(A)为已知MAPT基因型的阳性标准品1，只在FAM频道中有扩增信号产生，为WT/WT纯合子，与实际情况相符；(B)为已知MAPT基因型的阳性标准品2，只在HEX频道中有扩增信号产生，为S285R/S285R突变纯合子，与实际情况相符；(C)为已知MAPT基因型的阳性标准品3，在FAM和HEX频道中均有扩增信号产生，为WT/S285R杂合子，与实际情况相符；(D)为纯水作为阴性对照，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生；(E)为未知人基因组样本，可以看出与(A)结果相同，只在FAM频道中有扩增信号产生，即为WT/WT纯合子，可以判断该未知样本的MAPT基因没有S285R突变。
实施例5实时荧光PCR检测MAPT基因编码蛋白N296del突变位点的基因型
按照实施例1的方法和步骤，进行实时荧光PCR扩增。
用到的引物和探针信息如表1所示。
结果分析：
MAPT基因编码蛋白N296位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为N296del/N296del突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/N296del杂合子。
从图5可以看出，(A)为已知MAPT基因型的阳性标准品1，只在FAM频道中有扩增信号产生，为WT/WT纯合子，与实际情况相符；(B)为已知MAPT基因型的阳性标准品2，只在HEX频道中有扩增信号产生，为N296del/N296del突变纯合子，与实际情况相符；(C)为已知MAPT基因型的阳性标准品3，在FAM和HEX频道中均有扩增信号产生，为WT/N296del杂合子，与实际情况相符；(D)为纯水作为阴性对照，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生；(E)为未知人基因组样本，可以看出与(A)结果相同，只在FAM频道中有扩增信号产生，即为WT/WT纯合子，可以判断该未知样本的MAPT基因没有N296del突变。
实施例6实时荧光PCR检测MAPT基因编码蛋白G303V突变位点的基因型
按照实施例1的方法和步骤，进行实时荧光PCR扩增。
用到的引物和探针信息如表1所示。
结果分析：
MAPT基因编码蛋白G303位点基因型判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为G303V/G303V突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/G303V杂合子。
从图6可以看出，(A)为已知MAPT基因型的阳性标准品1，只在FAM频道中有扩增信号产生，为WT/WT纯合子，与实际情况相符；(B)为已知MAPT基因型的阳性标准品2，只在HEX频道中有扩增信号产生，为G303V/G303V突变纯合子，与实际情况相符；(C)为已知MAPT基因型的阳性标准品3，在FAM和HEX频道中均有扩增信号产生，为WT/G303V杂合子，与实际情况相符；(D)为纯水作为阴性对照，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生；(E)为未知人基因组样本，可以看出与(A)结果相同，只在FAM频道中有扩增信号产生，即为WT/WT纯合子，可以判断该未知样本的MAPT基因没有G303V突变。
以下给出具体实施例。
用于检测MAPT基因突变的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，所述扩增引物包括用于扩增MAPT基因编码蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位点的引物，所述荧光探针包括用于检测MAPT基因编码蛋白R5、A152、L284、S285、N296和G303的野生型和突变型探针；
所述试剂盒还包括：
特异性扩增MAPT基因编码蛋白R5位点的引物，其碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
特异性扩增MAPT基因编码蛋白A152位点的引物，其碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
特异性扩增MAPT基因编码蛋白L284、S285、N296和G303位点的引物，其碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
用于检测MAPT基因编码蛋白R5位点的野生型和突变型探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
用于检测MAPT基因编码蛋白A152位点的野生型和突变型探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
用于检测MAPT基因编码蛋白L284位点的野生型和突变型探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
用于检测MAPT基因编码蛋白S285位点的野生型和突变型探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；
用于检测MAPT基因编码蛋白N296位点的野生型和突变型探针，其碱基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；
用于检测MAPT基因编码蛋白G303位点的野生型和突变型探针，其碱基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；
上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
所述探针采用至少两种不同荧光基团标记，在一个反应管内同时指示至少两个目标片段的存在情况，所述多种不同荧光基团包括任意发射波长不同的荧光基团的组合。
所述SEQ ID NO:7、9、11、14、16碱基序列的5’和3’两端分别偶联上FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团；所述SEQ ID NO:8、10、12、13、15、17碱基序列的5’和3’两端分别偶联上HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团。
所述试剂盒还包括实时荧光PCR反应所需试剂：PCR反应缓冲液；MgCl2；热启动Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
所述MgCl2的浓度可为1～5mmol/L；所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的浓度均可为50～400μmol/L。
检测时，每个反应管内包括用于检测R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突变中至少一种突变的探针，以及相应的扩增引物；对待检测的DNA样品进行PCR扩增检测，根据荧光信号进行结果判断。
所述PCR扩增反应程序为：95℃2min；95℃20sec，64℃20sec，72℃30sec，38个循环。
结果判断为：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为Mut/Mut突变纯合子；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/Mut杂合子。
所述试剂盒中的荧光探针可用于检测MAPT基因编码蛋白R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突变。
序 列 表
<110>厦门大学
<120>一种检测MAPT基因突变的探针和试剂盒及其方法
<160> 17
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
atctgcctgccatgaactgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
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<213>人工序列
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gactcttggtggcagtaactt 21
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