本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是医院内感染中最常见的革兰阴性条件致病菌，可引起肺炎、脑膜炎、败血症等急性或慢性感染。由于其具有多重耐药的特点，且具有先天和后天获得的耐药性，因此，其感染后的临床治疗十分困难。因此，对铜绿假单胞菌DAN检测的研究显得尤为重要。
目前临床上多采样扩增检测铜绿假单胞菌DNA的方法，临床上扩增检测铜绿假单胞菌DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样本的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
目前国内有少量基于实时荧光定量PCR技术开发的铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒，但是他们存在以下缺陷；核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，检测结果的准确度低。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于提供一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法，以解决国内有少量基于实时荧光定量PCR技术开发的铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒，检测过程，检测准确度低的问题。
根据本发明的实施例第一方面，提供了一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；
所述引物包括上游引物和下游引物；
所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为：TL-P:5'-FAM-CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC-BHQ1-3'；
所述上游引物和所述下游引物的碱基对序列分别为：
上游引物TL-F：5'-ACCCGAACGCAGGCTATGG-3'；
下游引物TL-R：5'-GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG-3'。
所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。
进一步，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，所述内标的碱基对的序列为：
5’-ACCCGAACGCAGGCTATGGCAGTTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGGGCAATTCCTTTCTGGTCGACTACGTATCTCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTC-3’。
进一步，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱基对序列为：
IC-P:5'-HEX-TTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGG-BHQ1-3'。
进一步，所述PCR反应液还包：ROX溶液。
进一步，所述酶混合液由1U/μl～5U/μl耐热DNA聚合酶和0.05U/μl～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶组成。
进一步，所述PCR缓冲液由浓度为200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积/体积为0.2％曲拉通溶液和体积/体积为10％甲酰胺溶液组成，其中，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的pH为7.5。
进一步，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05IU/ml的铜绿假单胞菌病毒的灭活血清。
进一步，所述核酸释放剂包括：浓度为0.02～0.6mM/L的莎梵婷、浓度为60～220mM/L的氯化钾、浓度为0.02％～3％mM/L十二烷基磺酸钠和体积/体积为0.01％～2％的乙醇。
进一步，所述阴性对照为不含有铜绿假单胞菌病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的灭活阴性血清。
本发明实施例第二方面示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S101：向每个PCR反应管中均加入核酸释放剂4～20μl，并依次加入待测样本，阴性对照，阳性对照；
S102；向每个PCR反应管中均加入PCR混合液35～50μl，2000rpm离心30秒，取上清液，放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试，其中每个PCR反应管中加入PCR混合液为反应液35～45μl，酶混合液1～4μl和内标0.1～1μl。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法,所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。本发明实施例示出的检测试剂盒对铜绿假单胞菌已知基因oprl的序列进行比对分析的基础上，找到该基因最保守区域，设计引物和探针，经过大量的筛选，选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出铜绿假单胞菌DNA，但不能检测出非铜绿假单胞菌病原体，具有较高的特异性，因此大大提高了检测灵敏度，准确度和稳定性，同时本发明实施例示出的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR的检测方法，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外膜，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA的释放和提取；所述方法具体有检测准确度高，操作快速，方法简单和线性范围宽等优点。本发明实施例示出的免核酸提取、检测方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对血浆、尿液等样本中铜绿假单胞菌DNA进行快速、准确的检测，检测结果可用于铜绿假单胞菌感染的辅助诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为根据一优选实施例示出的一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒,所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液和内标；
所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上游引物、用于靶多核苷酸扩增的下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针；
所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为：TL-P:5'-FAM-CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC-BHQ1-3'；
所述上游引物和所述下游引物的碱基对序列分别为：
上游引物TL-F：5'-ACCCGAACGCAGGCTATGG-3'；
下游引物TL-R：5'-GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG-3'。
所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。
其中所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP。
本发明在对铜绿假单胞菌已知基因oprl的序列进行比对分析的基础上，找到该基因最保守区域，设计用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针，经过大量的筛选，选出了扩增效果最好的一对引物和探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为TL-P：5'-FAM-CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC-BHQ1-3'，上游引物的碱基序列TL-F：5'-ACCCGAACGCAGGCTATGG-3'；下游引物的碱基序列TL-R：5'-GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG-3'。所述检测试剂盒，可检出铜绿假单胞菌DNA，但不能检测出非铜绿假单胞菌病原体，但不能检测出非铜绿假单胞菌病原体，具有较高的特异性，因此大大提高了检测灵敏度，准确度和稳定性。
优选的，本发明实施例选取的内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体浓度为5.00E+04copies/ml～5.00E+05copies/ml，作为PCR扩增体系中的阳性内对照，可有效的避免样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性；所述内标的碱基对的序列为：
5’-ACCCGAACGCAGGCTATGGCAGTTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGGGCAATTCCTTTCTGGTCGACTACGTATCTCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTC-3’；
优选的，本发明实施通过实验筛选出最优的内标的探针，所述内标的探针的碱基对序列为IC-P:5'-HEX-TTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGG-BHQ1-3'。
采用本发明实施示出的内标的探针，可有效地提高所述试剂盒具有很好的特异性。在待测样本提取过程中增加了内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。
进一步，本发明实施例通过大量的实验对所述检测试剂盒各试剂的用量进行的优化。
优选的，所述酶混合液由1U/μl～5U/μl耐热DNA聚合酶和0.05U/μl～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)组成。
利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；
优选的，所述PCR反应液还包：ROX溶液。
本发明实施例在PCR反应液中增加了ROX(参比荧光)溶液，通过ROX荧光归一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和定量分析的准确性。荧光定量PCR扩增结束后，根据各样本检测结果的Ct值大小和扩增曲线形状进行阴阳性判断，可为铜绿假单胞菌感染提供可靠的实验证据。
优选的，所述PCR缓冲液由浓度为200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积/体积为0.2％曲拉通溶液和体积/体积为10％甲酰胺溶液组成，其中，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的pH为7.5。
优选的，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05IU/ml的铜绿假单胞菌病毒的灭活血清。
优选的，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为不含有铜绿假单胞菌病毒、丙肝病毒、艾滋病毒或梅毒的灭活阴性血清。
优选的，所述核酸释放剂包括：浓度为0.02～0.6mM/L的莎梵婷、浓度为60～220mM/L的氯化钾、浓度为0.02％～3％mM/L十二烷基磺酸钠和体积/体积为0.01％～2％的乙醇。
本发明第二方面示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测方法如图1所示，所述方法包括如下步骤：
S101：向每个PCR反应管中均加入核酸释放剂4～20μl，并依次加入待测样本，阴性对照，阳性对照；
具体的，首先，对待测样本进行编号，然后，数个PCR反应管，所述PCR反应管包括待测样本PCR反应管，阳性对照PCR反应管和阴性对照PCR反应管；所述PCR反应管的数目比所述待测样本的数目多两个，这两个PCR反应管分别作为阳性对照PCR反应管和阴性对照PCR反应管；对PCR反应管进行编号，将每个PCR反应管中均加入4～20μl的核酸释放剂，将所述待测样本依次加入对应编号的PCR反应管；在阳性对照PCR反应管加入阳性对照，在阴性对照PCR反应管加入阴性对照。
优选的，每个PCR反应管中加入核酸释放剂4～20μl本发明实施例采样深吸浅打的方式进行加样，有效的避免了PCR反应管气泡的生成，避免气泡对荧光测试结果的影响。
S102；向每个PCR反应管中均加入PCR混合液35～50μl，2000rpm离心30秒，取上清液，放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试，其中每个PCR反应管中加入PCR混合液为反应液35～45μl，酶混合液1～4μl和内标0.1～1μl。
5～15分钟后，向每个PCR反应管中均加入PCR混合液35～50μl，2000rpm离心30秒，取上清液，放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
本发明实施例将离心后的上清液转移至荧光定量PCR扩增仪的样本槽中，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。
本发明实施例选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测待测样本；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为ROX。
荧光定量PCR反应条件为：
结果分析：
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定量结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；根据各样本检测结果的Ct值大小和扩增曲线形状进行判断。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值≤36，可以判为阳性；如果结果Ct值＞36，且内标为阳性(内标Ct值≤36)，可以判为阴性。
本发明实施例在对铜绿假单胞菌已知基因oprl的序列进行比对分析的基础上，找到该基因最保守区域，设计引物和探针，经过大量的筛选，选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出铜绿假单胞菌DNA，但不能检测出非铜绿假单胞菌病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。
同时，本发明实施例对铜绿假单胞菌的提取方法进行了比较和优化，选择了核酸释放的方法释放核酸；具体的，本发明实施例采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外膜，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA的释放和提取，检测灵敏度可达500copies/ml，检测范围为500copies/ml～5.0×108copies/ml。进一步本发明实施例对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；
在待测样本提取过程中增加了内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性；
在PCR反应体系中增加了ROX(参比荧光)溶液，通过ROX荧光归一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和定量分析的准确性。荧光定量PCR扩增结束后，根据各样本检测结果的Ct值大小和扩增曲线形状进行阴阳性判断，可为铜绿假单胞菌感染提供可靠的实验证据。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法,所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。本发明实施例示出的检测试剂盒对铜绿假单胞菌已知基因oprl的序列进行比对分析的基础上，找到该基因最保守区域，设计引物和探针，经过大量的筛选，选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出铜绿假单胞菌DNA，但不能检测出非铜绿假单胞菌病原体，具有较高的特异性，因此大大提高了检测灵敏度，准确度和稳定性，同时本发明实施例示出的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR的检测方法，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外膜，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA的释放和提取；所述方法具体有检测准确度高，操作快速，方法简单和线性范围宽等优点。本发明实施例示出的免核酸提取、检测方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对血浆、尿液等样本中铜绿假单胞菌DNA进行快速、准确的检测，检测结果可用于铜绿假单胞菌感染的辅助诊断。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法
<130> 2016
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 探针
<400> 1
cggcttcgtc gctcaggctg c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 2
acccgaacgc aggctatgg 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 3
gagctgtcgt actcgaagta gaag 24
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工设计序列
<400> 4
acccgaacgc aggctatggc agttcctcgt tcgatttcac ttttagggca attcctttct 60
ggtcgactac gtatctcttc tacttcgagt acgacagctc 100
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 探针
<400> 5
ttcctcgttc gatttcactt ttagg 25