一种分离番茄果实原生质体的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分离番茄果实原生质体的方法。

背景技术：

果实作为鲜活的农产品为人类健康提供了丰富的营养，是人们膳食结构中不可缺少的组分。番茄作为研究果实成熟和抗病机理的模式生物，是世界范围内广泛种植的第一大蔬菜作物,具有重要的经济和科研价值。近年来，番茄基因组序列的解读和群体遗传学的发展让人们能够能从基因组的角度加深对番茄的了解。随着功能基因组学、分子生物学研究的不断深入，果实发育进程相关的功能基因在细胞中表达的时空特异性及其调控模式得到了广泛关注，而对基因表达产物的亚细胞定位分析依赖于样品制备方法的不断优化。与其它模式生物细胞相比，果实细胞具有其特殊性:细胞含水量高，不同成熟度的果实细胞体积和结构具有显著差异，细胞间隙富含果胶等多糖类物质，而且细胞中富含有机酸、糖类、色素和芳香类物质。因此，以往对果实细胞的显微观察并不多见，而且试验中往往需要对果实进行切片或者刺伤操作，极大地影响了对果实细胞结构和功能的原位无损解析。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种分离番茄果实原生质体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用酶液酶解番茄果实，收集酶解后果实组织；

所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、离析酶；

2)将所述酶解后果实组织在PME溶液中孵育，即得到番茄果实原生质体，实现番茄果实原生质体的分离；

所述PME溶液包括甘露醇、PIPES、MgCl₂和EDTA。

上述方法中，

所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩尔的量比为30-50：4-6：1-3：1-3；

或所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩尔的量比为40：5：2：1；

或所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩尔的量比为40：4：1：1；

或，所述纤维素酶、所述果胶酶、所述离析酶的质量比为5-10：3-5：3-5；

或，所述纤维素酶、所述果胶酶、所述离析酶的质量比为2：1：1。

上述方法中，

所述PME溶液由300-500mM甘露醇、40-60mM PIPES、10-30mM MgCl₂、10-30mM EDTA和水组成；

或，所述PME溶液由400mM甘露醇、50mM PIPES、20mM MgCl₂、10mM EDTA和水组成；

或，所述PME溶液由400mM甘露醇、40mM PIPES、10mM MgCl₂、10mM EDTA和水组成；

或，所述PME溶液的pH为6-8。

上述方法中，

所述酶液为由纤维素酶、果胶酶、离析酶和GKMMB溶液组成，

所述纤维素酶在所述酶液中的质量百分比为0.5-1％，所述果胶酶在所述酶液中的质量百分比为0.3-0.5％、所述离析酶在所述酶液中的质量百分比为0.3-0.5％；

或所述纤维素酶在所述酶液中的质量百分比为1％，所述果胶酶在所述酶液中的质量百分比为0.4％、所述离析酶在所述酶液中的质量百分比为0.5％；

或，所述纤维素酶在所述酶液中的质量百分比为1％，所述果胶酶在所述酶液中的质量百分比为0.5％、所述离析酶在所述酶液中的质量百分比为0.4％；

或，所述GKMMB溶液由终浓度为300-500mM甘露醇、10-30mM KCl、40-60mM MgSO₄7H₂O、1-3mM MgCl₂、50-150mM MES、质量百分含量为1-3％BSA和水组成；

或，所述GKMMB溶液由终浓度为400mM甘露醇、20mM KCl、60mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、质量百分含量为1％BSA和水组成；

或，所述GKMMB溶液由终浓度为400mM甘露醇、20mM KCl、50mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、质量百分含量为1％BSA和水组成。

上述方法中，

所述孵育的方式为22-30℃、60rpm震荡2-5小时。

上述方法中，

所述酶解的温度为22-30℃，所述酶解的方式为先0.07-0.08MPa保持5分钟，再在黑暗常压状态下于60rpm震荡3小时55分，再在黑暗常压状态下于80rpm震荡5分钟。

上述方法中，

在所述孵育后，还包括如下步骤:先将孵育后的体系中的果实组织去除，得到细胞孵育液；再将所述细胞孵育液过滤，收集过滤液；再将所述过滤液离心，收集沉淀，得到果实原生质体。

上述方法中，

所述过滤采用的孔径为100-300μm的细胞筛；

所述离心的条件为22-25℃，150-180g，3-5min。

上述方法中，

所述番茄果实为0.1-1mm厚番茄果实切片。

本发明另一个目的是提供一种分离番茄果实原生质体的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述PME溶液；

或所述试剂盒还包括上述酶液。

本发明提供的分离番茄果实原生质体的方法，其具有以下优点：1)操作简单、快速：缩短了酶解等前期处理的时间；2)酶解处理后使用PME溶液进行孵育，终止酶解反应并提高原生质体的游离效率，节省了成本；3)分离效果好，不同大小的果实细胞都能够得到高效的分离。

实验证明，采用本发明提供的方法对番茄果实原生质体进行分离，原生质体得率显著提高；纤维素酶等的用量减少，达到节省成本的目的；为深入研究果实发育相关基因表达模式提供了重要工具。由此可见，酶解处理结合温和消化技术对番茄果实原生质体进行分离的方法为果实发育相关蛋白的亚细胞定位以及基因表达模式的深入研究奠定了基础，实际应用价值高。

附图说明

图1为普通光学显微镜观察到的红熟期番茄果实原生质体。

图2为普通光学显微镜观察到的绿熟期番茄果实原生质体。

图3为对比例普通光学显微镜观察到的红熟期番茄果实原生质体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为质量百分含量。

实施例1、红熟期番茄果实原生质体分离

一、分离所需试剂

纤维素酶的酶活为10u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活为10u/mg)，为Yakult Japan公司的产品；

果胶酶的酶活为5u/mg(果胶甲氧酯底物下的酶活为5u/mg)，为Yakult Japan公司的产品；

离析酶的酶活为3u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活为5u/mg)，为Yakult Japan公司的产品。

酶液由纤维素酶、果胶酶、离析酶和GKMMB溶液组成，纤维素酶的终浓度为1％(质量百分比)、果胶酶的终浓度为0.5％(质量百分比)、离析酶的终浓度为0.4％(质量百分比)。

上述GKMMB溶液由终浓度为400mM甘露醇、20mMKCl、50mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、质量百分含量为1％BSA和水组成。

酶液使用前用0.45μm的微孔滤膜过滤，收集过滤后酶液。

PME溶液由400mM甘露醇、50mM PIPES、20mM MgCl₂、10mM EDTA和水组成，pH为6.9。

二、红熟期番茄果实原生质体分离

1)将红熟期番茄果实(Alsa Craig品种)以自来水洗净后，以双面刀片切成0.1-1mm厚的薄片；

2)将步骤1)获得的果实组织浸没酶液中进行酶解，得到酶解体系，收集酶解体系中的酶解后果实组织。

上述酶解的温度为25℃，上述酶解过程如下：先抽真空至0.07-0.08MPa保持5分钟，再在黑暗常压状态下于摇床上60rpm(旋转半径5cm)酶解3小时55分，再在黑暗常压状态下摇床上80rpm继续震荡5分钟。

3)将上述酶解后果实组织浸没在PME溶液中温度为25℃、60rpm孵育2小时,得到孵育后体系(由果实组织和细胞孵育液组成)，去除孵育后体系中的果实组织，保留细胞孵育液；

4)将细胞孵育液过孔径为200μm的细胞筛，收集过滤液；将过滤液离心，收集沉淀，得到果实原生质体。

上述离心条件为25℃，150g，3min。

三、果实原生质体的检测

W5溶液由154mMNaCl，125mM CaCl₂，5mMKCl，5mM葡萄糖，1.5mM MES和水组成，W5溶液的pH为5.6。

将上述二得到的果实原生质体加入等体积的W5溶液，混匀后于普通光学显微镜下检查原生质体状态。

结果如图1所示，从图1中可以观察到大小不等的番茄果实原生质体，可以看出原生质体中细胞结构清晰，胞质流动活跃，可见较多质体和淀粉粒。

对比例：现有实验方法不包括酶解处理后使用PME溶液进行孵育的步骤，此步骤可以终止酶解反应，并通过温和消化进一步提高原生质体的游离效率。对比例原生质体分离效果如图3所示。

实施例2、绿熟期番茄果实原生质体分离

一、分离所需试剂

纤维素酶的酶活为10u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活为10u/mg)，为Yakult Japan公司的产品；

果胶酶的酶活为5u/mg(果胶甲氧酯底物下的酶活为5u/mg)，为Yakult Japan公司的产品；

离析酶的酶活为3u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活为5u/mg)，为Yakult Japan公司的产品。

酶液为将纤维素酶、果胶酶、离析酶添加到GKMMB溶液中得到的溶液，纤维素酶的终浓度为1％(质量百分比)、果胶酶的终浓度为0.4％(质量百分比)、离析酶的终浓度为0.5％(质量百分比)。

上述GKMMB溶液由终浓度为400mM甘露醇、20mMKCl、60mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、质量百分含量为1％BSA和水组成。

酶液使用前用0.45μm的微孔滤膜过滤，收集过滤后酶液。

PME溶液由400mM甘露醇、40mM PIPES、10mM MgCl₂、10mM EDTA和水组成，pH为6.9。

二、绿熟期番茄果实原生质体分离

1)将绿熟期番茄果实(Alsa Craig品种)以自来水洗净后，以双面刀片切成0.1-1mm厚的薄片；

2)将步骤1)获得的果实组织浸没酶液中进行酶解，得到酶解体系，收集酶解体系中的酶解后果实组织。

上述酶解的温度为25℃，上述酶解过程如下：先抽真空至0.07-0.08MPa保持5分钟，再在黑暗常压状态下于摇床上60rpm(旋转半径5cm)酶解3小时55分，再在黑暗常压状态下摇床上80rpm继续震荡5分钟。

3)将上述酶解后果实组织浸没在PME溶液中温度为25℃、60rpm孵育2小时,得到孵育后体系(由果实组织和细胞孵育液组成)，去除孵育后体系中的果实组织，保留细胞孵育液；

4)将细胞孵育液过孔径为150μm的细胞筛，收集过滤液；将过滤液离心，收集沉淀，得到果实原生质体。

5)上述离心条件为25℃，180g，3min。

三、果实原生质体的检测

W5溶液由150mM NaCl，130mM CaCl₂，4mM KCl，6mM葡萄糖，2mM MES和水组成，W5溶液的pH为5.6。

将上述二得到的果实原生质体加入等体积的W5溶液，混匀后于普通光学显微镜下检查原生质体状态。

结果如图2所示，从图2中可以观察到较小的番茄果实原生质体，可以看出原生质体体积较小，细胞结构清晰，胞质流动活跃，可见较多淀粉粒。