聚吡咯‑壳聚糖复合导电薄膜的制备方法与流程

本发明属于生物医学领域，具体的涉及一种荧光成像的膜材。

背景技术：

复合材料目前主要是指复合型导电高分子材料，是将聚合物与各种导电物质通过一定的复合方式构成。长期以来，高分子材料通常是作为绝缘材料被应用。然而，在用于生物医学研究领域的复合材料中，尤其是在细胞学方面研究中所用到的复合材料往往需要材料本身具有一定的导电性。众所周知，生物电是生命功能的本质，也是人体生命活动的基础，人体的任何一种生命活动无不和生物电密切相关。然而，细胞作为生物体的基本单位，也是生物电的基本单位，因此，在细胞水平上研究与生物电相关的复合材料，在一定程度上，就需要复合材料具有一定的导电性。荧光成像即荧光物质被特定外界能量激发，引起其电子向高能轨道跃迁，并最终释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号。荧光成像技术在生物学和医学领域已经得到了广泛的应用，是观测细胞形态、结构和生命的有力工具。常将荧光共振能量转移(FRET)与荧光显微技术结合起来，定时、定量、定位地观测活细胞内蛋白激酶活性变化。活细胞中核酸的定位信息采集及定量检测与活细胞内蛋白质的显微荧光成像分析也是荧光成像技术的应用。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，属于半合成有机高分子，是甲壳素最基本、最重要的衍生物。壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、价格低廉、来源丰富、且为可再生资源，是生物医学研究中非常重要的天然生物高分子材料。传统导电材料一般呈黑色，厚度较厚，透光性差，不能用于细胞荧光成像实验。

现有技术中，有人提供了一种壳聚糖基复合材料的制备方法，其方法中先用醋酸溶解壳聚糖，再采用氢氧化钠作为凝固液，干燥得壳聚糖材料，再将壳聚糖材料浸泡吡咯中，最后在氧化剂中氧化。按照以上方法制备壳聚糖基复合材料薄膜，由于采用氢氧化钠作为凝固液，壳聚糖干燥后呈粒状，后续浸泡吡咯时，与吡咯不能充分混匀，最终得到的成品中含有壳聚糖中心颗粒，在其表面包覆有一层聚吡咯，由于壳聚糖被包覆，这种薄膜的生物相容性很差，并不能作为细胞生长的理想载体。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明提供一种可用于细胞荧光成像的聚吡咯-壳聚糖复合导电薄膜的制备方法。

技术方案如下：

一种聚吡咯-壳聚糖复合导电薄膜的制备方法，其关键在于包括以下步骤：

步骤一、配制壳聚糖的醋酸溶液；

步骤二、在避光条件下，按质量比M(吡咯)：M(壳聚糖)＝1：4-6的比例，向壳聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，得吡咯-壳聚糖溶液；

步骤三、按摩尔比n(吡咯)：n(无水氯化铁)＝1：3-5的比例，向所述吡咯-壳聚糖溶液中加入无水氯化铁；

步骤四、制膜。

作为优选，上述步骤一中，所述壳聚糖的醋酸溶液的配置方法为：首先配置1％的醋酸水溶液，再用该醋酸水溶液配置2％的壳聚糖的醋酸溶液，最后将该壳聚糖的醋酸溶液于50℃搅拌直至溶解。

上述步骤二中，在所述壳聚糖的醋酸溶液冷却至室温后，再向所述壳聚糖的醋酸溶液中加入所述吡咯，搅拌1.5-3h。

上述步骤三中，加入无水氯化铁后，搅拌20-30h，氧化得到成膜液。

上述步骤四中，取所述成膜液，滴加在带有玻璃片的培养皿中，将所述培养皿放在匀胶机中制膜。

上述步骤二中，所述吡咯和壳聚糖的质量比为1：5。

上述步骤三中，所述吡咯和无水氯化铁的摩尔比为1：4。

上述步骤三中，将所述无水氯化铁用1％的所述醋酸水溶液溶解后，再加入所述吡咯-壳聚糖溶液。

附图说明

图1为过夜培养(≥10h)后，用荧光标记的活细胞的状态图；

图2为过夜培养(≥10h)后，未进行荧光标记的细胞状态图；

图3为放大1000倍的电镜图；

图4为放大5000倍的电镜图。

具体实施方式

一、下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种聚吡咯-壳聚糖复合导电薄膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、按以下方法配制壳聚糖的醋酸溶液；

首先配置1％的醋酸水溶液，再用该醋酸水溶液配置2％的壳聚糖的醋酸溶液，最后将该壳聚糖的醋酸溶液于50℃，用磁力搅拌器搅拌直至溶解。

步骤二、在所述壳聚糖的醋酸溶液冷却至室温后，在避光条件下，按质量比M(吡咯)：M(壳聚糖)＝1：4的比例，向壳聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，搅拌1.5h，得吡咯-壳聚糖溶液。

步骤三、按摩尔比n(吡咯)：n(无水氯化铁)＝1：3的比例，向所述吡咯-壳聚糖溶液中加入无水氯化铁搅拌20h，氧化得到成膜液。

步骤四、取所述成膜液，滴加在带有玻璃片的培养皿中，将所述培养皿放在匀胶机中制膜。

实施例2：

一种聚吡咯-壳聚糖复合导电薄膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、按以下方法配制壳聚糖的醋酸溶液；

首先配置1％的醋酸水溶液，再用该醋酸水溶液配置2％的壳聚糖的醋酸溶液，最后将该壳聚糖的醋酸溶液于50℃，用磁力搅拌器搅拌直至溶解。

步骤二、在所述壳聚糖的醋酸溶液冷却至室温后，在避光条件下，按质量比M(吡咯)：M(壳聚糖)＝1：5的比例，向壳聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，搅拌2h，得吡咯-壳聚糖溶液。

步骤三、按摩尔比n(吡咯)：n(无水氯化铁)＝1：4的比例，向所述吡咯-壳聚糖溶液中加入无水氯化铁搅拌24h，氧化得到成膜液。

步骤四、取所述成膜液，滴加在带有玻璃片的培养皿中，将所述培养皿放在匀胶机中制膜。

实施例3：

本实施例与实施例1和实施例2的不同在于：

所述步骤二中，按质量比M(吡咯)：M(壳聚糖)＝1：6的比例，向壳聚糖的醋酸溶液中加入吡咯，搅拌3h，得吡咯-壳聚糖溶液。

所述步骤三中，按摩尔比n(吡咯)：n(无水氯化铁)＝1：5的比例，向所述吡咯-壳聚糖溶液中加入无水氯化铁搅拌30h，氧化得到成膜液。

实施例4：

一种聚吡咯-壳聚糖复合导电薄膜的制备方法，包括以下步骤：

首先，配置1％的醋酸水溶液；

其次，在锥形瓶中，取15ml，1％的醋酸水溶液溶解0.4g壳聚糖，于温度为50℃的条件下，用磁力搅拌器搅拌，直至溶解，冷却至室温；

再次，在避光条件下，向锥形瓶中加入83ul，密度为0.96g/ml的吡咯，搅拌2h；

最后，取5ml，1％的所述醋酸水溶液充分溶解0.78g无水氯化铁，将氯化铁溶液逐滴加入锥形瓶中，

保持搅拌24h，得到成膜液。

步骤四、取所述成膜液，滴加在带有玻璃片的培养皿中，将所述培养皿放在匀胶机中制膜。

匀胶机制膜工艺如下：

吸取少量的溶液，滴加在带有玻璃片的培养皿中，将整个培养皿放在匀胶机内，设置t1＝9s，t2＝30s；v＝200r/s，v2＝3200r/s，抽真空操作时间约为半分钟，结束后按下开始按钮，液体将均匀地展开形成一张薄膜。该操作可以通过调整液体的用量、匀胶机的时间及转速等实验变量来控制膜的厚度，实验要求膜的厚度尽可能地薄，薄膜在室温(25℃～30℃)条件下自然干燥过夜。使用前用无水乙醇和去离子水交替清洗3次，每次浸泡5分钟，得到试验导电薄膜，即可用于细胞培养。

二、下面结合试验和附图对本发明作进一步说明。

对实施例4得到的试验导电薄膜进行测试，结果如下：

2.1电导率的测定，采用四探针法测得试验导电薄膜的电导率为0.51mS/cm。说明试验导电薄膜具有良好的导电性。

2.2生物相容性测定，以试验导电薄膜作为细胞生长的载体，隔夜(＞10h)培养，观察细胞状态，结果如图1和图2所示；

图1为过夜培养后，用荧光标记的活细胞的状态图；

图2为过夜培养后，未进行荧光标记的细胞状态图；

图1中，白色透光区域及其周围的轮廓即为活细胞；

图2中，深色线条及其围成的区域即为活细胞。

从图1和图2可以看出，细胞在试验导电薄膜上生长情况良好，较长时间之后，细胞仍有较高的存活率，说明试验导电薄膜具有良好的生物相容性。

2.3电镜观察试验导电薄膜的表面状态，图3为放大1000倍时电镜图，图4为放大5000倍时电镜图。

从图3和图4可以看出，试验导电薄膜表面均匀，平整。

有益效果：采用本发明方法制备的导电复合膜不仅给荧光分子制造了良好的微环境使其不易影响荧光寿命，且具有较好的延展性和透明度。作为荧光成像技术的载体达到无毒、无刺激性、免疫抗原性小、良好的生物相容性等基本标准。此外，本发明对荧光成像技术中的受体蛋白对荧光物质的量子效率有所提高。制备简单，原料廉价，具有良好的生物活性和导电性。将其作为带有荧光的细胞的生长载体，实验证明细胞得以存活且观察到细胞体内的荧光有连续的变化现象。

最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。