一种维持小鼠胚胎干细胞Naive状态的低表达Lin28的小鼠胚胎干细胞的制作方法

本发明涉及制备一种能够维持小鼠胚胎干细胞Naive状态的低表达Lin28的小鼠胚胎干细胞的方法，属于生物与新医药技术领域。

背景技术：

Lin28（Lineage Protein 28）是一种具有保守结构域的RNA、DNA结合蛋白在胚胎干细胞多能性的维持，肿瘤发生，新陈代谢，以及发育过程中起到重要作用的基因。Lin28作为多能性基因对小鼠胚胎干细胞的发育影响可为今后人类及小鼠胚胎的培养方法提供新的思路。

Lin28 最初发现于秀丽隐杆线虫中，通过一系列的基因网络调控发育时段，Lin28突变会导致幼虫的提前发育，后续的研究中人们发现在无脊椎动物到脊椎动物中都有Lin28的存在并且在结构和序列上都具有高度的保守性。随着研究的深入，人们对Lin28的了解越来越多，Lin28真正进入人们的视野是在2007年它可以同Nanog/Oct4/Sox2共同诱导体细胞转变成具有多能性的iPS细胞，与Oct4和Sox2不同，在这一过程中Lin28并不是必需的，但它可以通过增加细胞分裂能力提高重编程效率。随后人们发现Lin28 可以促进分化，这与其他多能性基因是不同的，Lin28远远不只是多能性基因这么简单。

胚胎干细胞是一种异质性很强的细胞群体，其中只有部分细胞处于真正多能性（Naive Pluripotency）,而另一些细胞则呈现出分化倾向。2008年人们发现了能够维持胚胎干细胞处于Naive 状态的培养体系,即“2i”（MEK和GSK3抑制剂）培养体系，胚胎干细胞在这样的条件下培养后细胞呈现出均一、典型的胚胎干细胞圆形克隆状生长，因此人们将这一种处于Naive-like 胚胎干细胞又称之为Ground状态的胚胎干细胞，而另一些细胞则呈现出趋于分化的Primed 状态。Lin28高表达的一群细胞脱离Naive状态呈现中内胚层分化倾向。Lin28对体外培养的胚胎干细胞的Naive状态和Primed 状态影响作用尚不清楚。因此，我们首先建立带有Lin28干扰序列真核表达载体，并实现其在胚胎干细胞中的稳定表达，这样可以有助于我们建立起一种成熟的Naive状态胚胎干细胞培养体系，尤其是有助于人的胚胎干细胞Naive状态培养体系的建立，Lin28作为多能性基因对小鼠胚胎干细胞发育影响，可为今后人类及小鼠胚胎的培养方法提供新的思路。

技术实现要素：

本发明是一种低表达Lin28的胚胎干细胞系，对小鼠胚胎干细胞Naive状态维持起重要作用。

该发明提供的方法是将DNA干扰序列导入哺乳动物细胞中，获得稳定降低Lin28蛋白表达的细胞。

其中，所述哺乳动物细胞是小鼠胚胎干细胞。

所述基因引物、转基因细胞属于发明的保护范围。

本发明的方法能在小鼠胚胎干细胞中稳定降低Lin28 的表达水平，显著维持小鼠胚胎干细胞Naive状态。

附图说明

图1为RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Lin28载体结构示意图，该质粒可以在哺乳动物细胞内表达RNAi-Lin28从而可以稳定降低Lin28表达。

图2为构建稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞系，并从mRNA以及蛋白水平上检测小鼠胚胎干细胞中Lin28表达,发现相比于对照组，实验组的Lin28表达降低。

图3为在传统血清培养条件下稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞系与对照组小鼠胚胎干细胞系的细胞图片以及将它们培养在血清以及有滋养层细胞Feeder条件下的细胞图片。

图4为稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞与Naive状态小鼠胚胎干细胞细胞图片对比。

图5为稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞中Naive状态的特异性基因，这些特异性的基因的表达在mRNA水平上升高。

图6为降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞中Naive状态特异性基因Nanog与Dppa3在蛋白水平上的表达，结果显示相比于对照组，降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞这些基因表达升高。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

引物合成及序列测定由Invitrogen（北京公司）完成。

RNA提取试剂购Invitrogen公司，反转录试剂盒和Lipo2000转染试剂购于Invitrogen公司。

限制性内切酶购于Takara公司，干扰载体来自于Clontech 公司，但经过改造。

酶切、连接、回收、转化、引物退火等分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。

实施例1，小鼠RNAi-Lin28干扰载体构建

小鼠RNAi-Lin28 Ready pSIREN-RetroQ干扰载体以及构建步骤如下：

根据BD™ Knockout RNAi Systems User Manual（No. PT3739-1）设计Lin28 RNAi干扰序列：5‘GGAGACAGGTGCTACAACT 3’，在干扰序列的上游和下游分别加入限制性内切酶酶切位点EcoRI和BamHI(上游引物：5'-GAT CCG GGA GAC AGG TGC TAC AAC TTT CAA GAG A AG T TGT AGC ACC TGT CTC CCT TTT TTA AGC TTG-3', 下游引物：5'-AAT TCA AGC TTA AAA AAG GGA GAC AGG TGC TAC AAC TTC TCT TGA AAG TTG TAG CAC CTG TCT CCC G-3')

通过对小鼠Lin28的干扰序列引物退火、与干扰空载体双酶切、干扰空载体骨架与退火引物连接、转化；重组干扰质粒提取、重组干扰质粒单酶切鉴定、重组载体测序等一系列过程，获得小鼠RNAi-Lin28干扰载体，重组质粒如图1所示。

实施例2：小鼠Lin28的功能检测

如图2所示，将RNAi-Lin28 Ready pSIREN-RetroQ干扰载体通过脂质体转染的方法（步骤详见invitrogen说明书）转染入细胞，并利用干扰载体上的真核抗性基因，通过在细胞培养过程中加入药物嘌呤霉素筛选成功将载体重组到基因组上的小鼠胚胎干细胞，并将之扩大培养，获得稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞系，最后再通过real-time PCR/Western blot检测手段证明，转入干扰载体的小鼠胚胎干细胞，其Lin28的表达在RNA以及蛋白水平上都明显降低，表明我们获得细胞为Lin28表达显著降低的细胞系。将降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞与对照组细胞放置在相同的有滋养层细胞Feeder的传统的血清培养条件下观察细胞形态可以看出如图3所示，稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞与对照组小鼠胚胎干细胞在克隆形态上区别不大，并且由于Feeder的影响，两种细胞都呈现出典型的小鼠胚胎干细胞Naive状态；但是将两种细胞单独放置于传统血清培养条件下，相比于对照组细胞而言，降低Lin28表达的细胞在形态上明显呈现出典型的小鼠胚胎干细胞克隆球形状，这种形态呈现出典型的小鼠胚胎干细胞Naive状态。

实施例3：小鼠RNAi-Lin28转基因细胞对小鼠胚胎干细胞Naive状态维持的功能作用。

如图4所示，通过利用2i+Lif培养条件将小鼠胚胎干细胞维持在Naive状态与在正常培养条件下降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞相比两者形态接近，通过两种条件下细胞形态的对比说明降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞可以维持小鼠胚胎干细胞Naive状态。

通过筛选文献中已经报道过的小鼠胚胎干细胞Naive状态特异性的一些基因：Rex1/Esrrb/Nr0b1/Bmp7/Nanog/Tfcp2l1/Prdm14，这些基因在小鼠胚胎干细胞Naive状态下，其在mRNA水平上呈现高表达状态；利用real-time PCR的方法检测稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞与对照组小鼠胚胎干细胞细胞在mRNA水平上这些基因的表达趋势，结果如附图5所示，相比于对照组小鼠胚胎干细胞，这些基因在稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞中表达更高，说明降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞可以维持小鼠胚胎干细胞Naive状态。

利用Western blot方法检测稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞与对照组小鼠胚胎干细胞中Nanog/Dppa3蛋白表达情况，图6所示，在稳定降低Lin28表达的小鼠胚胎干细胞中这些基因在蛋白表达水平上明显高于对照组小鼠胚胎干细胞。