促进干细胞增生及保护和/或促进粒线体功能的植物萃取组合物的制作方法

本发明是关于一种植物萃取组合物，特别是一种用于促进干细胞增生的组合物。

背景技术：

干细胞(Stem cell)为生物体内尚未分化的原生细胞，其可以长时间地不断复制、更新，并具有分化衍生成特殊型态和功能的成熟细胞的能力。一般来说，人类干细胞的来源主要可分为胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)、成体干细胞(Adult Stem Cell，ASC)及诱导型多功能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPS)三种，胚胎干细胞是取自于不孕症冶疗后剩余的胚胎、怀孕终止的胚胎原始生殖细胞或由细胞融合所得；成体干细胞是取自于成熟个体的器官或组织，经由胰蛋白酶等酵素处理分离出的细胞；而诱导型多功能干细胞则是将皮肤细胞以基因工程方式诱导成类似胚胎干细胞。

由于胚胎干细胞必须由胚胎取得，于伦理道德上目前仍有争议，此外，诱导型多功能干细胞可能会引起基因突变，导至致癌性及免疫生成性的风险提高，因此现今医学上常用的干细胞为成体干细胞。目前已知可从骨髓、脐带血、乳牙、脂肪以及成人周边血液中取得成体干细胞，除了造血干细胞及间充质干细胞最为人熟悉外，尚有神经干细胞、表皮干细胞、骨骼肌干细胞、脂肪干细胞、胰干细胞、眼角膜干细胞、肝脏干细胞以及肠上皮干细胞等亦属于成体干细胞。

成体干细胞具有许多优势，包括：(1)存在于人体各种组织和器官中，来源广 泛，且不涉及伦理问题；(2)正常情况下，成体干细胞处于静止状态，只有在病理情况下，才会启动自我更新潜能，因此导致癌变的可能性较小；(3)能修补、取代生病或年老的细胞、组织或器官，因此成体干细胞被认为具有无限的再生医疗潜力，而如何有效促进成体干细胞的增生则为产学界重要的课题之一。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种植物萃取组合物(Mitofood@Stem)，包含红酒多酚、绿茶多酚以及余甘子果实提取物，能用于促进干细胞增生且具有保护和/或促进粒线体(又称线粒体、mitochondrion)功能的功效。

在本发明的实施例中，其中所述红酒多酚的重量百分比浓度为32-55％。

在本发明的实施例中，其中所述绿茶多酚的重量百分比浓度为1.5-9％。

在本发明的实施例中，其中所述余甘子果实提取物的重量百分比浓度为32-66％。

在本发明的实施例中，其中所述余甘子果实提取物、该红酒多酚与该绿茶多酚的重量百分比浓度分别为32-66％、32-55％与1.5-9％。

在本发明的实施例中，本发明的植物萃取组合物可进一步包含药学上可接受的载体。

本发明另一方面提供一种促进干细胞增生的方法，包括将上述植物萃取物组合物给予一个个体。

在本发明的实施例中，其中所述干细胞是选自造血干细胞、脂肪干细胞、骨髓基质细胞、间叶干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、胚胎干细胞、血管内皮干细胞、肝脏干细胞、胰线干细胞、肠上皮干细胞或生殖干细胞中的一种或多种。

在本发明的实施例中，其中所述个体为哺乳动物。

在本发明的实施例中，其中所述个体为人类。

附图说明

图1A为不同浓度的单一多酚(红酒多酚)处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图1B为不同浓度的单一多酚(绿茶多酚)处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图1C为不同浓度的单一多酚(苹果多酚)处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图2A为不同浓度的红酒多酚与绿茶多酚组合物处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图2B不同浓度的红酒多酚与余甘子果实提取物的组合物处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图2C为不同浓度的绿茶多酚与余甘子果实提取物的组合物处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图3为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物处理脂肪间叶干细胞，对脂肪间叶干细胞增生的影响结果图；

图4A为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对粒线体基础能量的影响结果图；

图4B为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对粒线体极限能量的影响结果图；

图4C为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物 对粒线体产生自由基泄漏的影响结果图；

图4D为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对粒线体产生ATP能量的影响结果图；

图4E为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对粒线体预存能量的影响结果图；

图4F为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对每单位粒线体能量的影响结果图；

图4G为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对粒线体耗氧产生量的媒合效率的影响结果图；

图5为不同浓度的红酒多酚、绿茶多酚与余甘子果实提取物的萃取组合物对细胞行无氧呼吸的影响。

具体实施方式

本发明提供一种植物萃取组合物，包括红酒多酚、绿茶多酚以及余甘子果实提取物，具有促进干细胞增生且具有保护和/或促进粒线体功能的功效。

本发明中所述“红酒多酚”是指红酒中的多酚化合物，包含多种化学物质，如酚酸类、黄酮醇(dihydroflavonols)、白藜芦醇、花青素、单宁等。

本发明中所述“绿茶多酚”是指存在茶叶中的多酚化合物，包括：表儿茶素(epicatechin，EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCg)等。

本发明中所述“余甘子”为大戟科叶下珠属植物Phyllanthus emblica的果实，别名为油柑子、橄榄子、滇橄榄、青果等。余甘子的果实味酸微涩，富含鞣质、 酚酸类化合物、黄酮类化合物、维生素等。

本发明中所述“干细胞”是指具有自我更新及分化能力的细胞，包括但不限于：造血干细胞、间叶干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、胚胎干细胞、血管内皮干细胞、脂肪干细胞、脐带血干细胞、周边血干细胞、肝脏干细胞、骨髓基质细胞或生殖干细胞等。

在实施例中，本发明的植物萃取组合物可与培养基合并使用。所述培养基为细胞培养基，包括但不限于：MEM培养基(Minimum Essential Medium)、BME培养基(Basal Medium Eagle)、DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium)，Ham’s F-10培养基(Ham’s Nutrient Mixtures F-10)、Ham’s F-12培养基(Ham’s Nutrient Mixtures F-12)、M199培养基(Medium 199)、keratinocyte-SFM(serum-free medium)、RPMI培养基、Ames培养基、BGJb培养基(修改Fitton-Jackson)、Click培养基、CMRL-1066培养基、Fischer培养基、GMEM培养基(Glascow Minimum Essential Medium)、IMDM培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、L-15培养基、McCoy’s 5A培养基(McCoy’s 5A Modified Medium)、NCTC培养基、Swim’s S-77培养基、Waymouth培养基或William’s Medium E培养基。此外，所属领域具有通常知识者可根据干细胞的种类选择适当的培养基，并对培养条件，包括培养基浓度、培养时间等进行调整，以利于不同种类的干细胞生长。

在另一实施例中，本发明的植物萃取组合物可通过口服、鼻吸入、经皮等方式给予个体使用，以促进所述个体的干细胞生长，其中所述个体为哺乳动物，较佳的为人类。此外，本发明植物萃取组合物的剂量可依不同个体所需，做适当的调整。

实施例

一、实验流程

于96孔盘的培养皿中，每孔加入2,000颗脂肪间叶干细胞及培养基进行培养。培养24小时后，将培养基置换成含有单一多酚萃取物(红酒多酚、绿茶多酚、苹果多酚)、二合一萃取组合物(红酒多酚+绿茶多酚、余甘子果实提取物+红酒多酚、余甘子果实提取物+绿茶多酚)或三合一萃取组合物(红酒多酚+绿茶多酚+余甘子果实提取物)的培养基，再培养24或48小时。接着，将培养基置换成含有10％Alamar blue的培养液，培养3-4小时后，以530/595nm波长测量荧光值。

二、单一多酚类对脂肪间叶干细胞增生的影响

参考图1，与未添加多酚类的培养基相比，以不同浓度的红酒多酚(图1A)、绿茶多酚(图1B)或苹果多酚(图1C)处理后，虽然能促进脂肪间叶干细胞增生，但其提升效果不大，仅5-13％。

三、二合一萃取组合物对脂肪间叶干细胞增生的影响

参考图2A，将红酒多酚与绿茶多酚同时加入培养基培养脂肪间叶干细胞后，结果显示，不仅使脂肪间叶干细胞提升14％的增生率，且与单一多酚类相比，并无加乘效果。此外，将余甘子果实提取物与红酒多酚(图2B)或绿茶多酚(图2C)搭配组合时，亦无法进一步提升脂肪间叶干细胞的生长率。

四、三合一萃取组合物对脂肪间叶干细胞增生的影响

参考图3，与未添加任何萃取物的培养基相比，含本发明的植物萃取组合物的培养基，能有效促进脂肪间叶干细胞增生。此外，当余甘子果实提取物、红酒多酚、绿茶多酚的重量百分比浓度分别为32-66％、32-55％及1.5-9％时，能使脂肪间叶干细胞的数量有效增加，最佳的能使脂肪间叶干细胞的增生率增加39％。

五、三合一萃取组合物对粒线体功能的影响

将本发明的植物萃取组合物加入脂肪间叶干细胞中进行培养，于培养24小时后，将培养基置换成200mM过氧化氢(H₂O₂)处理30分钟。接着，将细胞洗净后，以海马生物能量测定仪XF24进行细胞内粒线体功能的分析。其中，未加入本发明植物萃取物且未经200mM过氧化氢处理的细胞做为控制组，而未加入本发明植物萃取物但有经200mM过氧化氢处理的细胞做为对照组。

参考4A-4G图，与控制组相比，对照组细胞的粒线体功能，包括极限能量(图4B)、产生ATP能量(图4D)、用于应付压力的预存能量(图4E)、每单位粒线体能量(图4F)以及耗氧产生能量的媒合效率图(4G)，都明显下降许多，且对照组细胞产生自由基泄漏(图4C)的情况亦高于控制组细胞。然而加入本发明不同浓度的植物萃取组合物，能有效保护细胞粒线体功能不被过氧化氢破坏，且与对照组相比，当本发明植物萃取组合物的余甘子果实提取物、红酒多酚及绿茶多酚的重量百分浓度分别为47.62％、47.62％及4.76％时，能使细胞粒线体的基础能量增加1.13倍(图4A)、极限能量增加1.46倍(图4B)、产生的ATP能量增加1.6倍(图4D)、用于应付压力之预存能量增加2.7倍(图4E)、每单位粒线体能量增加1.3倍(图4F)，且耗氧产生能量的媒合效率亦增加1.4倍(图4G)，此外，产生自由基泄漏(图4C)的情况亦减少44.3％。

六、三合一萃取组合物对细胞行无氧呼吸的影响

参考图5，对照组细胞的粒线体功能遭过氧化氢破坏，因此发炎反应的耗氧较控制组的细胞高，然而加入含47.62％余甘子果实提取物、47.62％红酒多酚及4.76％绿茶多酚的本发明植物萃取组合物，能降低34％的发炎反应氧气消耗率，显示本发明的植物萃取组合具有保护粒线体功能的功效。

本领域所属技术人员，将可轻易由本发明所揭露的内容中了解到本发明的特征，且在不偏离本发明的精神与范围下，当可在此进行各种改变、取代以及修正，使其能适应各种条件及用途。因此，其他实施例亦落于本发明权利要求书所要求保护的范围之内。