抗PCSK9抗体及其用途的制作方法
背景技术：
血清胆固醇水平升高是导致心血管事件的重要危险因素。目前，降胆固醇治疗的基石是他汀类药物，在动脉粥样硬化性心血管疾病的一级预防和二级预防中发挥重要作用。然而，目前的降脂治疗不能满足临床需求。
尽管他汀类能够降低心血管导致的死亡，但是他汀治疗存在一定的局限。首先，他汀类药物最大降低低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的幅度为40～55％，他汀类药物剂量加倍只能再降低ldl-c约6％。
大样本的研究表明，他汀类药物/联合用药时无法达到ldl-c治疗目标。在l-tap2(lipidtreatmentassessmentproject2)研究中，9955名来自美洲、欧洲和亚洲的9个国家的高血脂患者，均接受稳定的降脂治疗(其中75％的患者接受他汀类治疗)，总体ldl-c达标率在47～84％(watersdd等人,lipidtreatmentassessmentproject(l-tap)2:amultinationalsurveytoevaluatetheproportionofpatientsachievinglow-densitylipoproteincholesterolgoals.circulation.120(1):28-34,2009)。在一项综合多个他汀类药物临床研究的分析中，他汀作为一级预防和二级预防均有一定的降低心血管事件的作用，但是总体仅减少三分之一的事件，尤其在高危人群中，仅减少27％的事件(libbyp.,theforgottenmajority:unfinishedbusinessincardiovascularriskreduction.journaloftheamericancollegeofcardiology.46(7):1225-1228,2005)。
目前已有多种作用机制的降低胆固醇的药物上市或在研，其中抗pcsk9的抗体因具备良好的安全性和疗效，受到广泛的关注。
pcsk9是一种丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族。在啮齿类动物和人类中，pcsk9主要表达在肝脏，其次在小肠和肾脏。首先在粗面内质网合成大小为72kda的pcsk9前体蛋白，前体蛋白含有一个30个氨基酸的n末端信号肽，一个前导肽(31-152)，一个催化区(153-425)以及c端半胱氨酸/组氨酸富集结构域(cysteine,histidine-richdomain，chrd)(426-692)(duffcj.,等人,antibody-mediateddisruptionoftheinteractionbetweenpcsk-9andthelow-densitylipoproteinreceptor.thebiochemicaljournal.419(3):577-584,2009；lambertg.,等人,molecularbasisofpcsk-9function.atherosclerosis.203(1):1-7,2009)。前体蛋白经过gln152位置的自身催化后，裂解为一个14kda大小的前导肽片段和一个63kda大小的成熟功能蛋白(包含催化结构和c末端结构域)，两者通过一个共价键紧密联接形成复合物，前导肽作用为成熟蛋白的分子伴侣，此后复合物离开内质网到达高尔基体，在高尔基体中经过酪氨酸硫酸化、乙酰化以及一系列翻译后修饰从细胞分泌入血液循环。
分泌的pcsk9主要作用于介导肝细胞质膜表面的低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，ldlr)降解，pcsk9的催化区中包含一个结合ldlr的位点，可结合ldlr结构中的表皮生长因子样重复同源结构a(epidermalgrowthfactor-likerepeathomologydomain-a，egf-a)，形成ldlr/pcsk9复合物，包被网格蛋白后内吞入肝细胞。在肝细胞核内体中，由于酸性环境，即ph值降低，ldlr和pcsk9之间的相互作用加强形成更为稳定的复合物，从而抑制ldlr的构象改变，阻止ldlr的解离再循环并促进运输ldlr/pcsk9复合物到溶酶体内经蛋白水解降解(lambertg.,等人,molecularbasisofpcsk9function.atherosclerosis.203(1):1-7,2009；georgem,等人,lookingintothecrystalball-upcomingdrugsfordyslipidemia.journalofcardiovascularpharmacologyandtherapeutics.20(1):11-20,2016)。在体内pcsk9通过干扰低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)清除通路发挥作用，当ldlr和ldl-c结合内吞后，结合的pcsk9阻止了ldlr从ldlr/ldl-c复合物脱离，并将复合物运输到溶酶体中降解，使ldlr不能再循环至肝细胞表面，从而减少了肝细胞表面ldlr的数量(lambertg.,等人,molecularbasisofpcsk-9function.atherosclerosis.203(1):1-7,2009)。此外，高尔基体中未成熟pcsk9也能直接结合细胞内ldlr，然后进入溶酶体中降解，阻止ldlr表达到肝细胞表面(lambertg.,等人,molecularbasisofpcsk-9function.atherosclerosis.203(1):1-7,2009；zhangy.,等人,dysregulationofthelow-densitylipoproteinreceptorpathwayisinvolvedinlipiddisorder-mediatedorganinjury.internationaljournalofbiologicalsciences.12(5):569-579,2016)。因此，pcsk9可以通过细胞表面和细胞内途径直接作用于ldlr，使肝细胞表面表达的ldlr减少，通过肝细胞重摄取的ldl-c减少，导致ldl-c清除率降低，循环ldl-c水平持续升高；抑制pcsk9则能够阻断血浆pcsk9与ldlr的结合，进而阻止ldlr的内吞和降解，增加细胞表面ldlr表达水平和数量，增加ldlr对ldl-c的重摄取，最终减少循环ldl-c水平，达到降血脂的直接作用。
pcsk9能促进ldlr家族其他成员的降解，包括极低密度脂蛋白受体(verylowdensitylipoproteinreceptor，vldlr)，载脂蛋白e受体2(apolipoproteinereceptor2，apoer2)以及ldlr相关蛋白1(ldlr-relatedprotein1，lrp1)(lambertg.,等人,molecularbasisofpcsk-9function.atherosclerosis.203(1):1-7,2009)。虽然pcsk9同样结合vldlr和apoer2的egf-a结构域，但是降解途径却不同，且到目前为止并没有发现这类降解作用的生理意义(burkeac.,等人pcsk-9:regulationandtargetfordrugdevelopmentfordyslipidemia.annualreviewofpharmacologyandtoxicology.13(3),2016)。此外，除了维持循环胆固醇稳态，最近有研究表明清道夫受体cd36也能与pcsk9作用，表明pcsk9可能在甘油三酯代谢中起到一定作用(burkeac.,等人pcsk-9:regulationandtargetfordrugdevelopmentfordyslipidemia.annualreviewofpharmacologyandtoxicology.13(3),2016)。综上可知，pcsk9与体内脂质循环和代谢有着非常密切的关系。
人类遗传学研究提供了有力的证据支持pcsk9在调节ldl-c水平和冠心病发病率中的作用。人类研究已经证实pcsk9基因的功能获得突变与血清ldl-c水平升高和早期冠心病有关(abifadelm.,等人,mutationsinpcsk-9causeautosomaldominanthypercholesterolemia.naturegenetics.34(2):154-156,2003)，而功能缺失突变与较低的血清ldl-c水平有关(cohenjc.,等人,sequencevariationsinpcsk-9,lowldl,andprotectionagainstcoronaryheartdisease.newenglandjournalofmedicine.54(12):1264-1272,2006)。在一项15年的前瞻性队列研究中(aric研究)显示出pcsk9无义突变携带者ldl-c水平和冠心病风险显著降低(cohenjc.,等人,sequencevariationsinpcsk-9,lowldl,andprotectionagainstcoronaryheartdisease.newenglandjournalofmedicine.54(12):1264-1272,2006)。该研究包括3363名黑人观察对象，2.6％携带pcsk9142x或pcsk9679x无义突变，与未携带突变的观察对象的相比，ldl-c水平下降28％，冠心病的风险下降88％(cohenjc.,等人,sequencevariationsinpcsk-9,lowldl,andprotectionagainstcoronaryheartdisease.newenglandjournalofmedicine.54(12):1264-1272,2006)。该研究包括9524名白人观察对象，3.2％携带pcsk946l无义突变，ldl-c水平下降15％，冠心病的风险下降47％(cohenjc.,等人,sequencevariationsinpcsk-9,lowldl,andprotectionagainstcoronaryheartdisease.newenglandjournalofmedicine.54(12):1264-1272,2006)。此外，在一位携带pcsk9复合型杂合型失活突变的女性中，血浆中检测不到pcsk9，其血清ldl-c水平极低(14mg/dl)，但总体健康水平良好，且具备生育能力(zhaoz.,等人,molecularcharacterizationoflossoffunctionmutationsinpcsk-9andidentificationofacompoundheterozygote.americanjournalofhumangenetics.79(3):514-523,2006.)。
体内动物实验进一步揭示了pcsk9的作用机制。小鼠血清pcsk9水平升高导致肝细胞ldlr蛋白减少并增加血清总胆固醇水平(lagaceta.,等人,secretedpcsk-9decreasesthenumberofldlreceptorsinhepatocytesandinliversofparabioticmice.journalofclinicalinvestigation.116(11):2995-3005,2006)，相反，pcsk9基因敲除小鼠的肝细胞ldlr蛋白水平升高(而ldlr的信使rna水平不变)，相应的血清总胆固醇水平下降大约50％(rashids.,等人,decreasedplasmacholesterolandhypersensitivitytostatinsinmicelackingpcsk-9.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica.102(15):5374-5379,2005)。
因此，存在实质性证据指示pcsk9在低密度脂蛋白(ldl)的调控中起作用；pcsk9的表达或上调与血浆ldl胆固醇水平增加相关；pcsk9表达的相应抑制或缺乏与ldl胆固醇血浆水平降低相关；并且ldl胆固醇水平降低与pcsk9的序列变化相关；已发现此会赋予针对冠心病的保护(cohen,2006n.engl.j.med.354:1264-1272)。
在临床试验中，已发现ldl胆固醇水平降低直接与冠脉事件的等级相关(law等,2003bmj326:1423-1427)。此外，发现血浆ldl胆固醇水平的适度终身降低与冠脉事件发生率的实质性降低相关(cohen,2006n.engl.j.med.354:1264-1272)。即使在具有较高非脂质相关性心血管风险因素盛行率的群体中，情况也是如此。因此，对ldl胆固醇水平的管理控制会获得巨大益处。
基于此，鉴定可用于调节胆固醇水平且阻断或抑制或中和pcsk9的活性的其它分子将具有巨大益处。pcsk9抗体及其在降低血浆ldl-c中的作用在本领域是已知的。例如，us2009/0246192、us2009/0142352、us2010/0166768和wo2010/029513公开了此类pcsk9抗体及其用途。
截至目前，已知的pcsk9单克隆抗体alirocumab(sanofi/regeneron产品，商品名praluent)和evolocumab(amgen产品，商品名repatha)在多种类型的原发性高胆固醇血症中显示出明显疗效，2015年经美国fda批准用于他汀控制不良和家族性高胆固醇血症(familialhypercholesteromia，包括杂合子和纯合子型，heterozygousandhomozygousfamilialhypercholesteremia，分别简称为hefh和hofh)和有冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者。
现在仍然存在替代pcsk9抗体的需求。具体而言，存在与pcsk9具有高亲和力、细胞株来源可靠，稳定性好并能以高效能降低ldl-c的替代pcsk9抗体的需求。还更具体的是，存在以高效能降低ldl-c并提供持久的起效持续时间(例如，持久的ldl-c水平的抑制)的替代pcsk9抗体的需求。此类抗体将还优选具有利于开发、制造或配制的良好的物理化学特性。
发明概述
本发明部分基于多种针对pcsk9的抗体。pcsk9呈现为重要和有利的治疗靶标，并且本发明提供用于与pcsk9的表达和/或活性相关的病理学状态的治疗和诊断的抗体。因此，本发明提供抗pcsk9抗体、与抗pcsk9抗体相关的组合物、试剂盒、方法和用途。
在一些实施方案中，提供结合pcsk9或其片段(优选人pcsk9蛋白质)的抗pcsk9抗体或抗体片段(优选抗原结合片段)。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1包含与选自seqidno:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，hcdr2包含与选自seqidno:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且hcdr3包含与选自seqidno:3、18、19和22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(lcvr)，其中所述lcvr包含互补决定区域(cdr)lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中lcdr1包含与seqidno:4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，lcdr2包含与seqidno:5所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，lcdr3包含与seqidno:6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含与选自seqidno:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，hcdr2包含与选自seqidno:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且hcdr3包含与选自seqidno:3、18、19和22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；其中lcdr1包含与seqidno:4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，lcdr2包含与seqidno:5所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，lcdr3包含与seqidno:6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1包含选自seqidno:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；hcdr2包含选自seqidno:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；hcdr3包含选自seqidno：3、18、19和22的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(lcvr)，其中所述lcvr包含互补决定区域(cdr)lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含选自seqidno:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；hcdr2包含选自seqidno:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；hcdr3包含选自seqidno：3、18、19和22的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:20所示的氨基酸序列或由其组成，hcdr2包含seqidno:21所示的氨基酸序列或由其组成，且hcdr3包含seqidno:22所示的氨基酸序列或由其组成；其中lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成，lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成，lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:1所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:2所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:3所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:1所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:2所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:18所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:1所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:14所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:19所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:7所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:15所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:18所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:8所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:16所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:19所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:9所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:17所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:19所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:10所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:17所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:19所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:11所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:17所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:18所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:12所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:17所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:18所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3并且所述lcvr包含cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3，其中hcdr1包含seqidno:13所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr2包含seqidno:17所示的氨基酸序列或由其组成；hcdr3包含seqidno:18所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr1包含seqidno:4所示的氨基酸序列或由其组成；lcdr2包含seqidno:5所示的氨基酸序列或由其组成；且lcdr3包含seqidno:6所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区hcvr，其包含与选自seqidno:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区lcvr，其包含与seqidno:24所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含与选自seqidno:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含与seqidno:24所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区hcvr，其包含选自seqidno:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区lcvr，其包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含选自seqidno:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:23所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:25所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:26所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:27所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:28所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:29所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:30所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:31所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:32所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，其中重链可变区hcvr包含seqidno:33所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区lcvr包含seqidno:24所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含与选自seqidno:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含与seqidno:35所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含与选自seqidno:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；轻链包含与seqidno:35所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含选自seqidno:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含选自seqidno:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:34所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:36所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:37所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:38所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:39所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:40所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:41所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:42所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:43所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在优选的实施方案中，本发明提供抗pcsk9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含seqidno:44所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含seqidno:35所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗pcsk9抗体的氨基酸序列的变体，以及与上文所述的任何抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供结合pcsk9或其片段的抗体或抗体片段(优选的抗原结合片段)，其中所述抗体结合pcsk9的片段内的表位。在某些实施方案中，提供结合pcsk9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体结合包含人pcsk9氨基酸序列seqidno：53的氨基酸75至93和100至110的pcsk9的片段内的表位。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基y78。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基t86。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基h87。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基y78、t86和h87。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基r104。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基y78、t86、h87和r104。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包括人pcsk9的残基y78、t86、h87和r104中的一个或多个。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包括邻近人pcsk9的y78、t86、h87和r104的残基中的一个或多个。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包含(i)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人pcsk9的y78、t86和h87，(ii)人pcsk9的r104。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包含以下残基中的一个、两个、三个或全部：人pcsk9的y78、t86、h87和r104。
在一些实施方案中，抗pcsk9抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗pcsk9抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗pcsk9抗体是人抗体。在一些实施方案中，至少部分的抗pcsk9抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：fab、fab’-sh、fv、scfv或(fab’)2片段。
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗pcsk9抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一个实施方案中，本发明提供制备抗pcsk9抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗pcsk9抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用载体。
在一方面中，本发明涉及在受试者中抑制pcsk9与ldl-受体(ldlr)结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。本发明还涉及本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段制备用于在受试者中抑制pcsk9与ldl-受体(ldlr)结合的组合物或药物的用途。
在另一方面中，本发明涉及降低受试者的胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一个实施方案中，胆固醇是ldl-胆固醇，优选地血清胆固醇。在另一方面中，本发明涉及降低受试者的ldl-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明涉及降低受试者的血清ldl-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在另一方面，本发明还涉及本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段制备用于在受试者中降低受试者的胆固醇水平(在一个实施方案中是ldl-胆固醇水平或血清ldl-胆固醇水平)的药物的用途。
在另一方面中，本发明涉及治疗受试者的与升高的ldl-胆固醇水平相关的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。本发明还涉及本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段制备用于在受试者中治疗受试者的与升高的ldl-胆固醇水平相关的病症的药物的用途。
在一方面中，本发明涉及治疗胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。本发明还涉及本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段制备用于治疗胆固醇相关疾病的药物中的用途。胆固醇相关疾病的示例性和非限制性实例提供在后文中。在一些实施方案中，胆固醇相关疾病是高胆固醇血症(hypercholesterolemia)或高脂血症。在一些实施方案中，本发明涉及治疗高胆固醇血症和/或高脂血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明还涉及本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段制备用于治疗高胆固醇血症和/或高脂血症的药物的用途。
在一方面中，本发明涉及治疗可以通过消除、抑制或降低pcsk9活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。在一些实施方案中，可以通过使用他汀类物质(statins)治疗或预防的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段来治疗。在一些实施方案中，可以受益于防止胆固醇合成或提高的ldlr表达的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段来治疗。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的第二药物，其中本文所述的抗pcsk9抗体或其片段是第一药物。在一个实施方案中，第二药物提升ldlr蛋白的水平。在另一个实施方案中，第二药物降低ldl-胆固醇的水平。在另一个实施方案中，第二药物包含他汀类物质。在另一个实施方案中，第二药物为他汀类物质。在一些实施方案中，他汀类物质选自：阿托伐他汀(atorvastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，美伐他汀(mevastatin)，匹伐他汀(pitavastatin)，普伐他汀(pravastatin)，罗舒伐他汀(rosuvastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，及其任意组合。在另一个实施方案中，第二药物提升hdl-胆固醇的水平。在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物，优选地人。
在一方面中，本发明涉及检测样品中pcsk9蛋白的方法，所述方法包括(a)将样品与本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段接触；和(b)检测抗pcsk9抗体或其片段和pcsk9蛋白间的复合物的形成。在一个实施方案中，抗pcsk9抗体是被可检测地标记的。
本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗pcsk9抗体或其片段、方法和用途。
附图说明：
图1.显示了不同浓度的各个抗pcsk9抗体阻断pcsk9与ldlr结合的能力。
图2.显示了不同浓度的各个抗pcsk9抗体增加hepg2细胞恢复ldlr的能力。
图3.显示了不同浓度的各个抗pcsk9抗体降低细胞ldlr内化的能力。
图4.显示了本发明示例性抗体的fr和cdr的序列信息。
图5.显示了本发明示例性抗体的重链可变区和轻链可变区的序列信息。
发明详述
定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可用解离常数(kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。
术语“抗pcsk9抗体”、“抗pcsk9”、“pcsk9抗体”或“结合pcsk9的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合pcsk9蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向pcsk9中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗pcsk9抗体与不相关的、非pcsk9蛋白结合的程度低于所述抗体与pcsk9结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(ria)测量的。在一些实施方案中，抗pcsk9的抗体的解离常数(kd)≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m以下，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)。
如本文所用，“单克隆抗体”或“mab”指来源于例如真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的单一拷贝或克隆的抗体，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如cdr嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。
本领域已知五个主要类别的抗体：iga，igd，ige，igg和igm，并且这些抗体中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在相同的多肽链(vh-vl)中包含与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用因为太短而不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等，nat.med.9：129-134(2003)；和hollinger等，美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)90：6444-6448(1993)中。三抗体和四抗体同样描述于hudson等，nat.med.9：129-134(2003)中。
“效应子功能”指那些可归于抗体fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如b细胞受体)下调；和b细胞活化。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合物、多特异性、重组、异源、异源杂合、嵌合、人源化(特别是嫁接有cdr的)、去免疫的、或人的抗体、fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、由fab表达库产生的片段、fd、fv、二硫化物连接的fv(dsfv)、单链抗体(例如scfv)、双抗体或四抗体(holligerp.等(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90(14),6444-6448)、纳米抗体(nanobody)(也称为单域抗体)、抗独特型(抗id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗id抗体)和上述任一种的表位结合片段。
“fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(ch1)。fab’片段因在重链ch1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段不同。fab’-sh是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的fab’的称谓。f(ab’)2抗体片段最初是作为成对fab’片段生成的，在fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
术语“fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的c端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在某些实施方案中，人igg重链fc区从cys226或pro230延伸至重链的羰基端。然而，fc区的c端赖氨酸(lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据eu编号系统，其也被称为eu索引，如在kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1991中所述。
“框架”或“fr”是指除高变区(hvr)(例如互补决定区)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr结构域组成：fr1，fr2，fr3和fr4。因此，hvr和fr序列通常出现在重链可变结构域(vh)(或轻链可变结构域(vl))的以下序列中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。
术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的fc区的重链的抗体。
“fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链fv(scfv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个hvrs相互作用从而限定在vh-vl二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个hvrs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个hvrs的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性低于完整结合位点。关于scfv的综述参见例如pluckthun于thepharmacologyofmonoclonalantibodies，卷113，rosenburg和moore编辑，(springer-verlag，newyork，1994)，pp.269-315中。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白vl或vh框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白vl或vh序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，nihpublication91-3242，bethesdamd(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于vl，该亚型是如kabat等(见上文)中的亚型κi。在一个实施方案中，对于vh，该亚型是如kabat等(见上文)中的亚型iii。
“人源化”抗体是指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的hvr(例如，cdr)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
术语“高胆固醇血症”当用于本文中时是指其中胆固醇水平升高到理想水平以上的病症。在一些实施方案中，ldl-胆固醇水平升高到理想水平以上。在一些实施方案中，血清ldl-胆固醇水平升高到理想水平以上。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，sds-page，等电聚焦(ief)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相hplc)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，flatman等，j.chromatogr.b848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“分离的编码抗pcsk9抗体或其抗原结合片段的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其抗原结合片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。
术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。
除非另外说明，术语“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9)(pcsk9)”、“pcsk9”或“narc-1”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然pcsk9，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的pcsk9以及由细胞内加工产生的任何形式的pcsk9或其任何片段。该术语还包括天然存在的pcsk9的变体，例如，剪接变体或等位变体。
术语“pcsk9活性”或pcsk9的“生物学活性”当用于本文中时包括pcsk9的任何生物学作用。在一些实施方案中，pcsk9活性包括pcsk9与底物或受体相互作用或结合的能力。在一些实施方案中，pcsk9的生物学活性是pcsk9与ldl-受体(ldlr)结合的能力。在一些实施方案中，pcsk9结合并催化涉及ldlr的反应。在一些实施方案中，pcsk9活性包括pcsk9降低或减少ldlr的利用度的能力。在一些实施方案中，pcsk9的生物学活性包括pcsk9提高受试者的ldl的量的能力。在一些实施方案中，pcsk9的生物学活性包括pcsk9降低受试者的可以用于与ldl结合的ldlr的量的能力。在一些实施方案中，pcsk9的生物学活性包括pcsk9降低可以用于与ldl结合的ldlr的量的能力。在一些实施方案中，pcsk9的生物学活性包括由pcsk9信号传导所致的任何生物学活性。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(fr)和三个互补决定区。(参见，例如，kindt等kubyimmunology，6thed.，w.h.freemanandco.91页(2007))。单个vh或vl结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的vh或vl结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补vl或vh结构域的文库。参见，例如，portolano等，j.immunol.150：880-887(1993)；clarkson等，nature352：624-628(1991)。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“胆固醇相关疾病”包括以下中的任一种或多种：高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征(metabolicsyndrome)、糖尿病、冠状动脉心脏病(coronaryheartdisease)、卒中(stroke)、心血管疾病(cardiovasculardiseases)、阿尔茨海默病(alzheimersdisease)和一般性的异常脂血症(dyslipidemia)(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的ldl、提高的甘油三酯、提高的vldl和/或低的hdl)。可以使用抗pcsk9抗体(单独地或与一种或多种其他药物组合地)治疗的原发性和继发性异常脂血症的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病(diabetesmellitus)、家族性混合性高脂血症(familialcombinedhyperlipidemia)、家族性高甘油三酯血症(familialhypertriglyceridemia)、家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemias)，包括杂合性高胆固醇血症(heterozygoushypercholesterolemia)、纯合性高胆固醇血症(homozygoushypercholesterolemia)、家族性缺陷性载脂蛋白(familialdefectiveapoplipoprotein)b-100；多基因性高胆固醇血症(polygenichypercholesterolemia)；残粒移去障碍病(remnantremovaldisease)、肝脂肪酶缺失(hepaticlipasedeficiency)；继发于以下任何的异常脂血症：饮食不慎(dietaryindiscretion)、甲状腺机能障碍(hypothyroidism)、药物(包括雌激素和孕酮疗法、β阻断剂和噻嗪类利尿剂(thiazidediuretics))；肾病综合征(nephroticsyndrome)、慢性肾衰竭(chronicrenalfailure)、库欣综合征(cushing′ssyndrome)、原发性胆汁性肝硬变(primarybiliarycirrhosis)、糖原沉积病(glycogenstoragediseases)、肝细胞瘤(hepatoma)、胆汁淤积(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰岛素瘤(insulinoma)、单纯性生长素缺乏症(isolatedgrowthhormonedeficiency)和酒精所致高甘油三酯血症(alcohol-inducedhypertriglyceridemia)。
本发明的抗体
在本发明的一个方面中，本文提供抗pcsk9的抗体，以及其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗pcsk9抗体抑制或阻断pcsk9活性。在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(kd)≤大约1μm，≤大约100nm，≤大约10nm，≤大约1nm，≤大约0.1nm，≤大约0.01nm，或≤大约0.001nm(例如10-8m以下，例如10-8m至10-13m，例如，10-9m至10-13m)。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)，其中所述hcvr包含互补决定区域(cdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1包含与选自seqidno:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，hcdr2包含与选自seqidno:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且hcdr3包含与选自seqidno:3、18、19和22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，抗pcsk抗体的hcvr的cdr(例如与参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的cdr)的氨基酸序列相对于对应的参考序列包含一个或多个置换(例如保守性置换)、插入或缺失，但是包含所述cdr的抗pcsk9抗体具有结合pcsk9的能力。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(lcvr)，其中所述lcvr包含互补决定区域(cdr)lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中lcdr1包含与seqidno:4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，lcdr2包含与seqidno:5所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，lcdr3包含与seqidno:6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，抗pcsk抗体的lcvr的cdr(例如与参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的cdr)的氨基酸序列相对于对应的参考序列包含一个或多个置换(例如保守性置换)、插入或缺失，但是包含所述cdr的抗pcsk9抗体具有结合pcsk9的能力。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(hcvr)，其中重链可变区hcvr包含与选自seqidno:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗pcsk抗体的重链可变区hcvr包含与选自seqidno:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述hcvr的抗pcsk9抗体具有结合pcsk9的能力。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(lcvr)，其中轻链可变区lcvr包含与seqidno:24所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗pcsk抗体的轻链可变区lcvr包含与seqidno:24所示的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述lcvr的抗pcsk9抗体具有结合pcsk9的能力。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含与选自seqidno:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗pcsk抗体的重链包含与选自seqidno:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述重链的抗pcsk9抗体具有结合pcsk9的能力。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含与seqidno:35所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗pcsk抗体的轻链包含与选自seqidno:35所示的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述轻链的抗pcsk9抗体具有结合pcsk9的能力。
在优选的实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域(例如在fr中)。任选地，本发明的抗pcsk9抗体包括对轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表a所示：
表a
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，或例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(adcc)功能(参见shield等(2002)jbc277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(cdc)。
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生fc区变体，以便增强例如抗体治疗涉及异常血管发生和/或血管通透性或渗漏的疾病或病症的有效性。fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人fc区序列(例如人iggl、igg2、igg3或igg4fc区)。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代mab”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中，本发明涵盖抗pcsk9抗体的片段。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab′、fab’-sh，f(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残留的“fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体是人源化抗体。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由almagro&fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(almagrojc和franssonj(2008)frontiersinbioscience13:1619-1633)。almagro&fransson区分理性办法和经验办法。理性办法的特征在于生成少数工程化抗体变体并评估其结合或任何其它感兴趣的特性。如果设计的变体不产生预期的结果，那么启动新一轮的设计和结合评估。理性办法包括cdr嫁接、表面重建(resurfacing)、超人源化(superhumanization)和人字符串内容优化(humanstringcontentoptimization)。相比之下，经验办法基于生成大的人源化变体库并使用富集技术或高通量筛选选出最佳克隆。因而，经验办法依赖于能够对大量抗体变体进行搜索的可靠的选择和/或筛选系统。体外展示技术，如噬菌体展示和核糖体展示满足这些要求并且是技术人员公知的。经验办法包括fr库、导向选择(guidedselection)、框架改组(framework-shuffling)和humaneering。
在一些实施方案中，本发明的抗pcsk9抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于vandijk和vandewinkel，curr.opin.pharmacol5：368-74(2001)以及lonberg，curr.opin.immunol20：450-459(2008)。
可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如hoogenboom等人，methodsinmolecularbiology178：1-37(o′brien等人编，人press，totowa，nj，2001)中评述，并且进一步于例如mccafferty等人，nature348：552-554；clackso等人，nature352：624-628(1991)；marks等人，j.mol.biol.222：581-597(1992)；marks及bradbury，methodsinmolecularbiology248：161-175(lo编，humanpress，totowa，nj，2003)；sidhu等人，j.mol.biol.338(2)：299-310(2004)；lee等人，j.mol.biol340(5)：1073-1093(2004)；fellouse，proc.natl.acad.sci.usa101(34)：12467-12472(2004)；以及lee等人，j.immunol.methods284(1-2)：119-132(2004)中描述。
在一些实施方案中，本发明还涵盖与治疗性模块，如细胞毒性剂或免疫抑制剂缀合的抗pcsk9单克隆抗体(“免疫缀合物”)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的，参见例如wo05/103081。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)c，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性或多特异性的。多特异性单抗可以对一种靶多肽的不同表位是特异性的或可以含有对超过一种靶多肽特异性的抗原结合域。参见例如，tutt等(1991)j.immunol.147:60-69。抗pcsk9单抗可以与另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达。例如抗体或其片段可以功能性与一或多种其它分子，如另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价联合或以其它方式)以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合人pcsk9蛋白。
本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗pcsk9抗体或其片段的核酸。所述核酸可以编码包含抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列，或包含抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。
在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523，还见charlton，methodsinmolecularbiology，卷248(b.k.c.lo，编辑，humanapress，totowa，nj，2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见gerngross，nat.biotech.22：1409-1414(2004)，和li等，nat.biotech.24：210-215(2006)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如graham等，j.genvirol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等，proc.natl.acad.sci.usa77：216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如y0，ns0和sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如yazaki和wu，methodsinmolecularbiology，卷248(b.k.c.lo，ed.，humanapress，totowa，nj)，第255-268页(2003)。
在一个实施方案中，提供了制备抗pcsk9抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗pcsk9抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
药物组合物和药物制剂
本发明还包括包含抗pcsk9抗体的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗pcsk9抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合pcsk9的抗体或一种或多种编码一种或多种结合pcsk9的抗体的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用载体，如本领域中已知的药用赋形剂，包括缓冲剂。
适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“handbookofpharmaceuticalexcipients”,第五版,r.c.rowe,p.j.seskey和s.c.owen,pharmaceuticalpress,london,chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗pcsk9抗体与一种或多种任选的药用载体(remington′spharmaceuticalsciences，第16版，osol，a.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗pcsk9抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和wo2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供他汀类物质。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
抗体的治疗方法和用途
在一方面中，本发明涉及在受试者中抑制pcsk9与ldl-受体(ldlr)结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在另一方面中，本发明涉及降低受试者的胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一个实施方案中，胆固醇是ldl-胆固醇。在另一方面中，本发明涉及降低受试者的ldl-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明涉及降低受试者的血清ldl-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在另一方面中，本发明涉及治疗受试者的与升高的ldl-胆固醇水平相关的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一方面中，本发明涉及治疗胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明涉及治疗高胆固醇血症和/或高脂血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段。在一方面中，本发明涉及治疗可以通过消除、抑制或降低pcsk9活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。在一些实施方案中，可以通过使用他汀类物质治疗或预防的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段来治疗。在一些实施方案中，可以受益于防止胆固醇合成或提高的ldlr表达的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗pcsk9抗体或其片段来治疗。优选地，受试者是人。
在其他方面，本发明提供抗pcsk9抗体在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗上文提及的相关疾病或病症。
在某些实施方案中，针对pcsk9的本发明的抗体或抗体片段可防治性地施用以预防或缓和高胆固醇血症、高脂血症、心血管疾病和/或任何胆固醇相关疾病的发作。在某些实施方案中，可施用针对pcsk9的本发明的抗体或抗体片段以治疗现有高胆固醇血症和/或高脂血症。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，他汀类物质，包括但不限于阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗舒伐他汀，辛伐他汀或其任意组合，例如，
上述组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，本发明的抗pcsk9抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。
本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。所述抗体的示例性的剂量范围包括3-30mg/kg。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗pcsk9抗体或其抗原结合片段可以用于检测pcsk9在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗pcsk9抗体。在另一个方面中，提供检测pcsk9在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测pcsk9蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，pcsk9是人pcsk9。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗pcsk9抗体在允许抗pcsk9抗体与pcsk9结合的条件下接触，并检测在抗pcsk9抗体和pcsk9之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗pcsk9抗体被用于选择适合利用抗pcsk9抗体的治疗的受试者，例如其中pcsk9或ldl-胆固醇是用于选择患者的生物标记物。
在一个实施方案中，可以使用本发明的抗体诊断胆固醇相关疾病，例如高胆固醇血症和/或高脂血症。
在某些实施方案中，提供标记的抗pcsk9抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32p、14c、125i、3h和131i，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(hr)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如hr，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
实施例
实施例1.抗pcsk9的抗体筛选确定母抗体
抗原生物素标记
按照厂商的说明,采用pierce公司的琥珀酰亚胺基磺酸基生物素标记工具包对pcsk9抗原(seqidno.53)进行生物素标记。fitc标记山羊抗人免疫球蛋白f(ab’)kappa链抗体(lc-fitc)购自(southernbiotech)、聚乙烯抗生物素蛋白(sa-pe)购自(sigma)、链霉亲和素-633(sa-633)购自(molecularprobes)。链霉微珠和细胞免疫磁珠分离柱购自muktebyils。
初步筛选
8个合成基于酵母的抗体展示(yeast-basedantibodypresentation)文库(来自adimab)按照现有的方法(xu等人,2013；wo2009036379；wo2010105256；w02012009568)进行扩增，每个库多样性达到1×109。简言之，前两轮的筛选使用muktebyi公司的macs系统进行磁性激活细胞分选进行。首先，将每个文库的酵母细胞(～1×1010细胞/文库)分别在facs洗涤缓冲液中(磷酸盐缓冲液，含有0.1％牛血清蛋白)室温孵化15分钟，缓冲液中含有如上所述制备的100nm生物素标记的pcsk9抗原。使用50ml预冷的facs洗涤缓冲液洗一次，再用40ml相同洗涤缓冲液重悬细胞，并加入500μl链霉素微珠于4℃孵化15分钟。1000rpm离心5min弃去上清后用5mlfacs洗涤缓冲液重悬细胞，将细胞溶液加到muktebyils柱中。加样完成后，facs洗涤缓冲液洗柱3次，每次3ml。从磁性区域取下muktebyils柱，用5ml生长培养基洗脱，收集洗脱的酵母细胞并在37℃过夜生长。
使用流式细胞仪进行下一轮的分选：将经过macs系统筛选获得的大约1×108的酵母细胞用facs缓冲液洗三次，于含有低浓度生物素(100-1nm)标记的pcsk9抗原或者pcsk9-fc融合抗原中室温下培养。弃去培养液，细胞用facs洗涤缓冲液洗两次之后，将细胞与lc-fitc(1：100稀释)混合并与sa-633(1:500稀释)或ea-pe(1:50稀释)试剂混合，4℃下培养15分钟。用预冷的facs洗涤缓冲液洗脱两次，并重悬于0.4ml缓冲液中，将细胞转移到带滤器的分离管中。使用facsaria(bdbiosciences)分选细胞。
接下来再通过几轮筛选以获得竞争性配体并清除非特异性结合物(例如cho细胞的膜蛋白)。经过最后几轮的分选之后，将收集的酵母细胞涂平板，在37℃培养过夜，挑选出靶标单克隆。利用sanger法对所获得抗体的可变区进行测序。共获得大约310个可变区序列独特的抗体并逐一进行鉴定。
通过酵母表达并使用proteina亲和层析的方法纯化获得了这些抗pcsk9抗体蛋白。
抗体生产纯化
将通过筛选获得的表达抗pcsk9抗体的酵母细胞在30℃下震荡诱导48小时以表达抗pcsk9的抗体。诱导结束之后，1300rpm离心10min去除酵母细胞，收获上清液。使用proteina对上清液中的抗pcsk9抗体进行纯化，ph2.0醋酸溶液洗脱，收获抗pcsk9抗体。使用木瓜蛋白酶消化并用kappaselect(ge生命医疗集团)进行纯化获得相应的fab片段。
根据本领域常规方法，从上述表达抗pcsk9抗体的酵母细胞获得编码抗pcsk9抗体的基因dna，并根据常规方法将该基因dna克隆到新的表达载体(pcdna3.1)。
将含有目标抗体基因的上述表达载体与转染试剂lipofectaminetm2000(购自invitrogen)按照生产产商提供的方案瞬时转染培养的人肾胚细胞293细胞，弃去培养基并用新鲜的培养基把细胞稀释到4x106/ml。在37℃，5％co2的条件下培养细胞7天，每48小时流加新鲜培养基。7天后，13000rpm离心20min。取上清液，用proteina纯化上清液，使抗体的纯度＞95％。
fortebiokd测定(生物膜层干涉法)
fortebio亲和力测定按照现有的方法(estep,p等人，highthroughputsolutionbasedmeasurementofantibody-antigenaffinityandepitopebinning.mabs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至ahq传感器上。再将传感器放入100nm的pcsk9抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
msd-set动力学检测
平衡亲和力的检测如前所述(estep等人2013)。在含有0.1％的无iggbsa的磷酸盐缓冲盐水(pbsf)中，加入终浓度为10-100pm的如前所述获得的生物素标记的pcsk9抗原(b-pcsk9)，对如上获得的抗pcsk9fab或mab经过3到5倍连续稀释，获得浓度为5-100nm的fab或mab溶液。将抗体(稀释于20nm磷酸盐缓冲盐水中)4℃过夜或室温30分钟包被在msd-ecl板上。加入3％bsa，700rpm室温封闭30分钟，之后用清洗缓冲液(pbsf+0.05％吐温20)洗3遍。将样品加入板中置于摇床中700rpm室温孵育150秒后清洗1遍。加入250ng/mlsulfotag标记的链霉抗生物素(稀释于pbsf中)，室温孵育3分钟。缓冲液清洗3遍后使用msdsectorimager2400设备读取来确定结合在板上的抗原。未结合的抗原百分比通过滴定抗体方法得到，结果发现抗pcsk9fab或mab与抗原的结合符合代谢动力学的二次方程。
octetred384结合表位鉴定
结合表位鉴定使用了标准的三明治式的交互阻断分析法。将靶点特异性对照igg固定于ahq传感器上，并且用不相干的人igg1抗体封闭传感器上空fc结合位点。将传感器放于100nm的目标抗原pcsk9溶液中120s，再放入到第二种如上所制备的100nm抗pcsk9的抗体或配体溶液中。读取数据，并将数据通过fortebio数据分析软件7.0(来自fortebio)处理。抗原结合抗体后还能被第二种抗体或配体结合暗示有一个未结合表位(非竞争性的)，没有结合则表示表位阻断(竞争性的或配体阻断)。
通过以上的筛选和鉴定工作，我们获得了一些能够阻断pcsk9和ldlr结合且和人鼠pcsk9都结合的抗体。为了获得更高亲和力的抗pcsk9抗体，我们通过以下方法对抗体adi-02396进行了优化。
实施例2抗pcsk9抗体的亲和力优化
vhmut筛选
该方法是通过常规的错配pcr的方法向抗体重链区域引入突变。pcr过程中，通过使用1um高突变的碱基类似物dptp和8-oxo-dgtp，从而将碱基错配概率提高至约0.01bp。
获得的错配pcr的产物通过同源重组的方法构建入含有重链恒定区的载体中。通过这种方法，在包括pcsk9抗原滴度、未标记抗原竞争以及使用母抗体竞争的筛选压力下，我们获得了库容量为1x107的次级库。通过facs方法进行了3轮成功筛选。
cdrh1/cdrh2筛选
把vhmut方法获得的子代抗体的cdrh3基因构建入1x108多样性的cdrh1/cdrh2基因库中，并对其进行了3轮筛选。第一轮使用macs方法，而第二、三轮使用facs方法，对抗体抗原结合物进行亲和力加压，筛选出最高亲和力的抗体。
第一轮优化：第一步工作是使这个具有人鼠交叉活性、配体竞争性抗pcsk9抗体adi-02396(命名为“母”抗体)的亲和力提高。简而言之，就是向母抗体中引入突变(利用“错配pcr”的方法)，建立次级基于酵母的抗体展示(yeast-basedantibodypresentation)库。最终生成了大约1×107大小的次级库用于后面更高亲和力抗体的富集。筛选压力包括pcsk9抗原滴度、未标记抗原竞争以及使用母抗体竞争。facs技术也用于筛选目标群体(具体操作方法参见chao等人natureprotocols,2006)。经过2-3轮的富集，将获得的酵母涂平板从而可以获得单克隆。经过这一工作后，总共得到了3个亲和力改进的后代，adi-09111、adi-09112和adi-09113。通过fortebiooctet测定，这三个抗体的kd范围是1-10nm。两个子代抗体adi-09112和adi-09113被用于第二轮的亲和力优化。
第二轮的亲和力优化：第二步工作是提高两个人鼠交叉活性、配体竞争性的抗pcsk9单抗adi-09112和adi-09113(命名为“母”抗体)的亲和力。简而言之，就是为每一个母抗体再建立次级基于酵母的抗体展示(yeast-basedantibodypresentation)库。将母抗体的cdr-h3和轻链(lc)与现有酵母文库中的基因的cdr-h1和cdr-h2相结合(命名为：“h1/h2”优化)。这最终生成了大约1×108大小的5个库用于后面更高亲和力抗体的富集。筛选方法同第一轮筛选。经过2-3轮的富集，将酵母菌涂在平板上获得单克隆。经过这一工作后，得到了亲和改进的后代抗体，其中adi-10085、adi-10086和adi-10087是adi-09912的cdr-h1及cdr-h2区域的变异体，adi-10088、adi-10089和adi-10090是adi-09113的vh区域变异体。所述抗体的相关序列信息参见表b-d。这些抗体对人pcsk9的亲和力提高了10倍，通过fortebio法和msd-set测定表明其kd范围在4-17pm～200pm之间(表1，表2)。有部分抗体的亲和力比对照抗体高10倍左右。其他抗体功能鉴定可以进一步缩小抗体数量，以便于临床前的开发。
本申请涉及的各个抗pcsk-9抗体的序列信息及编号如下表b-d所示：
表b.本申请示例性抗体的各个cdr序列编号
表c.本申请示例性抗体的重链可变区和轻链可变区的各框架区序列编号
表d.本申请示例性抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和轻链序列的序列编号
表1:fortebio法测定抗体kd值
表2:msd-set动力学测定抗体kd值
实施例3.抗pcsk-9抗体抑制pcsk-9与ldlr结合实验
用pbs溶液(磷酸盐缓冲溶液)稀释如实施例1所述的pcsk9蛋白至400nmol/l作为工作液。分别用pbs溶液稀释如实施例2所获得的抗pcsk9抗体(adi-10085、adi-10086、adi-10087、adi-10088、adi-10089和adi-10090)至浓度依次为1000nmol/l、100nmol/l、10nmol/l、1nmol/l、0.1nmol/l，按照同样的方法制备对照抗体(alirocumab、evolocumab、bococizumab和lodelcizumab)各个浓度的溶液。将pcsk9工作液与梯度稀释的各个抗pcsk9抗体样品或者对照样品等体积混合。用pbs溶液重悬过表达ldlr的cho细胞(cho-ldlr)并计数，将其细胞浓度用pbs溶液调整至4×106个/ml，接种于96孔u型细胞培养板中每孔加入50μl的细胞培养液，加入50μlpcsk9与抗pcsk9抗体的混合液，每孔中细胞数为2.0×105个，200g室温离心5分钟，弃上清。用pbs溶液按1:200比例稀释抗-his-fitc(r&dsystems)终浓度至2.5μg/ml，加入96孔板中，100μl每孔，冰浴30分钟。200g室温离心5分钟，轻轻弃上清液，每孔中加入150μlpbs溶液，200g室温离心5分钟，轻轻弃上清液，重复3次。在每个实验孔中加入80μl/孔的pbs溶液，移液器吹打数下重悬细胞。用流式细胞仪检测细胞荧光信号值。
实验所检测到的荧光信号，请参见下述表3。
表3:荧光信号值
将表3原始数据用graphpadprism6软件进行分析作图得到图1。
实验结果表明，抗pcsk9抗体与对照抗体相比具有相当的阻断pcsk9与ldlr结合的能力。
实施例4细胞ldl-c摄取分析实验
从液氮保存罐中取出hepg2细胞冻存管，37℃快速水浴融化，将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml室温生长培养基(90％dmem+10％fbs，其中dmem和fbs均购自gibco公司)，1000r/分钟，室温离心5分钟后，用新鲜生长培养基重悬沉淀细胞，转入培养瓶中在37℃，5％co2条件下培养。取对数生长期的hepg2细胞，pbs溶液清洗两次后，加入1ml的0.25％的胰蛋白酶(购自gibco)消化3分钟，加入6ml的生长培养基重悬细胞终止反应。用生长培养基将hepg2细胞调整至0.8×106个/ml，接种于黑色底部透明的聚-d-赖氨酸涂层96孔细胞培养板(购自nunc)中，每孔100μl，37℃，5％co2培养箱中孵育6～7小时。弃生长培养基，替换为分析培养基(dmem+5％fbs)，100μl/孔，37℃，5％co2培养箱中培养过夜。分别将抗体样品(adi-10085、adi-10087、adi-10088、adi-10089)用分析培养基稀释至66.7nmol/l。再以66.7nmol/l的样品为起始浓度，进行4倍梯度稀释，阳性对照抗体(alirocumab、evolocumab和lodelcizumab)和阴性对照(ldl、pcsk9+ldl和igg)进行相同操作。将获得的各浓度梯度样品分别各取60μl与60μl的66.7nmol/l的pcsk9进行等体积混合，从而获得各个混合液。空白对照为120μl的分析培养基。吸弃96孔板内液体，每孔加入50μl上述混合液和空白对照样品，置于37℃，5％co2培养箱中孵育1小时。取出培养板，每孔加入50μl，用分析培养基稀释的6μg/ml的bodipy标记的ldl溶液(购自lifetechnologies)，将培养板置于37℃，5％co2条件下培养4小时。弃去培养基，每孔加入100μlpbs溶液洗涤培养板后弃去。洗涤两次，每孔再加入100μlpbs溶液。用spectramaxi3酶标仪，读取荧光值。
所获得的荧光值原始数据在下表4中列出，并用graphpadprism6软件对表4中所公开的数据进行分析作图，从而得到图2。从实验结果可知，与未加抗pcsk9抗体的荧光值相比，抗pcsk9抗体(adi-10085、adi-10087、adi-10088、adi-10089)作用hepg2细胞的情况下荧光值增强约两倍。这些数据证明本申请所公开的各个抗pcsk9抗体在hepg2细胞中可以增加ldlr的恢复能力，抑制了pcsk9诱导的ldl-c摄入降低，从而使得hepg2细胞增加对ldl-c的摄取，并且在16.8nm和66.7nm的梯度，其效果均优于阳性对照抗体。
表4:荧光信号值
实施例5.细胞ldlr内化分析实验
pcsk9能与ldlr直接结合促使ldlr内化，进入肝细胞后运至溶酶体降解，从而减少细胞表面表达的ldlr，增加血清中ldl-c的水平。抗pcsk9抗体阻断pcsk9与ldlr的结合，从而降低pcsk9消耗ldlr的能力，本实验通过使cho-ldlr细胞与抗pcsk9抗体及pcsk9蛋白溶液共同孵育，采用上述流式细胞仪检测ldlr的荧光值，比较抗pcsk9抗体与阳性对照抗体(evolocumab)荧光值，来判断抗pcsk9抗体对细胞ldlr内化的生物活性。
使用rpmi1640细胞培养基(gibco)将上述pcsk9蛋白配置为浓度50μg/ml，将60μl，1000nm的抗pcsk9抗体(adi-10085和adi-10087)与pcsk9(50μg/ml)溶液混合，均匀后孵育30分钟，对阳性抗体对照进行相同处理。取cho细胞和cho-ldlr细胞分别离心，500g室温离心3分钟，用pbs溶液重悬细胞并调整细胞密度至2×106个/ml，加入96孔u型板中，100μl/孔，将上述混合的样品100μl/孔加入至培养板中，一式四份，吹打均匀，4℃孵育4小时。之后用200μl的pbs溶液洗3次，500g室温离心3分钟。取5μl抗-ldlr-pe(北京义翘公司，货号20131-r301-p)加入100μlpbs溶液中稀释，然后每孔100μl加入96孔u型板中，避光孵育30分钟。再用200μl的pbs溶液洗3次，500g离心3分钟，用细胞培养基重悬所得到的细胞，并采用流式细胞仪检测cho-ldlr细胞表面标记pe荧光的ldlr蛋白的荧光信号，实验结果请参见表5。将表5原始数据用graphpadprism6软件进行分析作图获得图3。
根据表5的结果可见，本申请获得的抗体有效阻止了细胞的ldlr内化。
表5:荧光信号值
实施例6抗pcsk9抗体对健康sd大鼠的降血脂作用
将受试抗体(adi-10085、adi-10086、adi-10087、adi-10088、adi-10089和adi-10090)分别按照本领域常规方法施用给spf级sd大鼠，其中雌性大鼠体重约254～294g，约9～12周龄；雄性大鼠体重约369～420g，约9～12周龄。各组均为单次给药，给药方案详见表6。
表6:剂量设计与给药
各组动物按以下时间点根据常规方法颈静脉采血：给药前0h(d1)，给药后72h(d4)、168h(d8)、336h(d15)、504h(d22)、672h(d29)、840h(d36)。收集至无抗凝剂的试管中，冰上放置凝结后2～8℃，5000rpm/min离心10分钟，收集血清，用hitachi-7060型自动生化分析仪进行ldl-c和hdl-c的测定。
根据血脂分析数据，计算各时间点ldl-c和hdl-c相对给药前(基线)变化率(％ldl-c和％hdl-c)。各时间点血脂相对基线变化率与基线水平的比较使用spss21.0单因素方差分析(anova)进行，两两比较使用dunnettt3方法。并采用非房室模型分析的方法，通过winnonlinphoenix(v6.4,pharsight公司)软件计算药效动力学参数(以％ldl-c计算)，包括基线下面积(auc_below_b)、最小相对值(rmin)和基线下时间(time_below_b)。药效动力学参数的比较使用spss21.0进行单因素方差分析(anova)比较组间均值。
根据实验结果发现，大鼠单次皮下给予3～30mg/kg本申请的抗pcsk9抗体(adi-10085、adi-10086、adi-10087、adi-10088、adi-10089和adi-10090)后，能够剂量依赖地降低血清ldl-c和hdl-c水平。例如分别在给药后3天±1天、7天±1天、21天±3天较基线水平有显著降低。此外，申请人同时发现当大鼠单次皮下给予10mg/kgevolocumab后，血清ldl-c和hdl-c水平并无显著降低。
实施例7抗pcsk9抗体对健康食蟹猴的降血脂作用
将受试抗体(adi-10085、adi-10086、adi-10087、adi-10088、adi-10089和adi-10090)分别按照本领域常规方法施用给食蟹猴，其中雌性动物体重约2-4kg，年龄约3-5岁，雄性动物体重约3-5kg，年龄约3-5岁。给药方案请参见表7，其中组1～5为单次给药，组6为每周1次给药，共4次给药。
表7:剂量设计与给药
针对组1～5，在以下时间点按照常规方法从动物的给药肢体的对侧前肢或后肢皮下静脉或腹股沟股动脉/腹股沟静脉采血：给药前0h及给药后24h(d2)、72h(d4)、120h(d6)、168h(d8)、336h(d15)、504h(d22)、672h(d29)、840h(d36)、1008h(d43)、1176h(d50)及1344h(d57)。关于组6，在以下时间点按照上述方法采血：首次给药前0h及给药后24h(d2)、72h(d4)、120h(d6)、168h(d8，第2次给药前)、336h(d15，第3次给药前)取血。末次给药于给药前0h，给药开始后24h(d2)、72h(d4)、120h(d6)、168h(d8)、336h(d15)、504h(d22)、672h(d29)、840h(d36)、1008h(d43)、1176h(d50)及1344h(d57)采血。
收集全血至含促凝剂和分离胶的试管中，冰上放置凝结后2～8℃离心，5000rpm/min，离心10min，全部血样采集完成后，进行总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、ldl-c、hdl-c的测定。
根据血脂分析数据，计算各时间点ldl-c和hdl-c相对于给药前(基线)变化率(％ldl-c和％hdl-c)。各时间点血脂相对基线变化率与基线水平的比较使用spss21.0单因素方差分析(anova)进行，两两比较使用dunnettt3方法。并采用非房室模型分析的方法，通过winnonlinphoenix(v6.4,pharsight公司)软件计算药效动力学参数(以％ldl-c计算)，包括基线下面积(auc_below_b)、最小相对值(rmin)和基线下时间(time_below_b)。药效动力学参数的比较使用spss21.0进行单因素方差分析(anova)比较组间均值。
根据实验结果发现：食蟹猴单次皮下给予3、10、30mg/kg本申请的抗pcsk9抗体(adi-10085、adi-10086、adi-10087、adi-10088、adi-10089和adi-10090)后，血清ldl-c(低密度脂蛋白胆固醇)和tc(总胆固醇)水平均显著降低，并呈现出较为明显的量效关系。表明，本申请公开的抗体可以有效用于降低与ldl-c和tc相关的状况和/或病症，例如用于降低血脂。
抗pcsk9抗体给药后对食蟹猴血清hdl-c(高密度脂蛋白胆固醇)水平总体上无明显影响。
食蟹猴单次皮下分别给予10mg/kg本申请的抗pcsk9抗体和evolocumab后，两组的药效动力学参数(％ldl-c计算)并无显著性差异，然而本申请人惊奇地发现，抗体adi-10085、adi-10086、adi-10087、adi-10088、adi-10089和adi-10090给药后，ldl-c和tc均值均出现明显降低，皮下注射3、10、30mg/kg本申请的抗pcsk9抗体后，ldl-c分别在给药后7天±1天、21天±3天、28天±3天较基线水平有显著降低。其中在10mg/kg剂量水平下，同时评估了本申请的抗pcsk9抗体和evolocumab，发现evolocumab给药后ldl-c呈现较基线水平显著降低的时间段仅为14天，短于同剂量本申请抗体给药后的21天±3天，即本申请的抗pcsk9抗体显著降低ldl-c的时间长于evolocumab。
序列表
<110>信达生物制药（苏州）有限公司
<120>抗pcsk9抗体及其用途
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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<212>prt
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151015
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<212>prt
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<212>prt
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thralavalalailecyscysargserarghisleualaglnalaser
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glngluleugln
690
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