本发明涉及一种蛋黄抗体的提纯灭活方法，属于生物制品
技术领域：
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背景技术：
：蛋黄抗体是指蛋黄中的免疫球蛋白(igy)。母鸡在细胞分裂产蛋过程中会将血液中的免疫球蛋白转移至鸡蛋，如血液中的iga、igm会在输卵管中与其他蛋白质结合构成鸡蛋的蛋白部分，igg会经蛋黄薄膜转移至蛋黄内部。由于蛋黄的igg与哺乳类的igg在相对分子质量、等电点、细胞膜上fc受质的键结构上存在着相异点，因而被特定称为igy。igy是一种7s免疫球蛋白，其相对分子质量约为180kd，含两个亚单位，即67～70kd的重链和22～30kd的轻链。鸡蛋黄中igy的纯度高，含量大，具有较强的耐热、耐酸性和特异性，化学性质稳定，产量高，成本低，并且具有动物种系发生学距离的优势，更适于生产特异性抗体。目前，igy常作为免疫学诊断工具，用于测定类风湿因子、补体和血液循环中的免疫复合物，以减少假阳性反应，同时还可用于igg亚类和病毒的检测，此外还能作为免疫预防和治疗剂。蛋黄中蛋白质与脂肪的比例约为1:2，其中大部分蛋白是脂蛋白，存在于蛋黄颗粒中，不溶于水，只有α、β、γ免疫球蛋白是水溶性蛋白。而igy是一种γ球蛋白，因此igy的分离纯化首先要去除卵黄中的脂类，再从水溶性蛋白中分离出igy，从而有效避免脂类氧化变质及黏稠注射困难等问题。目前，从蛋黄中提取igy的方法包括氯仿法、聚乙二醇置换法、水稀释法、辛酸法、硫酸铵法、层析法等，这些方法高效、经济，但又各有优缺点。如氯仿法操作简便、省时，除脂效果佳，但气味较大，存在有机物残留，且成本相对较高。聚乙二醇是一种非离子型水溶性聚合物，亲水性较强，能够破坏蛋白质的水化层，可利用抗体蛋白的亲水和疏水特性分离得到蛋黄抗体，且不会引起蛋白变性，收率高、成本低，但同时澄清度和纯度也较低。亲硫性混合模式吸附层析是将混合模式吸附应用到亲硫层析中，通过亲硫层析吸附剂引入含氮杂环，改变亲硫层析相对单一的吸附作用，增强吸附剂与抗体的结合能力，从而提高对抗体的特异性吸附，该方法操作简单，收率高、成本低，但同时也存在吸附剂通用性差的缺点，针对某一分离对象需要制备专一的吸附剂和建立相应的试验条件。硫酸铵法与其他方法相比提取率低、澄清度低、纯度低。并且，现有技术中制备蛋黄抗体的高免蛋大多为非spf蛋，在生产过程中极易染上传染性致病菌和病毒，而这些致病微生物若被带入到蛋黄抗体内，将会带来严重的微生物传播问题。公开号cn102492035a的发明专利公开了一种卵黄抗体的制备方法，包括：无菌取出高免蛋的卵黄，在卵黄中按比例加入聚乙二醇溶液，充分混合后静置，取上层清液；在上层清液中按比例加入甲醛溶液灭活，即得卵黄抗体。该方法操作简单，制备成本低，但得到的卵黄抗体纯度也较低，并且灭活抗体只能诱发机体产生体液免疫，细胞免疫作用甚微。因此，开发一种新型的蛋黄抗体提纯灭活技术尤为重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种蛋黄抗体的提纯灭活方法。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种蛋黄抗体的提纯灭活方法，包括以下步骤：1)在蛋黄中加入缓冲液和聚乙二醇，使聚乙二醇的终浓度为10％～15％，混匀后离心，取沉淀；2)在沉淀中加入缓冲液和酸化水，使体系ph值为4.2～5.0，混匀后静置，取上清液；3)在上清液中加入正辛酸，使其终浓度为0.1％～0.3％，混匀后静置，取上清液；4)上清液过滤除菌，再超滤浓缩，得浓缩液；5)浓缩液采用亲硫性混合模式吸附技术纯化，得到提纯的蛋黄抗体。步骤1)中缓冲液为浓度0.01mol/l、ph7.2的pbs缓冲液，其加量为蛋黄体积的2.5～3.5倍。步骤1)中聚乙二醇的相对分子量为4000～8000，优选聚乙二醇6000。步骤1)中离心的参数为：转速3000～4000rpm，时间5～15min。步骤2)中缓冲液为浓度0.01mol/l、ph7.2的pbs缓冲液，其加量为将沉淀还原至原蛋黄体积。步骤2)中酸化水的温度为1～4℃，其加量为蛋黄体积的5～7倍。酸化水可采用ph值4.0～4.5的盐酸溶液，将体系ph值调至4.2～5.0即可。步骤2)中静置的温度为2～8℃，时间12～20h。步骤3)中先将上清液加热至18～26℃，再加入正辛酸。步骤3)中静置的温度为18～26℃，时间12～20h。步骤4)中过滤除菌为：上清液依次经孔径0.45μm、0.22μm的滤膜过滤。步骤4)中超滤浓缩为：采用截留分子量30～50kd的超滤膜浓缩30～50倍体积。步骤5)中亲硫性混合模式吸附的技术参数为：吸附剂为mep-hypercel吸附剂(购自pallbiosepra公司，主要用于抗体的分离纯化)，上样平衡液为0.05mol/lph8.9tris-hcl缓冲液，洗脱液为0.02mol/lph4.2柠檬酸钠缓冲液，清洗液为0.1mol/l氢氧化钠溶液。步骤5)中蛋黄抗体经提纯后，还需进行灭活处理。灭活的操作为：在提纯的蛋黄抗体中加入终浓度为0.1％～0.2％的甲醛溶液，于20～30℃下一次灭活12～20h；在一次灭活的溶液中加入冻干保护剂，冻干后用60co照射灭活，即可。60co照射的剂量为10～15kgy。本发明的有益效果：本发明将peg置换、酸化水萃取、辛酸抽提和亲硫性混合模式吸附层析技术相结合用于提纯蛋黄抗体，能显著提高抗体提纯效果。其中聚乙二醇是一种非离子型水溶性聚合物，高浓度不会引起蛋白质变性，向蛋黄中加入一定量的聚乙二醇，能将蛋白质聚集留在沉淀中，且作用时间短，不影响离心处理，离心后沉淀用缓冲液重悬，即可进行酸化处理。酸化水萃取主要是分离蛋黄液中的亲水性部分和疏水性部分，将蛋黄用酸化水做一定倍数稀释后，igy主要存在于上清液中，抽取上清液备用。辛酸抽提是利用igy的特殊化学性质，在低离子强度、ph4.2～4.5酸性条件下，辛酸与绝大多数的卵黄蛋白发生反应，生成不可逆的沉淀，而igy不发生反应，留在上清液中，离心除去沉淀，收集上清液，浓缩，浓缩液再进行亲硫性混合模式吸附层析。亲硫性混合模式吸附层析主要是利用生物大分子与固定相表面存在的某种特异性吸附作用进行选择性分离的方法，该方法采用美国pallbiosepara公司开发的hcic介质mep-hypercel分离纯化抗体。将这四种抗体提纯方法有序组合能够提高抗体收率和纯度，降低制品对机体的副作用和应激反应。本发明将甲醛灭活与60co辐照灭活技术相结合，能有效杀灭卵黄中传染性致病菌和病毒，保证蛋黄抗体无外源细菌和病毒污染。该技术安全可靠，解决了经蛋垂直传播病原和蛋黄腐败所致细菌的污染问题，并且能保留病原体表面的保护性抗原成分，激发机体免疫系统启动全面防御，保障蛋黄抗体的活性。本发明中蛋黄抗体提纯灭活技术的工艺简单、操作方便，产品收率高、纯度好，保存期长，使用安全可靠、无残留，制备成本低，适于工业化生产及应用。具体实施方式下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。实施例1抗小鹅瘟冻干蛋黄抗体的提纯灭活方法，包括以下步骤：1)取100枚小鹅瘟高免蛋，对鸡蛋进行消毒、熏蒸，手工打蛋分离出蛋黄；2)在蛋黄中加入3倍体积的浓度0.01mol/l、ph7.2的灭菌pbs缓冲液，搅匀后加入无菌聚乙二醇6000，边加边搅拌，使其终浓度为12％，继续搅拌30分钟，3500rpm离心10min，取沉淀；3)将沉淀用pbs缓冲液(同上)还原至原蛋黄体积，再加入6倍体积预冷至2℃、ph4.0的酸化水(盐酸溶液)，搅匀，4℃静置16h，抽取上清液；4)将上清液加热至22℃，并向其中加入终浓度为0.2％的正辛酸，充分混匀后于22℃静置16h，抽取上清液；5)上清液先经0.45μm、0.22μm滤器过滤除菌，滤液再经截留分子量为50kd的超滤膜浓缩40倍，得浓缩液；6)浓缩液采用亲硫性混合模式吸附层析技术纯化，层析柱装30mlmep-hypercel吸附剂，以0.05mol/lph8.9tris-hcl缓冲液为上样平衡液，0.02mol/lph4.2柠檬酸钠缓冲液为洗脱液，0.1mol/l氢氧化钠溶液为清洗液，上样平衡液、洗脱液的流速均为1ml/min，清洗液的流速为2ml/min，得到提纯的蛋黄抗体；7)在提纯的蛋黄抗体中加入终浓度为0.15％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，25℃静置16h，每20分钟搅拌一次；经无菌检测、中和效价检测合格后，依次加入终浓度为5.0％、1.0％、0.5％的海藻糖、甘露醇和甘氨酸，充分搅拌后无菌定量分装，分装后迅速冻干；将冻干的蛋黄抗体用60co照射灭活，照射剂量为12kgy，得到抗小鹅瘟冻干蛋黄抗体。实施例2抗猪伪狂犬病毒冻干蛋黄抗体的提纯灭活方法，包括以下步骤：1)取100枚猪伪狂犬病毒高免蛋，对鸡蛋进行消毒、熏蒸，手工打蛋分离出蛋黄；2)在蛋黄中加入2.5倍体积的浓度0.01mol/l、ph7.2的灭菌pbs缓冲液，搅匀后加入无菌聚乙二醇4000，边加边搅拌，使其终浓度为15％，继续搅拌30分钟，3000rpm离心15min，取沉淀；3)将沉淀用pbs缓冲液(同上)还原至原蛋黄体积，再加入5倍体积预冷至1℃、ph4.2的酸化水(盐酸溶液)，搅匀，2℃静置20h，抽取上清液；4)将上清液加热至18℃，并向其中加入终浓度为0.1％的正辛酸，充分混匀后于18℃静置20h，抽取上清液；5)上清液先经0.45μm、0.22μm滤器过滤除菌，滤液再经截留分子量为50kd的超滤膜浓缩30倍，得浓缩液；6)浓缩液采用亲硫性混合模式吸附层析技术纯化，层析柱装30mlmep-hypercel吸附剂，以0.05mol/lph8.9tris-hcl缓冲液为上样平衡液，0.02mol/lph4.2柠檬酸钠缓冲液为洗脱液，0.1mol/l氢氧化钠溶液为清洗液，上样平衡液、洗脱液的流速均为1ml/min，清洗液的流速为2ml/min，得到提纯的蛋黄抗体；7)在提纯的蛋黄抗体中加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，20℃静置20h，每20分钟搅拌一次；经无菌检测、中和效价检测合格后，依次加入终浓度为5.0％、1.0％、0.5％的海藻糖、甘露醇和甘氨酸，充分搅拌后无菌定量分装，分装后迅速冻干；将冻干的蛋黄抗体用60co照射灭活，照射剂量为10kgy，得到抗猪伪狂犬病毒冻干蛋黄抗体。实施例3抗番鸭细小病毒冻干蛋黄抗体的提纯灭活方法，包括以下步骤：1)取100枚番鸭细小病毒高免蛋，对鸡蛋进行消毒、熏蒸，手工打蛋分离出蛋黄；2)在蛋黄中加入3.5倍体积的浓度0.01mol/l、ph7.2的灭菌pbs缓冲液，搅匀后加入无菌聚乙二醇8000，边加边搅拌，使其终浓度为10％，继续搅拌30分钟，4000rpm离心5min，取沉淀；3)将沉淀用pbs缓冲液(同上)还原至原蛋黄体积，再加入7倍体积预冷至4℃、ph4.5的酸化水(盐酸溶液)，搅匀，8℃静置12h，抽取上清液；4)将上清液加热至18℃，并向其中加入终浓度为0.1％的正辛酸，充分混匀后于18℃静置20h，抽取上清液；5)上清液先经0.45μm、0.22μm滤器过滤除菌，滤液再经截留分子量为30kd的超滤膜浓缩50倍，得浓缩液；6)浓缩液采用亲硫性混合模式吸附层析技术纯化，层析柱装30mlmep-hypercel吸附剂，以0.05mol/lph8.9tris-hcl缓冲液为上样平衡液，0.02mol/lph4.2柠檬酸钠缓冲液为洗脱液，0.1mol/l氢氧化钠溶液为清洗液，上样平衡液、洗脱液的流速均为1ml/min，清洗液的流速为2ml/min，得到提纯的蛋黄抗体；7)在提纯的蛋黄抗体中加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，30℃静置12h，每20分钟搅拌一次；经无菌检测、中和效价检测合格后，依次加入终浓度为5.0％、1.0％、0.5％的海藻糖、甘露醇和甘氨酸，充分搅拌后无菌定量分装，分装后迅速冻干；将冻干的蛋黄抗体用60co照射灭活，照射剂量为15kgy，得到抗番鸭细小病毒冻干蛋黄抗体。对比例1抗小鹅瘟冻干蛋黄抗体的提纯方法，包括以下步骤：1)取100枚小鹅瘟高免蛋，对鸡蛋进行消毒、熏蒸，手工打蛋分离出蛋黄；2)用1mol/l的盐酸溶液将灭菌注射用水调至ph值为5.0，并降温至2℃，按照蛋黄体积6倍的量加入到蛋黄中，边加边搅拌，然后4℃静置16h，抽取上清液；3)将上清液加热至22℃，并向其中加入终浓度为0.2％的正辛酸，充分混匀后22℃静置16h，抽取上清液，得到提纯的蛋黄抗体。对比例2抗小鹅瘟冻干蛋黄抗体的提纯方法，包括以下步骤：1)取100枚小鹅瘟高免蛋，对鸡蛋进行消毒、熏蒸，手工打蛋分离出蛋黄；2)在蛋黄中加入3倍体积的浓度0.01mol/l、ph7.2的灭菌pbs缓冲液，搅匀后加入无菌聚乙二醇6000，边加边搅拌，使其终浓度为12％，继续搅拌30分钟，3500rpm离心10min，取沉淀；3)将沉淀用pbs缓冲液(同上)还原至原蛋黄体积，再加入6倍体积预冷至2℃、ph4.0的酸化水，搅匀，4℃静置16h，抽取上清液；4)将上清液加热至22℃，并向其中加入终浓度为0.2％的正辛酸，充分混匀后于22℃静置16h，抽取上清液；5)上清液依次经0.45μm、0.22μm滤器过滤除菌，得到提纯的蛋黄抗体。试验例1、不同提取工艺提纯后抗体检测取实施例1及对比例1～2中提纯后的蛋黄抗体进行外观、气味、抗体效价、蛋白含量、脂肪残留量等检测，检测结果见下表1。抗体效价检测：用琼脂扩散试验检测原蛋黄及提取后蛋黄抗体琼扩效价。蛋白含量检测：用lowry蛋白浓度测定试剂盒测定蛋黄抗体的蛋白含量，测定结果换算为每毫升蛋黄抗体的蛋白含量。脂肪残留量检测：用德杜szf-06c脂肪测定仪测定蛋黄抗体的脂肪残留量，测定结果换算为每毫升蛋黄抗体的脂肪残留量。表1不同提取工艺提纯后抗体检测对比结果检测项目对比例1对比例2实施例1颜色淡黄色，澄清透明无色，澄清透明无色，澄清透明气味略带辛酸味略带辛酸味无气味蛋白含量(mg/ml)8.165.872.62脂肪残留量(mg/ml)7.053.780.56稀释倍数770.9使用原蛋黄量(ml)100100100提纯后抗体量(ml)49048590原蛋黄效价1:1281:1281:128提纯后抗体效价1:241:241:128抗体综合收率92％91％90％由表1可知，实施例1中提纯的抗体杂蛋白和脂肪残留量少，抗体纯度高、收率高。2、不同灭活方式对灭活效果的影响选择垂直传播且较难灭活的微生物作为指示微生物(包括减蛋综合征病毒、蜡样芽胞杆菌芽孢、鸡大肠杆菌、铜绿假单胞菌和禽脑脊髓炎病毒)，取适量加入蛋黄液中，提纯抗体，然后采用不同的方式灭活，分别于灭活前、后进行细菌计数、病毒灭活检验和抗体效价测定，结果见下表2。60co辐照剂量灭活组：取小鹅瘟高免蛋消毒晾干，分离出蛋黄，向蛋黄液中加入适量指示微生物(见下表2)，提纯抗体后进行无菌分装，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞轧盖，60co辐照，辐照剂量为10kgy。甲醛溶液灭活组：取小鹅瘟高免蛋消毒晾干，分离出蛋黄，向蛋黄液中加入适量指示微生物(见下表2)，提纯抗体后加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，充分混匀，25℃作用24h，期间每隔20min搅拌一次；灭活后进行无菌分装，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞轧盖。甲醛-60co辐照综合灭活组：取小鹅瘟高免蛋消毒晾干，分离出蛋黄，向蛋黄液中加入适量指示微生物(见下表2)，提纯抗体后加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，充分混匀，25℃作用24h，期间每隔20min搅拌一次；甲醛灭活后进行无菌分装，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞轧盖，60co辐照，辐照剂量为10kgy。对照组：取小鹅瘟高免蛋消毒晾干，分离出蛋黄，向蛋黄液中加入适量指示微生物(见下表2)，提纯抗体后进行无菌分装，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞轧盖。表2不同灭活方式灭活效果对比结果由表2可知，甲醛-60co辐照灭活方式对指示微生物的灭活效果最佳，且对抗体效价基本无影响。当前第1页12