一种提取牛血清蛋白的方法与流程

本发明涉及蛋白提取
技术领域：
，特别涉及一种提取牛血清蛋白的方法。
背景技术：
：畜禽血液是畜禽重要的副产品之一，内含丰富的营养物质和多种生物活性物质，血清蛋白是血浆里最丰富的蛋白质，是血液中脂肪酸的携带者，每一个蛋白分子能携带七个脂肪酸分子，这些脂肪酸分子结合在蛋白的缝隙中，它们富含碳的尾部埋藏在里面安全地避开周围的水分子，脂肪酸是建造脂质的成分，而脂质又构成了细胞周围和细胞内所有的生物膜，脂肪酸又是能量的重要来源，脂肪酸还是脂溶性维生素的载体，当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位，血清蛋白同样能够携带许多其它的不溶于水的分子，正因为血清蛋白是如此普遍地存在于血液中并且容易被提纯，所以它成为科学家最早研究的蛋白质之一，牛血清蛋白作为一种功能因子，广泛应用于动物细胞培养、诊断试剂、食品乳化等方面，能提高人体t淋巴细胞数量和抗氧化活性，具有极大的医学开发价值。牛血清中白蛋白的制备方法很多，主要采用盐析法、有机溶剂沉淀法和热激法提取，盐析法用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得；有机溶剂沉淀法最早用于人血液制品的生产，利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、ph、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中的溶解度不同分离血浆蛋白质，可以生产出多种血浆蛋白；热激法是取牛血用枸橼酸钠抗凝离心后得到血浆，加热，加入辛酸钠，调ph值后加乙醇，再经过滤、脱盐、浓缩、冻干后得牛血清中白蛋白，但是，现有的用于制备牛血清白蛋白的方法所得的牛血清白蛋白收率或纯度都比较低，且所提取的牛血清白蛋白中含有较高浓度的杂质例如脂肪酸、蛋白酶、核酸酶以及内毒素，这类杂质限制了牛血清白蛋白的进一步应用。技术实现要素：本发明为解决上述技术问题，提供了一种提取牛血清蛋白的方法。具体是通过以下技术方案来实现的：一种提取牛血清蛋白的方法，包括以下步骤：(1)从牛静脉处收集新鲜牛血液，经血液分离机分离成血细胞和血浆，在血浆中加入血浆质量的20～30％的蛋白沉降剂，分离，得固体蛋白料和溶液料；(2)固体蛋白料处理：将固体蛋白料加水搅拌，得蛋白溶液，加入固体蛋白料质量的12～18％的抗凝剂，搅拌摇匀，离心，取上清液，加入盐酸调节上清液ph值为4.5～5，加入上清液质量4～8％的脱水剂，拌匀，静置，离心取沉淀，烘干得料1；(3)溶液料处理：将溶液料、分散剂、氧化剂按1.2～1.8∶0.1～0.2∶0.35～0.45的质量比混合，得混合料，进行氧化处理，再加入混合料质量的0.12～0.15％的金属剂，离心，取上清液，再加入上清液质量10～15％的蛋白质析出剂，静置12～18h，离心取沉淀，烘干得料2；(4)将料1和料2混合，得混合料，先用乙醇洗涤混合料2～3次，再用乙醚洗涤2～3次，烘干即可。所述的蛋白沉降剂，是将含量为12～18％的磺基水杨酸水溶液和含量为10～20％的三氯乙酸水溶液按0.8～1.2∶1.2～1.8的质量比混合制得。所述的抗凝剂，是将枸橼酸钠和浓度为0.012～0.18％的盐水按1∶0.3～0.6的质量比混合。所述的脱水剂，是将甘露醇和甘油按0.2～0.3∶0.12～0.18的质量比混合。所述的分散剂是十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺和甲基戊醇中的一种。所述的氧化剂，是将浓度为22～28ml/l的臭氧、硫解酶按1.2～1.6∶0.25～0.35的质量比混合。所述的氧化处理，是将物料加热至34～36℃，反应时间为2.5～3.5h。所述的金属剂，其中锌离子、铅离子和铁离子的质量比为0.8～1.2∶0.1～0.2∶0.36～0.48。所述的蛋白质析出剂，是将甲醇和乙醇等质量混合，用盐酸调节溶液ph值为4.5～5，拌匀即可。综上所述，本发明的有益效果在于：采用本发明的提取方法，有效的提高牛血清蛋白的提取率，牛血清蛋白的提取率达到95.6％，纯度达99.6％以上，显著的提高了牛血清蛋白的品质，有效的满足目前市场对牛血清蛋白的需求，有效提升牛血清蛋白的药用价值。其中，先对血液进行血浆和血细胞的分离，减小提取的难度，先通过磺基水杨酸和三氯乙酸按合适浓度配比制成蛋白沉降剂，通过所带的正负电荷之间的结合作用，使得血浆中的蛋白质大部分沉降下来，再通过枸橼酸钠和盐水制成的抗凝剂，形成可溶性螯合物，增大溶液的渗透压，避免纤维蛋白原形成纤维蛋白，避免的血浆的凝固，同时，也破坏了血浆中的纤维蛋白原，为提高牛血清蛋白的纯度提供基础；在对溶液料处理时，其中还含有部分的蛋白质和大量的杂质，因此，将溶液料进行氧化处理，通过调控氧化的是将的温度，以及采用合适的氧化剂，使得血浆中的脂肪酸得到最大限度的氧化分解，提高牛血清蛋白的纯度，再通过特定的金属对酶的特定破坏的情况，采用合适比例的金属，有效的去除血浆中原有的蛋白酶、核酸酶等杂质，进一步提高了牛血清蛋白的纯度。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。实施例1一种提取牛血清蛋白的方法，包括以下步骤：(1)从牛静脉处收集新鲜牛血液，经血液分离机分离成血细胞和血浆，在血浆中加入血浆质量的20％的蛋白沉降剂，分离，得固体蛋白料和溶液料；所述的蛋白沉降剂，是将含量为12％的磺基水杨酸水溶液和含量为10％的三氯乙酸水溶液按0.8∶1.2的质量比混合制得；(2)固体蛋白料处理：将固体蛋白料加水搅拌，得蛋白溶液，加入固体蛋白料质量的12％的抗凝剂，搅拌摇匀，离心，取上清液，加入盐酸调节上清液ph值为4.5，加入上清液质量4％的脱水剂，拌匀，静置，离心取沉淀，烘干得料1；所述的抗凝剂，是将枸橼酸钠和浓度为0.012％的盐水按1∶0.3的质量比混合；所述的脱水剂，是将甘露醇和甘油按0.2∶0.12的质量比混合；(3)溶液料处理：将溶液料、十二烷基硫酸钠、氧化剂按1.2∶0.1∶0.35的质量比混合，得混合料，将混合料加热至34℃，反应时间为2.5h，再加入混合料质量的0.12％的金属剂，离心，取上清液，再加入上清液质量10％的蛋白质析出剂，静置12h，离心取沉淀，烘干得料2；所述的氧化剂，是将浓度为22ml/l的臭氧、硫解酶按1.2∶0.25的质量比混合；所述的金属剂，其中锌离子、铅离子和铁离子的质量比为0.8∶0.1∶0.36；所述的蛋白质析出剂，是将甲醇和乙醇等质量混合，用盐酸调节溶液ph值为4.5，拌匀即可；(4)将料1和料2混合，得混合料，先用乙醇洗涤混合料2～3次，再用乙醚洗涤2～3次，烘干即可。实施例2一种提取牛血清蛋白的方法，包括以下步骤：(1)从牛静脉处收集新鲜牛血液，经血液分离机分离成血细胞和血浆，在血浆中加入血浆质量的30％的蛋白沉降剂，分离，得固体蛋白料和溶液料；所述的蛋白沉降剂，是将含量为18％的磺基水杨酸水溶液和含量为20％的三氯乙酸水溶液按1.2∶1.8的质量比混合制得；(2)固体蛋白料处理：将固体蛋白料加水搅拌，得蛋白溶液，加入固体蛋白料质量的18％的抗凝剂，搅拌摇匀，离心，取上清液，加入盐酸调节上清液ph值为5，加入上清液质量8％的脱水剂，拌匀，静置，离心取沉淀，烘干得料1；所述的抗凝剂，是将枸橼酸钠和浓度为0.18％的盐水按1∶0.6的质量比混合；所述的脱水剂，是将甘露醇和甘油按0.3∶0.18的质量比混合；(3)溶液料处理：将溶液料、聚丙烯酰胺、氧化剂按1.8∶0.2∶0.45的质量比混合，得混合料，将混合料加热至36℃，反应时间为3.5h，再加入混合料质量的0.15％的金属剂，离心，取上清液，再加入上清液质量15％的蛋白质析出剂，静置18h，离心取沉淀，烘干得料2；所述的氧化剂，是将浓度为28ml/l的臭氧、硫解酶按1.6∶0.35的质量比混合；所述的金属剂，其中锌离子、铅离子和铁离子的质量比为1.2∶0.2∶0.48；所述的蛋白质析出剂，是将甲醇和乙醇等质量混合，用盐酸调节溶液ph值为5，拌匀即可；(4)将料1和料2混合，得混合料，先用乙醇洗涤混合料2～3次，再用乙醚洗涤2～3次，烘干即可。实施例3一种提取牛血清蛋白的方法，包括以下步骤：(1)从牛静脉处收集新鲜牛血液，经血液分离机分离成血细胞和血浆，在血浆中加入血浆质量的25％的蛋白沉降剂，分离，得固体蛋白料和溶液料；所述的蛋白沉降剂，是将含量为15％的磺基水杨酸水溶液和含量为15％的三氯乙酸水溶液按1∶1.5的质量比混合制得；(2)固体蛋白料处理：将固体蛋白料加水搅拌，得蛋白溶液，加入固体蛋白料质量的15％的抗凝剂，搅拌摇匀，离心，取上清液，加入盐酸调节上清液ph值为4.8，加入上清液质量6％的脱水剂，拌匀，静置，离心取沉淀，烘干得料1；所述的抗凝剂，是将枸橼酸钠和浓度为0.015％的盐水按1∶0.5的质量比混合；所述的脱水剂，是将甘露醇和甘油按0.25∶0.15的质量比混合；(3)溶液料处理：将溶液料、甲基戊醇、氧化剂按1.5∶0.15∶0.4的质量比混合，得混合料，将混合料加热至35℃，反应时间为3h，再加入混合料质量的0.13％的金属剂，离心，取上清液，再加入上清液质量13％的蛋白质析出剂，静置15h，离心取沉淀，烘干得料2；所述的氧化剂，是将浓度为5ml/l的臭氧、硫解酶按1.4∶0.3的质量比混合；所述的金属剂，其中锌离子、铅离子和铁离子的质量比为1∶0.15∶0.42；所述的蛋白质析出剂，是将甲醇和乙醇等质量混合，用盐酸调节溶液ph值为4.8，拌匀即可；(4)将料1和料2混合，得混合料，先用乙醇洗涤混合料2～3次，再用乙醚洗涤2～3次，烘干即可。实施例4一种提取牛血清蛋白的方法，包括以下步骤：(1)从牛静脉处收集新鲜牛血液，经血液分离机分离成血细胞和血浆，在血浆中加入血浆质量的20％的蛋白沉降剂，分离，得固体蛋白料和溶液料；所述的蛋白沉降剂，是将含量为18％的磺基水杨酸水溶液和含量为20％的三氯乙酸水溶液按1∶1.2的质量比混合制得；(2)固体蛋白料处理：将固体蛋白料加水搅拌，得蛋白溶液，加入固体蛋白料质量的12％的抗凝剂，搅拌摇匀，离心，取上清液，加入盐酸调节上清液ph值为5，加入上清液质量4％的脱水剂，拌匀，静置，离心取沉淀，烘干得料1；所述的抗凝剂，是将枸橼酸钠和浓度为0.18％的盐水按1∶0.3的质量比混合；所述的脱水剂，是将甘露醇和甘油按0.2∶0.15的质量比混合；(3)溶液料处理：将溶液料、聚丙烯酰胺、氧化剂按1.2∶0.1∶0.45的质量比混合，得混合料，将混合料加热至34℃，反应时间为3.5h，再加入混合料质量的0.12％的金属剂，离心，取上清液，再加入上清液质量15％的蛋白质析出剂，静置12h，离心取沉淀，烘干得料2；所述的氧化剂，是将浓度为22ml/l的臭氧、硫解酶按1.6∶0.35的质量比混合；所述的金属剂，其中锌离子、铅离子和铁离子的质量比为1.2∶0.1∶0.4；所述的蛋白质析出剂，是将甲醇和乙醇等质量混合，用盐酸调节溶液ph值为5，拌匀即可；(4)将料1和料2混合，得混合料，先用乙醇洗涤混合料2～3次，再用乙醚洗涤2～3次，烘干即可。实施例5一种提取牛血清蛋白的方法，包括以下步骤：(1)从牛静脉处收集新鲜牛血液，经血液分离机分离成血细胞和血浆，在血浆中加入血浆质量的20％的蛋白沉降剂，分离，得固体蛋白料和溶液料；所述的蛋白沉降剂，是将含量为12％的磺基水杨酸水溶液和含量为20％的三氯乙酸水溶液按1.2∶1.2的质量比混合制得；(2)固体蛋白料处理：将固体蛋白料加水搅拌，得蛋白溶液，加入固体蛋白料质量的18％的抗凝剂，搅拌摇匀，离心，取上清液，加入盐酸调节上清液ph值为5，加入上清液质量4％的脱水剂，拌匀，静置，离心取沉淀，烘干得料1；所述的抗凝剂，是将枸橼酸钠和浓度为0.18％的盐水按1∶0.6的质量比混合；所述的脱水剂，是将甘露醇和甘油按0.3∶0.12的质量比混合；(3)溶液料处理：将溶液料、十二烷基硫酸钠、氧化剂按1.5∶0.2∶0.35的质量比混合，得混合料，将混合料加热至34℃，反应时间为3.5h，再加入混合料质量的0.12％的金属剂，离心，取上清液，再加入上清液质量15％的蛋白质析出剂，静置12h，离心取沉淀，烘干得料2；所述的氧化剂，是将浓度为22ml/l的臭氧、硫解酶按1.2∶0.35的质量比混合；所述的金属剂，其中锌离子、铅离子和铁离子的质量比为1.2∶0.1∶0.48；所述的蛋白质析出剂，是将甲醇和乙醇等质量混合，用盐酸调节溶液ph值为4.5，拌匀即可；(4)将料1和料2混合，得混合料，先用乙醇洗涤混合料2～3次，再用乙醚洗涤2～3次，烘干即可。实验例分别对本发明对牛血清蛋白的提取率以及纯度进行统计，以传统对牛血清蛋白的提取方法作为对照，结果如表1所示：表1项目本发明方法传统方法平均提取率％95.693.2纯度％99.699.3当前第1页12