本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种胰岛分离纯化装置，具体地说本发明可以节省胰岛获得的时间，保证较高的胰岛活性率，且提高胰岛纯度，且节约成本。
背景技术：
糖尿病已成为危险人类健康的第三大杀手，糖尿病体质的患者是细菌生长的“沃土”，同时也伴随着白细胞吞噬功能的下降，从而更易倒置炎症和自身免疫疾病，包括呼吸道感染、皮肤感染、视网膜病变等。胰岛作为胰腺分泌胰岛素的唯一组成部分，是许多大小不等的和形状不定的胰岛细胞团，散在分布于胰腺的不同部位，可控制糖的代谢，维持体内血糖稳定在一个正常波动水平。在现今，治疗糖尿病(尤其是1型糖尿病)最理想的方法是胰岛移植(世界华人消化杂志2012年11月28日；20(33)：3186-3190)。现在主流的从供体获得胰岛的机械分离法，持续用机械力和消化液的流动来冲击胰腺达到消化的目的，比如专利(专利号：201210563477.1)、(专利号：200980156514.3)、(专利号：201210222446.X)、(专利号：200510040622.8)、(专利号：200580043739.X)以及(专利号：201410196765.7)。然而，这些方法分离胰岛，存在胰岛容易破碎，过滤时胰岛混合液容易丢失，消化分离所用时间较长影响胰岛活性，胰岛纯度不高，设备不易购买或者昂贵，人力物力耗费较多等缺点。本发明通过创新改进现有分离纯化装置，试图克服上述缺点。
技术实现要素：
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
1.一种胰岛分离纯化装置，其特征在于，该装置包括多节两端开口的离心管身，离心管帽，不同网孔尺寸的多层滤网，用于胰岛消化、分离纯化及收集。
2.根据权利要求1所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述离心管身两端均有螺纹开口，能实现与对应离心管帽或另一节离心管身的端端组装吻合。
3.根据权利要求1所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述离心管壁上有刻度值，用于计算管内液体量。
4.根据权利要求1所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述离心管外壁上有磨砂表面，用于作标记之用。
5.根据权利要求1所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述离心管身含有一节或多节短管身，用于增加管内空间和增加滤过次数。
6.据权利要求5所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述短管身中部横截面处可镶嵌有筛网。
7.根据权利要求1和权利要求6所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述滤网网孔尺寸为3-1000um。
8.根据权利要求1和权利要求5、6、7所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述含滤网的短管身可有不同组合方式组装，以实现不同胰岛尺寸的消化分离目的。
9.根据权利要求1所述的胰岛分离纯化装置，其特征在于，所述离心管(包括离心管身和管帽)和滤网由生物材料(含有PP材料、聚四氟乙烯、新型纳米或金属材料)制成。
有益效果
本发明涉及的胰岛分离方法，具有以下有益效果：
(1)本发明涉及的胰岛分离纯化装置，利用胰腺消化液中不同组织细胞的尺寸差异(单个细胞5-30um，胰岛70-220um，支持组织块＞600um)，通过多层差异性网孔尺寸网筛过滤消化液的装置，可以一次性获得较高纯度胰岛细胞，减少胰岛耗损，提高胰岛活性和移植成功率。
(2)本发明所涉及的胰岛分离纯化装置，利用胰腺消化液中不同组织细胞的尺寸差异，于同一只离心管内即可实现二次甚至多次消化，使胰腺消化比较完全，提高了胰岛得率，且节省消化酶的用量和消化时间。
(3)本发明所涉及的胰岛分离纯化装置，所需设备简单，不需要额外复杂昂贵的设备，且一次实验只需两只离心管即可完成实验，极大程度上节约了成本，且本发明装置可以由实验员在常规实验室利用普通材料(离心管、滤网、刀片等)自己制作完成，降低生产成本，特别适合中小型实验室研究员使用，亦可实现工业化批量生产。
(4)本发明所涉及的胰岛分离纯化装置，操作简单，不需要复杂的步骤，在常规实验室环境下即可进行，且消化过程人为干预少，减少细胞污染的可能性，且节省人力，节省时间，提高实验效率和成功率。
附图说明
图1本发明装置示意图：1离心管帽；2管外壁磨砂面；3胰腺组织；4粗孔筛；5、8结合处(可拆卸)；6胰岛；7细孔筛；9单细胞混悬液；A上管节；B中管节；C下管节。
具体实施方式
以下将结合实例对本发明做进一步的说明。
一种高效分离纯化小鼠胰岛方法的具体操作步骤：
分离液的配制：Hanks液500mL加入羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，配制成10mmol/L，0.22um孔径滤膜过滤除菌，调节pH值至7.2-7.4，4℃保存。
消化液的配制：临用之前新鲜配制，以Hanks液溶解胶原酶V，其最终质量浓度为1mg/mL；补充氯化钙，使钙离子最终摩尔浓度为10mmol/L；添加DNA裂解酶，其最终质量浓度为0.01mg/mL。0.22um孔径滤膜过滤除菌。
Ficoll 400配置：
(1)Ficoll 100g+Hank’s 200ml，完全溶解后加Hank’s至400ml即为25％Ficoll溶液。
(2)25％Ficoll 92ml+Hanks8ml即为23％Ficoll溶液。
(3)25％Ficoll80ml+Hanks20ml即为20％Ficoll溶液。
(4)25％Ficoll44ml+Hanks56ml即为11％Ficoll溶液。
双硫腙(DTZ)染料：取DTZ粉末10mg溶于3ml无水乙醇，加入50ul浓氨水，再加Hanks液12ml，4°储存备用。临用前用Hanks液按1∶100稀释，0.22um孔径滤膜过滤除菌。
本发明装置方法组：
(1)胰腺的获取：选取实验小鼠BALB/C，麻醉之(按10％水合氯醛(0.05ml/10g)*体重)，腹部消毒(75％乙醇)，开腹；找到十二指肠壶腹部，用丝线贴近十二指肠结扎壶腹部；沿胆囊管找到胆总管，靠近肝门处向胰头方向用5号头皮针进针，结扎固定针头；剪破心脏放血；沿头皮针缓慢注入4度预冷胶原酶V(1g/L)2mL，使胰腺充分膨胀，立即剪除胃与横结肠之间的大网膜及脾脏，沿十二指肠边缘自十二指肠向小肠方向剥离胰腺组织.剩余部分沿胰腺边缘完整取出，置 于本发明所述离心管中(15ml，上层滤网孔径600um，下层滤网孔径60um)。
(2)胰腺的消化：向步骤(1)所述离心管内加入胶原酶V(1g/L)6mL，覆盖所述胰腺，置于恒温水浴锅(37度)消化(约15min)。当胰腺呈现融化现象，震荡消化液变浑浊，出现乳糜样时，倒置离心管，使消化液与胰岛组织分离，终止消化。
(3)胰岛的纯化、离心：取出步骤(2)中包含下层滤网的离心管节，并倒置于另一离心管(含60um网孔)管口，用Hank’s液冲洗网上残留组织团，从离心管两端滤网反复冲洗数次，动作需轻柔。残留于滤网上沉淀物即为纯化后的完整胰岛，用RMPI-1640培养基(含10％NBS)2ml重悬，混匀，于37度细胞培养箱静置、备用。
(4)二次消化：对于残留于600um滤网上的未消化完全的胰腺组织块，重复上述步骤，利用上次未耗尽的胶原酶或重新加入胶原酶V(1g/L)2mL，继续消化未消化完成胰腺，并分离、收集胰岛细胞。
对照组为(传统方法组)：
(1)胰腺的获取：选取实验小鼠BALB/C，麻醉之(按10％水合氯醛(0.05ml/10g)*体重)，腹部消毒(75％乙醇)，开腹；找到十二指肠壶腹部，用丝线贴近十二指肠结扎壶腹部；沿胆囊管找到胆总管，靠近肝门处向胰头方向用5号头皮针进针，结扎固定针头；剪破心脏放血；沿头皮针缓慢注入4度预冷胶原酶V(1g/L)2mL，使胰腺充分膨胀，立即剪除胃与横结肠之间的大网膜及脾脏，沿十二指肠边缘自十二指肠向小肠方向剥离胰腺组织.剩余部分沿胰腺边缘完整取出，置于本发明所述离心管中(15ml，上层滤网孔径600um，下层滤网孔径60um)。。
(2)胰腺的消化：将所得胰腺置入常规离心管中(15ml)，向管内加入胶原酶V(1g/L)6mL，覆盖所述胰腺，置于恒温水浴锅(37度)消化(约15min)。当 胰腺呈现融化现象，震荡消化液变浑浊，出现乳糜样时，立即加入4℃含10％新生牛血清(NBS)的Hanks液10mL，终止消化。
(3)胰岛纯化、离心：用600um滤网，剪成圆形置于另一只离心管口，过滤(2)中所得混合液，滤液离心洗涤(1000rpm/mim*3min，Hank’s液)两次，沉淀物加25％Ficoll 4ml混匀，其上依次分别加入23％、20％、11％Ficoll液和Hank’s液各2ml，3000rmp/min*20min、4度离心，吸出23％-20％及20％-11％界面的胰岛，用Hank’s液于50ml离心管内洗涤两次备用。
(4)二次消化：对于(3)中滤网上大块胰腺组织，可以用离心管收集，重复上述消化、分离纯化步骤。
胰岛活性鉴定：
用台盼蓝染色法，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。加注0.1ml0.4％台盼蓝液(4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加dd水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用hanks液稀释至0.4％。)至离心管中，同时加入0.9ml细胞悬液(细胞悬液/胎盘蓝液9∶1，终浓度0.04％)，充分混匀，注入血球计数板的计数池中，光镜下分别计数各个方格中染成蓝色的和未被染色的细胞团数量，重复取样3次，求平均值，即得出0.1mm3内的平均死细胞及活细胞数。活率＝活细胞数/细胞总数。
胰岛纯度测定
DTZ染色法：胰岛内仅胰岛b细胞可以被染成猩红色，其他胰腺细胞不着色。取0.5ml细胞悬液，加入DTZ工作液0.5ml，充分混匀，静置10min，肉眼观察培养皿中出现细小红色颗粒，表明染色完成，小心加入计数板的计数池中，光镜下计数各方格内直径约150um的阳性细胞团数。按公式计算胰岛当量IEQ：计算每一格的当量值，重复3次取样求平均值，即得出0.1mm3内的平均当量值。 当量值IEQ＝平均每一方格的IEQ值*105*所取样本的原始细胞悬液量(ml)。纯度＝阳性细胞/全部细胞。
胰岛功能检测
葡萄糖刺激下胰岛素分泌实验计数50IEQ胰岛，分别用葡萄糖浓度为1.7mmol/L和16.7mmol/L的Hanks液孵育1h，收集第1h和第2h的培养液，放射免疫法检测血清胰岛素水平，计算胰岛素释放指数(SI)：SI＝第2h(高糖环境)的胰岛素含量/第1h(低糖环境)的胰岛素含量。
表1本发明装置及方法获得胰岛效果与传统方法对比如下图(实验数据为3次实验取平均值)：
注：以上数据为本实验室及本发明人所测得结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构想的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应该以所附权利要求 书为准。