制备生理活性多肽缀合物的方法与流程

本发明涉及制备生理活性多肽缀合物的方法，其中，生理活性多肽和非肽基聚合物经由共价键彼此连接。所述方法通过改善所述非肽基聚合物与所述生理活性多肽的反应来改善生理活性多肽缀合物的总产率；并且特别地，所述方法通过经选择性沉淀进行两步反应以高产率制备生理活性多肽缀合物。
背景技术：
：肽由于它们的低稳定性倾向于容易变性，并通过体内蛋白水解酶降解，因此丢失活性。肽具有相对小的尺寸，并且由此容易地通过肾。因此，为了保持包括肽作为药学活性成分的药物的血液水平和效力，必需要向患者频繁施用肽药物。然而，肽药物通常以可注射制剂的形式施用，并且为保持生理活性肽的血液水平的这种频繁的施用导致患者的严重疼痛。已经进行许多尝试来解决这些问题，包括通过藉由增加肽药物的生物膜渗透性进行口服或鼻吸入将肽药物递送至体内；修饰对蛋白酶敏感的特定氨基酸序列以稳定肽并防止被蛋白酶降解(例如，修饰glp-l氨基酸序列以防止因为二肽基肽酶失去效力等)；将具有高可溶性的聚合物材料如聚乙二醇(peg)化学添加至肽的表面；和使用重组融合技术制备生理活性多肽和人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(fc)的融合蛋白。然而，融合蛋白的制备的问题在于，聚合物与生理活性肽的非特异性结合阻断肽的活性结构域，从而减少肽的活性，并且因此防止非特异性结合的位点特异性结合减少制剂产率或需要对生理活性肽的人工操作。为了解决没有效率地制备生理活性多肽和非肽基聚合物的缀合物的问题，已经尝试使用非肽基聚合物修饰生理活性多肽缀合物中的生理活性多肽的特定部位(韩国专利no.10-1164453)。此外，在通过使用具有两个官能团的非肽基聚合物制备生理活性多肽和人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(fc)的融合蛋白时，已经尝试了许多方法来增加制剂产率。本发明的发明人已经继续了他们的研究，并且他们已经发现，在非肽基聚合物和生理活性多肽之间的第一次缀合反应后，通过选择性沉淀来分离未反应的(未缀合的)生理活性多肽，然后使其经过第二次反应以高产率和高纯度产生非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物，并且使用该缀合物以高产率和高纯度产生生理活性多肽-生理活性载体缀合物，由此完成本发明。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供制备生理活性多肽缀合物的方法，该方法包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。本发明的另一个目的是提供制备生理活性多肽和生理活性载体的缀合物的方法，所述方法包括经由共价键缀合，如上所述制备的生理活性多肽缀合物与生理活性载体以制备多肽-载体缀合物，其中，在所述多肽-载体缀合物中，使所述非肽基聚合物的两端分别缀合至所述生理活性载体和生理活性多肽。问题的解决方案为了实现上述目的，本发明的一方面提供了制备生理活性多肽缀合物的方法，所述方法包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。本发明的具体实施方式提供了制备方法，其中，溶解沉淀的生理活性多肽，然后使其缀合至所述非肽基聚合物。本发明的另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，基于所述混合物的总重，所述步骤1)中的反应混合物包括10重量％或更多的所述非肽基聚合物没有结合的生理活性多肽。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述步骤1)中的选择性沉淀使用有机溶剂进行。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述有机溶剂为异丙醇。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述步骤1)中的反应混合物使用反应混合物的体积的2体积或更多的异丙醇处理。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述步骤1)中的反应混合物使用反应混合物的体积的3至7体积的异丙醇处理。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，在步骤2)中，所述回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应0.5小时至4.0小时。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性多肽选自下组：胰岛素分泌肽、凝血因子、消化促进激素、胰岛素、胃泌酸调节素、胰高血糖素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素、肠激素、细胞因子、酶、生长因子、神经肽、垂体激素、下丘脑激素、抗肥胖肽、抗病毒肽和具有生理活性的非天然肽衍生物。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性多肽选自下组：促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、胰淀素(amylin)、生长抑素、肽yy(pyy)、神经肽y(npy)、血管紧缩素、缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素、章鱼素(eledoisin)、胃泌素、瘦素、催产素、加压素、黄体化激素(luteinizinghormone)、促黄体激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、分泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、人生长激素(hgh)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激因子(gcsf)、干扰素(ifn)、白细胞介素、催乳素释放肽、阿立新(orexin)、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃泌素释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房钠尿肽(anp)、脑利钠肽(bnp)、c型利钠肽(cnp)、神经激肽a、神经介肽、肾素、内皮缩血管肽、角蝰毒素肽、酪啡肽(carsomorphinpeptide)、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、t细胞因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制剂、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺肽(thymulin)、胸腺五肽、胸腺素(tymosin)、胸腺体液因子、肾上腺髓质素、咽侧体抑制素、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、铃蟾肽、骨钙素、cart肽、e-选择素、icam-1、vcam-1、leucokine、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰抑素和恩夫韦肽(fuzeon)。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性多肽是毒蜥外泌肽(exendin)、胰岛素、毒蜥外泌肽衍生物、胰岛素衍生物或它们的组合。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述毒蜥外泌肽衍生物选自下组：脱氨基-组氨酰基(da)-毒蜥外泌肽-4、β-羟基-咪唑并-丙酰基(hy)-毒蜥外泌肽-4、咪唑并-乙酰基(ca)-毒蜥外泌肽-4和二甲基-组氨酰基(dm)-毒蜥外泌肽-4。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，使所述非肽基聚合物缀合至毒蜥外泌肽或其衍生物的lys27，所述毒蜥外泌肽是生理活性肽。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，使所述非肽基聚合物缀合至胰岛素或胰岛素类似物β链(其为生理活性多肽)或它们的衍生物的n末端。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述非肽基聚合物选自下组：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及它们的组合。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述非肽基聚合物为聚乙二醇。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述非肽基聚合物包含选自下组的至少一个反应基团：醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述非肽基聚合物具有醛基作为反应基团。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述醛基是丙醛基。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述非肽基聚合物具有500da至100,000da的分子量。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其进一步包括在步骤2)之后分离所述生理活性多肽缀合物。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述分离使用离子交换色谱进行。本发明的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述离子交换色谱为高压离子交换色谱。本发明的另外的方面提供了制备生理活性多肽和生理活性载体的缀合物(生理活性多肽-生理活性载体，多肽-载体缀合物)的方法。该方法包括通过共价键缀合生理活性载体与如上所述制备的生理活性多肽缀合物，由此制备缀合物(生理活性多肽-生理活性载体，多肽-载体缀合物)，其中，使所述非肽基聚合物的两端分别缀合至所述生理活性载体和所述生理活性多肽。本发明的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性载体选自下组：白蛋白、免疫球蛋白fc区、转铁蛋白、适体、毒素、明胶、胶原、葡聚糖、多糖、脂肪酸和纤维蛋白原。本发明的另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性载体为免疫球蛋白fc区。发明的有益效果本发明的制备方法用来通过经选择性沉淀的两步反应以高产率产生非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物和生理活性多肽-生理活性载体缀合物，并且因此，所述方法可用于开发保持相对高水平的体内活性且具有显著增加的血液半衰期的多种肽药物的长效制剂。附图说明图1是已知的聚乙二醇化和应用选择性沉淀的改善的聚乙二醇化的示意图；图2是通过使用sources柱纯化聚乙二醇化产物获得的位置异构体的纯化概况，其中，通过将15mg/ml的浓度的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4聚乙二醇化3小时来制备聚乙二醇化产物；图3是通过使用sp-hp柱纯化聚乙二醇化产物获得的位置异构体的纯化概况，其中，通过将5mg/ml的浓度的胰岛素类似物聚乙二醇化2小时来制备聚乙二醇化产物；图4显示含有水溶液和通过使用用于选择性沉淀的异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮和乙腈处理聚乙二醇化产物获得的沉淀物的混合物的sds-page分析的结果，其中，通过将15mg/ml的浓度的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4聚乙二醇化3小时来制备聚乙二醇化产物；图5显示含有水溶液和通过使用用于选择性沉淀的异丙醇、乙醇、1-丙醇、丙酮和乙腈处理聚乙二醇化产物获得的沉淀物的混合物的sds-page分析的结果，其中，通过将5mg/ml的浓度的胰岛素类似物聚乙二醇化2小时来制备聚乙二醇化产物；图6是通过使用sources(lrc,15x161mm,28ml,pall)柱纯化水溶液获得的位置异构体的纯化概况，其中，在使用异丙醇处理聚乙二醇化产物后通过除去沉淀物获得水溶液，并且通过将15mg/ml的浓度的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4聚乙二醇化3小时获得聚乙二醇化产物；图7是通过使用sources柱纯化沉淀物聚乙二醇化产物获得的位置异构体的纯化概况，其中，通过使用异丙醇处理聚乙二醇化产物来制备沉淀物，并且通过将15mg/ml的浓度的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4聚乙二醇化3小时获得聚乙二醇化产物；图8是通过使用sources柱纯化聚乙二醇化产物和聚乙二醇化沉淀物的产物获得的位置异构体的纯化概况，其中，通过选择性沉淀来制备沉淀物；图9是在使用异丙醇处理聚乙二醇化产物之后，从通过除去沉淀物可以获得的水溶液使用sp-hp(hitrap,每个5mlx4,20ml,gehealthcare)柱获得的位置异构体的纯化概况，其中通过将5mg/ml的浓度的胰岛素类似物聚乙二醇化2小时获得聚乙二醇化产物；图10是通过使用sp-hp柱纯化沉淀物聚乙二醇化产物获得的位置异构体的纯化概况，其中，通过使用异丙醇处理聚乙二醇化产物来制备沉淀物，并且通过将5mg/ml的浓度的胰岛素类似物聚乙二醇化2小时获得聚乙二醇化产物；图11是显示应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法的改善的产率的图，其表示为已知的聚乙二醇化方法的百分比；图12是使用反相柱分析实施例1的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg(ca-毒蜥外泌肽-4-peg)缀合物的纯度的结果；图13是使用反相柱分析实施例7的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg缀合物的纯度的结果；图14是通过肽图谱分析实施例1的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的lys27-聚乙二醇化的位置异构体的分析概况；图15是通过肽图谱分析实施例7的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的lys27-聚乙二醇化的位置异构体的分析概况；图16是使用反相柱分析实施例1的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg-免疫球蛋白fc缀合物的纯度的结果；图17是使用反相柱分析实施例7的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg-免疫球蛋白fc缀合物的纯度的结果；图18是显示比较通过应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法与通过已知的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg-免疫球蛋白fc(免疫球蛋白fc-ca-毒蜥外泌肽-4-peg(lys27))缀合物之间的产率的图；图19显示在应用选择性沉淀(异丙醇处理)之前，用于检查状态的肽图谱的结果；图20显示在应用选择性沉淀(异丙醇处理)之后，用于检查状态的肽图谱的结果；图21显示在应用选择性沉淀(异丙醇处理)(ipa:异丙醇)之前和之后，咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的一级结构序列的变化；图22显示在应用选择性沉淀(异丙醇处理)(ipa:异丙醇)之前和之后，咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的二级结构的变化；和图23显示通过camp实验测量咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4在应用选择性沉淀(异丙醇处理)(ipa:异丙醇)之前和之后的体内活性的结果。具体实施方式本发明的一方面提供了制备生理活性多肽缀合物的方法，所述方法包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。如本文所使用的术语“生理活性多肽缀合物”指一种物质，其中生理活性多肽共价连接至非肽基聚合物的一端。在本发明中，生理活性多肽缀合物与非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物可互换使用。本发明的步骤1)的特征在于从(第一)缀合反应混合物选择性地沉淀非肽基聚合物没有结合的生理活性多肽。该(第一)缀合反应优选选择性地，和更优选位点特异性地使非肽基聚合物缀合至生理活性多肽。在本发明中，“非肽基聚合物没有结合的生理活性多肽”与“未反应的生理活性多肽”或“未缀合的生理活性多肽”可互换使用。如本文所使用的术语“位点特异性”意指使非肽基聚合物特异性键合至所希望的氨基酸位置，特别地，键合至生理活性多肽的氨基酸位置中的n末端残基或赖氨酸残基的胺。当非肽基聚合物是位点特异性连接时，可防止要制备的生理活性最大化的长效制剂的生理活性的减小，所述生理活性的减小归因于存在其他不太希望的缀合物，例如其中非肽基聚合物键合至对生理活性重要的氨基酸残基的那些。例如，在毒蜥外泌肽-4的情况下，当使非肽基聚合物键合至生理活性多肽的n末端时，体外活性减少。相反，当使非肽基聚合物键合至其赖氨酸残基时，保持了体外活性。具体而言，在毒蜥外泌肽-4的12和17位的赖氨酸之中，当使非肽基聚合物键合至27位的赖氨酸残基时，所得缀合物显示较高体外活性。因此，在本发明的实施方式中，其中生理活性多肽是毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽衍生物，可使非肽基聚合物位点特异性键合至12或27位的赖氨酸，具体而言，毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽衍生物的27位的赖氨酸，但是本发明不限于此。毒蜥外泌肽的聚乙二醇化方法在韩国专利公开no.10-2010-0105494(其通过提述并入本文)中详细描述。如本文所使用的术语“选择性沉淀”意指由非肽基聚合物和生理活性多肽的混合物的缀合反应产生的非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物保留在水溶液中，但是选择性沉淀未反应的生理活性多肽。在本发明中，选择性沉淀可为任何方法而没有限制，只要它能够沉淀反应混合物中未反应的生理活性多肽。为了说明的目的，多肽的广泛已知的沉淀方法的一些实例如下：1.盐析，2.等离子沉淀，3.双碳(c2)有机共溶剂沉淀，4.c4和c5，有机共溶剂沉淀，相分配法，和多肽的提取，5.多肽排除和群集剂(crowdingagent)(中性聚合物)和渗透剂，6.合成和半合成聚合电解质沉淀，7.金属和多酚杂多阴离子沉淀，8.疏水离子配对(hip)缠结配体，9.矩阵叠加配体共沉淀，10.二价和三价金属阳离子沉淀。选择性沉淀可使用每个列出的方法或它们的适当组合。具体地，可通过添加有机溶剂至反应混合物来选择性地沉淀未反应的生理活性多肽，但不限于此。此外，有机溶剂具体可为醇、酮、腈或它们的组合，并且更具体地为乙醇、异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈或它们的组合，但不限于此。此外，反应混合物可使用反应混合物的体积的2体积或更多，具体为2至7体积，更具体为3至7、4至7或5至7体积，并且更加具体为3至7体积的有机溶剂处理用于选择性沉淀未反应的生理活性多肽，但不限于此。在本发明中，基于反应混合物的总重，用于选择性沉淀的反应混合物可包括10重量％或更多，具体为20重量％或更多的未反应的或未缀合的生理活性多肽，但不限于此。如本文所使用的术语“生理活性肽”指一种物质，其意图在人体中表现生理活性。在本发明中，生理活性肽可为任何肽，其能够表现生理活性。例如，生理活性肽可选自下组：胰岛素分泌肽、凝血因子、消化促进激素、胰高血糖素、胰岛素、胃泌酸调节素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素、肠激素、细胞因子、酶、生长因子、神经肽、垂体激素、下丘脑激素、抗肥胖肽、抗病毒肽和具有生理活性的非天然肽衍生物，但不限于此。此外，生理活性肽可选自下组：促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、胰淀素、生长抑素、肽yy(pyy)、神经肽y(npy)、血管紧缩素、缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素、章鱼素、胃泌素、瘦素、催产素、加压素、黄体化激素、促黄体激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、分泌素、舍莫瑞林、人生长激素(hgh)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激因子(gcsf)、干扰素(ifn)、白细胞介素、催乳素释放肽、阿立新、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃泌素释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房钠尿肽(anp)、脑利钠肽(bnp)、c型利钠肽(cnp)、神经激肽a、神经介肽、肾素、内皮缩血管肽、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、t细胞因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制剂、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺肽、胸腺五肽、胸腺素、胸腺体液因子、肾上腺髓质素、咽侧体抑制素、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、铃蟾肽、骨钙素、cart肽、e-选择素、icam-1、vcam-1、leucokine、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰抑素和恩夫韦肽，但不限于此。生理活性多肽还可包括多肽的前体、衍生物、片段和变体，其具有多肽的生理活性。此外，生理活性多肽具体可为毒蜥外泌肽、glp-1、胰岛素、胃泌酸调节素、胰高血糖素和它们的衍生物，或降钙素，但不限于此。在本发明中，可例如通过化学取代(例如，α-甲基化或α-羟基化)、删除(例如，脱氨基)或修饰(例如，n-甲基化)氨基酸残基上的任何基团或它们的组合来制备毒蜥外泌肽衍生物，并且在韩国专利公开no.10-2009-0008151中详细描述了毒蜥外泌肽衍生物。此外，毒蜥外泌肽衍生物具体可选自下组：脱氨基-组氨酰基(da)-毒蜥外泌肽-4、β-羟基-咪唑并-丙酰基(hy)-毒蜥外泌肽-4、咪唑并-乙酰基(ca)-毒蜥外泌肽-4和二甲基-组氨酰基(dm)-毒蜥外泌肽-4，但不限于此。如本文所使用的术语“非肽基聚合物”指生物相容性聚合物，其包括通过不包括肽键的共价键彼此连接的一个或多个重复单元。可用于本发明的非肽基聚合物可选自下组：聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯乙醚，生物可降解聚合物如pla(聚(乳酸))、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)和plga(聚乳酸-乙醇酸)，脂质聚合物，壳多糖，透明质酸及它们的组合，并且具体为，聚乙二醇，但不限于此。并且，在本领域中公知的并且在本领域的技术内容易制备的其衍生物被包括在本发明的范围内。可使用任何非肽基聚合物而没有限制，只要它是对体内蛋白水解酶具有抗性的聚合物，并且因此不容易通过蛋白水解酶剪切以允许生理活性多肽表现有效活性。非肽基聚合物具有0.5kda至100kda，并且具体为0.5kda至20kda的范围内的分子量。并且，与生理活性多肽连接的本发明的非肽基聚合物可为一个聚合物或不同类型的聚合物的组合。此外，用于本发明的非肽基聚合物在其一端或在其两端可具有反应基团。在其两端具有反应基团的非肽基聚合物可结合至生理活性载体和协助作为长效制剂起作用的蛋白药物。具体地，非肽基聚合物在两端具有反应基团，其选自下组：醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物，更具体为醛基，并且更加具体为丙醛基，但不限于此。琥珀酰亚胺衍生物可为丙酸琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基或琥珀酰亚胺基碳酸酯。特别地，当非肽基聚合物在两端具有反应性醛基时，以最小非特异性反应在两端与生理活性多肽和生理活性载体连接是有效的。当通过酰胺键连接时，通过藉由醛键的还原烷基化生成的最终产物稳定得多。醛反应基团在低ph例如在2.0至7.0的ph，具体地在3.0至6.0的ph，并且更具体地在4.0至6.0的ph选择性地结合氨基n末端。并且，醛基反应基团可在高ph，例如在6.5至9.0的ph，具体地在6.5至8.0的ph，并且更具体地在6.5至7.5的ph结合至赖氨酸残基以形成共价键。在本发明中，在非肽基聚合物的两端的反应基团可彼此相同或不同。当在其两端具有反应性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，羟基可通过已知的化学反应活化为多种反应基团，或可使用可商购的具有经修饰的反应基团的聚乙二醇。在本发明的具体实施例中，非肽基聚合物是具有醛末端基团的聚乙二醇，并且步骤1)中的缀合反应是位点特异性聚乙二醇化。该位点特异性聚乙二醇化可通过本领域已知的方法例如还原性胺化氨基如赖氨酸的ε-氨基或生理活性多肽的n末端来进行。如本文所使用的术语“生理活性多肽缀合物”指一种物质，其中生理活性多肽共价地连接至非肽基聚合物的一端。在本发明中，生理活性多肽缀合物与非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物可互换使用。此外，在本发明的生理活性多肽和非肽基聚合物的反应中，反应摩尔比没有限制，只要生理活性多肽和非肽基聚合物形成共价键，并且生理活性多肽：非肽基聚合物的反应摩尔比可适当地在1:1至1:30的范围内。此外，在本发明的生理活性多肽和非肽基聚合物的反应中，反应时间没有限制，只要生理活性多肽和非肽基聚合物形成共价键，并且反应时间具体可为0.5小时至4.0小时，并且更具体为0.5至2.0小时，但不限于此。此外，在本发明的生理活性多肽和非肽基聚合物的反应中，反应温度没有限制，只要生理活性多肽和非肽基聚合物形成共价键，并且反应温度具体可为0℃至14℃或15℃至30℃，并且更具体为4℃至8℃或20℃至25℃，但不限于此。此外，在本发明的生理活性多肽和非肽基聚合物的反应中。生理活性多肽的浓度没有限制，只要生理活性多肽和非肽基聚合物形成共价键，并且浓度具体可为1mg/ml至25mg/ml，并且更具体为5mg/ml至18mg/ml，但不限于此。在实施方式中，本发明提供了制备生理活性多肽缀合物的方法，其中，使经修饰的毒蜥外泌肽-4连接至聚乙二醇(peg)。在本发明的更具体的实施方式中，该经修饰的毒蜥外泌肽-4是咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(ca-毒蜥外泌肽-4)，并且可在4℃至8℃和20℃至25℃，在含有20mm氰基硼氢化钠(scb,nacnbh3)作为还原剂的6.5至7.5的ph的100mmhepes缓冲溶液中，以约1:7.5的肽和peg的摩尔比和约5mg/ml至18mg/ml的肽浓度，使用在两端均具有醛官能度的3.4kda聚乙二醇(例如，3.4kald(2)peg)，在其lys位置使其聚乙二醇化0.5小时至4.0小时。具体地，可在4℃至8℃使15mg/ml的肽反应3小时，然后可在ph2.0在柠檬酸缓冲溶液中用线性浓度梯度的kcl使用source15s柱从每个反应混合物分离咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg。例如，本发明的发明人能够证实，该反应混合物包括约10％至40％的(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)，40％至50％的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg，和约20％至50％的未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(表1和2)。在另外的实施方式中，本发明提供了制备生理活性多肽缀合物的方法，其中使胰岛素类似物连接至聚乙二醇(peg)。可在4℃至8℃和20℃至25℃，在含有3～5mmscb(nacnbh3)作为还原剂的4.0至6.0的ph的50mm柠檬酸钠缓冲溶液中，以约1:4的肽和peg的摩尔比和约5mg/ml至18mg/ml的肽浓度，使用3.4kald(2)peg，在其β链的n末端使胰岛素类似物聚乙二醇化0.5小时至4.0小时。具体地，可在4℃至8℃使5mg/ml的肽反应2小时，然后可在ph3.0在柠檬酸缓冲溶液中用线性浓度梯度的kcl使用sp-hp柱从每个反应混合物分离胰岛素类似物。例如，本发明的发明人能够证实，该反应混合物包括约10％至20％的(peg)n-胰岛素类似物，50％至60％的胰岛素类似物-peg，和约5％至20％的未反应的胰岛素类似物。在本发明的更具体的实施方式中，用于上述ca-毒蜥外泌肽-4或胰岛素类似物的聚乙二醇化的缀合物的反应混合物与2或更多体积的异丙醇，具体为3至7体积(相对于反应混合物的体积)反应。然后将该异丙醇处理的反应混合物分成包含聚乙二醇化的缀合物(咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4或胰岛素类似物)的水溶液和未缀合的生理活性多肽的沉淀，即未聚乙二醇化的、未反应的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4或未反应的胰岛素类似物(图4和5)。例如，水溶液是经过纯化的(图6和9)，并且因此，本发明的发明人能够证实该水溶液包括约10％至40％的(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)，约40％至50％的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg，和约5％至15％的未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4。在胰岛素类似物的情况下，水溶液包括约10％至20％的(peg)n-胰岛素类似物，50％至60％的胰岛素类似物-peg，和约5％至20％的未反应的胰岛素类似物。分离的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀的含量为15％至30％(表3)。在本发明的具体实施方式中，在使用异丙醇处理之前和之后，均观察到咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的变化。作为结果，在使用异丙醇处理之前和之后在所有方面均没有变化(图19和20)，并且在一级结构(图21)、二级结构的含量(图22和表7)，和活性(图23和表8)中没有变化。这些结果指示通过使用异丙醇处理的选择性沉淀没有对生理活性多肽咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4造成不利影响。在本发明中，咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg与咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg(lys27)、咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(lys27)-peg、ca-毒蜥外泌肽-4-peg和ca-毒蜥外泌肽-4-peg(lys27)可互换使用。本发明的步骤2)的特征在于第二反应混合物使用从步骤1)的沉淀回收的生理活性多肽缀合生理活性多肽和非肽基聚合物以制备非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物。具体地，可溶解沉淀的生理活性多肽，然后优选选择性地，更优选位点特异性地缀合至非肽基聚合物，但不局限于此。通过将选择性沉淀应用于第二反应混合物来制备水溶液，并且第一反应混合物包括制备的非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物。在本发明中，沉淀的生理活性多肽和非肽基聚合物的反应条件没有限制，只要它们能够形成共价形式，并且具体地，反应可在步骤1)的反应条件下进行。特别地，沉淀的生理活性多肽和非肽基聚合物的反应时间具体可为0.5小时至4.0小时，并且更具体为0.5小时至2.0小时，但不限于此。在本发明的具体实施方式中，使在实施例3中通过藉由用异丙醇处理的选择性沉淀分离的约20％至30％的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀再循环以进行聚乙二醇化。因此，当纯化未聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀的再聚乙二醇化溶液时，在反应溶液中包括约15％至40％的(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)，40％至50％的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg，和约10％至40％的未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(图7)。本发明的制备方法可进一步包括在步骤2)之后分离生理活性多肽缀合物。该程序可使用多种分离方法如本领域已知的色谱法进行。具体地，可使用离子交换色谱，并且更具体为，高压离子交换色谱，但不限于此。在本发明中，生理活性多肽缀合物可从第一反应混合物分离，通过将选择性沉淀应用于第一反应混合物、第二反应混合物或它们的组合来制备水溶液。特别地，当从通过将选择性沉淀应用于第一反应混合物制备的水溶液和通过使用沉淀的生理活性多肽制备的二级反应混合物的混合物分离生理活性多肽缀合物时，与从第一反应混合物分离的比较，生理活性多肽缀合物的产率是显著增加的。在本发明的具体实施方式中，通过将选择性沉淀应用于第一反应混合物制备的水溶液与通过再溶解含有未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4或胰岛素类似物的沉淀制备的第二反应混合物混合来进行聚乙二醇化，然后在ph2.0～ph3.0的柠檬酸缓冲液中用线性浓度梯度的kcl使用source15s柱或sp-hp柱进行分离。因此，通过应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的缀合物的产率大大高于已知的聚乙二醇化方法的产率(图11和表4)。在本发明的具体实施方式中，通过已知的聚乙二醇化方法和应用使用异丙醇的选择性沉淀的聚乙二醇化方法，咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4具有97％的纯度，并且聚乙二醇化的位置异构体具有相似的纯度(表5)。此外，本发明的另外的方面提供了制备生理活性多肽-生理活性载体缀合物的方法，该方法包括制备缀合物，其中在通过生理活性多肽缀合物的上述制备方法制备的生理活性多肽缀合物中通过藉由共价键来连接非肽基聚合物和生理活性载体使非肽基聚合物的两端分别缀合至生理活性载体和生理活性多肽。在本发明的具体实施方式中，通过经选择性沉淀进行两步位点特异性聚乙二醇化制备的生理活性多肽缀合物以高产率和高纯度产生生理活性多肽-生理活性载体缀合物(多肽-载体缀合物)。与衍生出它们的生理活性多肽缀合物比较，这样的生理活性多肽-生理活性载体缀合物显示完全不同的活性，即杰出的生理活性，如生理活性多肽的药理学作用的极长的持续时间，靶向特定部位如要治疗的病灶，或诱导坏死。在本发明中，生理活性多肽-生理活性载体缀合物中的非肽基聚合物应该是具有两端以结合生理活性多肽和生理活性载体的非肽基聚合物。即，生理活性载体可共价地连接至不键合生理活性多肽缀合物的非肽基聚合物的末端。因此，制备生理活性多肽-生理活性载体缀合物，其中使非肽基聚合物的两端分别连接至生理活性多肽和生理活性载体。如本文所使用的术语“生理活性载体”指生理活性物质，其显示区别于生理活性多肽的生理活性的另外的活性，其可通过与生理活性多肽一起结合至非肽基聚合物来维持生理活性多肽的生理活性，如药理学作用，或诱导靶向特定部位或坏死。用于本发明的生理活性载体可包括具有上述活性的物质，而没有任何限制，例如白蛋白、免疫球蛋白fc区、转铁蛋白、适体、毒素、明胶、胶原、葡聚糖、多糖、脂肪酸、纤维蛋白原等。具体地，生理活性载体可为白蛋白、免疫球蛋白fc区或转铁蛋白，并且更具体为免疫球蛋白fc区，但不限于此。本发明的免疫球蛋白fc区指免疫球蛋白的重链恒定区2(ch2)和重链恒定区3(ch3)，不包括重链和轻链的可变区，重链恒定区1(ch1)，和轻链恒定区1(ch1)。其可进一步包括位于重链恒定区的铰链区。并且，除了重链和轻链的可变区之外，本发明的免疫球蛋白fc区可为含有部分或全部fc区的扩展形式，其包括重链恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区1(cl1)，只要它具有基本上类似于或好于天然免疫球蛋白fc的生理功能，并且可包括通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(famesylation)、乙酰化、酰胺化等修饰的免疫球蛋白fc区。在韩国专利no.10-775343、10-725314、10-725315和10-824505(其通过提述并入本文)中详细公开了免疫球蛋白fc区的范围、其制备方法和使免疫球蛋白fc共价地连接至非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物的方法。在本发明的实施方式中，其中非肽基聚合物位点特异性地连接至多肽缀合物中的生理活性多肽的特定氨基酸，除了生理活性多肽缀合物之外，另外的缀合物的生成是最小化的。这有利于具有药理学价值的生理活性多肽缀合物的生理活性并增加其产率。在本发明的具体实施方式中，使通过已知的聚乙二醇化方法和包括使用异丙醇的选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(lys27)-peg缀合物各自连接至人免疫球蛋白fc片段，并且分析咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc的纯度和产率。结果，两个缀合物具有27.6％的相同纯度(表5)，但是通过包括选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物显示了比通过已知的方法制备的缀合物更高的产率。在本发明中，咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc与ca-毒蜥外泌肽-4-peg-免疫球蛋白fc或免疫球蛋白fc-ca-毒蜥外泌肽-4-peg(lys27)可互换使用。实施例以下，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用作说明的目的，并且不意图通过这些实施例限制本发明。实施例1.聚乙二醇化咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4和分离位置异构体在咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(ca-毒蜥外泌肽-4,bachem,usa)的lys处使用3.4kald(2)peg(3.4kda具有两个醛基的peg,nof,日本)进行聚乙二醇化。为使用3.4kald(2)peg聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的lys位置，使肽和peg在4℃至8℃和20℃至25℃以约1:3至1:30的摩尔比和约5mg/ml至18mg/ml的肽浓度反应0.5小时至4.0小时。在这点上，允许反应在6.5至7.5的ph的100mmhepes缓冲溶液中(添加了还原剂20至30mmscb(nacnbh3))进行。特定反应条件和通过以下方法分离的结果示于下表1和2。详细地，使它们在4℃至8℃以约15mg/ml的肽浓度反应3小时，并且通过以下方法分离的结果示于图2。在ph2.0-4.0的柠檬酸缓冲溶液中，用线性浓度梯度的kcl使用source15s柱从与过程相关的杂质如每个反应溶液中的多peg化的形式和未反应的形式(下表中表示的(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4)分离咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4。[表1][表2]结果，较早地洗脱出(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4和咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)的峰，然后洗脱出lys27-聚乙二醇化的峰，并且在最后部分洗脱出未反应的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的峰(图3)。此外，(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)的含量约为10％至40％，咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg的含量约为40％至50％，并且未反应的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4的含量约为10％至50％。实施例2.聚乙二醇化胰岛素类似物和分离位置异构体使用3.4kald(2)peg在胰岛素类似物的β链n末端处进行聚乙二醇化(wo2014-133324,韩美制药有限公司(hanmipharmaceuticalco.,ltd),韩国)。为使用3.4kald(2)peg聚乙二醇化胰岛素类似物的n末端位置，使肽和peg在4℃至8℃和20℃至25℃以约1:4的摩尔比和约5mg/ml至18mg/ml的肽浓度反应0.5小时至4.0小时。在这点上，允许反应在4.0至6.0的ph的50mm柠檬酸钠缓冲溶液中进行，添加还原剂3～5mmscb(nacnbh3)。详细地，使它们在4℃至8℃以约5mg/ml的肽浓度反应2小时，并且通过以下方法分离的结果示于图3。在ph2.0-4.0的柠檬酸缓冲溶液中，用线性浓度梯度的kcl使用sp-hp柱从每个反应溶液分离胰岛素类似物-peg。因此，较早地洗脱出(peg)n-胰岛素类似物的峰，然后洗脱出n末端聚乙二醇化的峰，并且在最后部分洗脱出未反应的胰岛素类似物的峰(图2)。此外，(peg)n-胰岛素类似物的含量约为10％至20％，胰岛素类似物-peg的含量约为50％至60％，并且未反应的胰岛素类似物的含量约为5％至20％。实施例3.聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4和使用有机溶剂通过选择性沉淀分离未聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4在咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(ca-毒蜥外泌肽-4,bachem,usa)的lys位置处使用3.4kald(2)peg进行聚乙二醇化。反应条件与实施例1中的相同。聚乙二醇化溶液使用反应溶液的体积的2体积或更多，具体地使用3至7体积的异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈处理。从有机溶剂处理的反应溶液中，分离聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4水溶液和未聚乙二醇化的、未反应的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀(图4)。其中，以与实施例1中相同的方式纯化水溶液(图6)，并且每个纯化的部分的含量示于下表3。[表3]在水溶液中，(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)的含量约为10％至40％，咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg的含量约为40％至50％，并且未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的含量约为5％至15％。此外，分离的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀的含量为15％至30％(表3)。实施例4.聚乙二醇化胰岛素类似物和使用有机溶剂通过选择性沉淀分离未聚乙二醇化的胰岛素类似物在胰岛素类似物(韩美制药有限公司,韩国)β链的n末端处使用3.4kald(2)peg(具有两个醛基的peg,nof,日本)进行聚乙二醇化。反应条件与实施例2中的相同。聚乙二醇化溶液使用反应溶液的体积的2体积或更多，具体地使用3至7体积的异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈处理。从有机溶剂处理的反应溶液中，分离聚乙二醇化的胰岛素类似物溶液和未聚乙二醇化的、未反应的胰岛素类似物沉淀(图5)。其中，以与实施例2中相同的方式纯化水溶液(图9)。实施例5.再聚乙二醇化未聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的选择性沉淀和分离位置异构体在咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(ca-毒蜥外泌肽-4,bachem,usa)的lys位置处使用3.4kald(2)peg(具有两个醛基的peg,nof,日本)进行聚乙二醇化，并且使以与实施例3中相同的方式使用异丙醇通过进行选择性沉淀分离的约20％至30％的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀再循环并且进行聚乙二醇化。为使用3.4kald(2)peg聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀的lys，使咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀和peg在20℃至25℃以约1:7.5的摩尔比以约15mg/ml的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4沉淀再溶解溶液浓度反应0.5小时至2.0小时。在这点上，允许反应在ph7.5的100mmhepes缓冲溶液中进行，添加还原剂20mmscb(nacnbh3)。以与实施例1中相同的方式进行纯化。纯化未聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4沉淀的再聚乙二醇化溶液的结果显示，(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg(lys12)的含量约为15％至40％，咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg的含量为40％至50％，并且未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的含量约为10％至40％(图7)，这与初始聚乙二醇化结果类似(表2)。实施例6.再聚乙二醇化未聚乙二醇化的胰岛素类似物的选择性沉淀和分离位置异构体在胰岛素类似物(韩美制药有限公司,韩国)β链的n末端处使用3.4kald(2)peg进行聚乙二醇化，并且使以与实施例4中相同的方式使用异丙醇通过进行选择性沉淀分离的约0.5％至10％的沉淀再循环并且进行聚乙二醇化。为使用3.4kald(2)peg聚乙二醇化胰岛素类似物沉淀的n末端，使胰岛素类似物沉淀和peg在4℃至8℃以1:4的摩尔比以约5～18mg/ml的胰岛素类似物沉淀再溶解溶液浓度反应0.5小时至4.0小时。在这点上，允许反应在ph4.0至6.0的50mm柠檬酸钠缓冲溶液中进行，添加还原剂3～5mmscb(nacnbh3)。以与实施例2中相同的方式进行纯化。纯化未聚乙二醇化的沉淀的再聚乙二醇化溶液的结果显示了，(peg)n-胰岛素类似物的含量约为0％至15％，胰岛素类似物-peg的含量为20％至40％，并且未反应的胰岛素类似物的含量约为30％至45％(图10)。实施例7.从聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4水溶液和再聚乙二醇化的沉淀分离位置异构体之后的产率在咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(ca-毒蜥外泌肽-4,bachem,usa)的lys位置处使用3.4kald(2)peg进行聚乙二醇化。以与实施例1中相同的方式进行反应，并且反应溶液以与实施例3中相同的方式通过使用异丙醇处理进行选择性沉淀。以与实施例5中相同的方式再聚乙二醇化所得沉淀。以与实施例1中相同的方式混合并纯化异丙醇处理的水溶液和再聚乙二醇化的沉淀以分离位置异构体(图8)。作为结果，(peg)n-咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4+咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(lys12)-peg的含量约为25％至30％，咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg的含量约为50％至60％，并且未反应的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的含量为10％至20％。此外，比较通过应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法与已知的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg缀合物的产率的结果在图11和下表4中给出。作为结果，通过应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg缀合物的产率大大高于已知的聚乙二醇化方法的产率。[表4]聚乙二醇化条件ca毒蜥外泌肽-4-peg的产率(％)已知的聚乙二醇化100应用了选择性沉淀的聚乙二醇化132实施例8.分离咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4聚乙二醇化的位置异构体之后的纯度为了检查通过已知的聚乙二醇化方法和包括使用异丙醇的选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4缀合物之间的纯度的不同，使用了实施例1至7的洗脱的溶液进行反相(rp)hplc(图12和13)。因此，根据已知方法的实施例1和根据应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法的实施例7的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4缀合物显示了97％的相同纯度(表5)。[表5]实施例9.分离咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4聚乙二醇化的位置异构体之后的lys-c肽图谱为了检查peg在咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4处的缀合部位，用蛋白酶赖氨酸c消化咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4，并通过反相色谱来分析。实验如下进行：使在实施例1和7中纯化的peg缀合物和咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4溶解于1mg/ml的浓度的三乙胺-hcl缓冲溶液(10mmol/l；ph7.5)，然后添加10μl的酶(0.1mg/ml)以允许反应在37℃进行4小时。在完成反应后，通过反相色谱来分析反应混合物(图14和15)。作为结果，根据每个反应的聚乙二醇化的位置异构体的纯度在表5中给出，并且实施例1和7的纯化的peg缀合物分别具有类似的纯度(表5)，实施例10.咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物的制备为制备咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物，使实施例1中获得的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4-peg缀合物与从韩美制药有限公司购买的人免疫球蛋白fc片段缀合。咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(lys27)-peg缀合物和免疫球蛋白fc在4℃至8℃以约10mg/ml的总蛋白质浓度以1:2.5的摩尔比反应12小时至16小时。反应溶液为ph8.2的100mmhepes，并且使用3％tritonx-100和还原剂50mmnacnbh3处理。在偶联反应之后，偶联反应溶液的反相hplc分析的结果(图16)显示了咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物的纯度为27.6％(表5)。实施例11.通过应用选择性沉淀制备咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物使实施例7中获得的咪唑并-乙酰基-毒蜥外泌肽-4(lys27)-peg缀合物与从韩美制药有限公司(韩国)购买的人免疫球蛋白fc片段缀合。以与实施例10中相同的方式进行偶联，并且分析纯度。反应溶液的反相hplc分析的结果(图17)显示了它的纯度为27.6％(表5)。与实施例1的产率比较了实施例7的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物的产率改善的效果，并且结果示于图18和下表6。作为结果，通过应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg缀合物的产率高于已知的方法的产率。因此，可见，当通过应用了选择性沉淀的聚乙二醇化方法制备的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-peg缀合物用于制备咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白fc缀合物时，产率高于已知的聚乙二醇化方法的产率。[表6]实施例12.用于根据选择性沉淀的应用(通过异丙醇的使用)分析咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的纯度的赖氨酸c肽图谱为了检查用异丙醇处理之前和之后的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的状态的变化，进行赖氨酸c肽图谱绘制。图19显示用异丙醇处理之前绘制咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的图谱的结果，而图20显示应用选择性沉淀(用异丙醇处理)之后绘制咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的图谱的结果。作为结果，在处理之前和之后没有变化。以与实施例9中相同的方式进行分析。实施例13.用于根据沉淀的应用(通过异丙醇的使用)分析咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的纯度的lc-质谱为了检查用异丙醇处理之前和之后的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的作为一级结构的蛋白质序列，进行了lc-质谱(lc-mass)。作为结果，在应用选择性沉淀(异丙醇处理)之前和之后在一级结构中没有变化(图21)。实施例14.用于根据沉淀的应用(通过异丙醇的使用)分析咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的二级结构的cd光谱为了检查用异丙醇(ipa)处理之前和之后的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的二级结构的变化，进行了cd光谱。作为结果，在应用选择性沉淀(异丙醇处理)之前和之后二级结构的含量没有变化(图22和表7).[表7]实施例15.测量应用选择性沉淀之前和之后的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的体外活性为了测量用异丙醇处理之前和之后的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的长效制剂的功效，测量了体外细胞活性。测量glp-1的体外细胞活性的方法是通过使用glp-1处理克隆了glp-1受体的cho细胞来测量胞内camp的增加。用于该实验中的测量体外细胞活性的方法通过藉由改变毒蜥外泌肽-4和测试材料的浓度使用它们处理cho/glp-1，然后测量camp水平以比较ec50值来进行。作为用异丙醇处理之后的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4的对照组，使用用异丙醇处理之前的咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4。测量体外活性的结果示于图23和表8。作为结果，在用异丙醇处理之前或之后，咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4缀合物之间的活性没有差异。[表8]ns,通过t检验，无显著性p>0.05历来的范围1)ca毒蜥外泌肽-4:1.85nm至2.33nm基于上述说明，本领域技术人员会理解的是，本发明可以不同的特定形式实施，而不改变其技术精神或必要特征。因此，应该理解的是上述实施方式不是限制性的，而是在所有方面用作说明的。本发明的范围通过所附权利要求而不是通过它们前面的描述来定义，并且因此，落入权利要求的界限或该界限的等同物的所有改变和修改因此意图通过权利要求来包括。当前第1页12