一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用，特别涉及一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法及其应用于介导miRNA在食管癌细胞中高效递送方面的药物，属于药物载体技术领域。

背景技术：

作为死亡率极高的一种恶性肿瘤中，食管癌在包括中国在内的亚洲国家发病率逐年上升。大量流行病学证据表明，包括过度饮酒、过度吸烟、微量营养素缺乏、日常饮食中摄入致癌物等众多环境危险因素都可以导致食管癌的发生。然而，只有部分暴露于这些危险因素中的个体最终罹患食管癌，提示人类个人遗传因素也可影响食管癌的发生。近年来的研究表明，非编码RNAs(ncRNAs)可能在癌症的发生发展以及正常细胞的恶性转化中发挥着重要的作用。如：一类长度为约22个核苷酸(nt)的ncRNA，microRNA(miRNA)，在调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移中发挥着重要的作用。食管癌中，miR-101和miR-217作为肿瘤抑制基因通过靶向性基因沉默长链非编码RNA(lncRNA)MALAT1的表达，从而抑制食管癌细胞的增殖和侵袭转移。

由于miRNA在癌症中扮演的重要角色，越来越多的科学家们把注意力集中于它们在癌症治疗的有效递送方法研究上。然而，在miRNA的高效递送过程中存在众多问题需要解决。例如，miRNA在细胞内的不稳定性和在靶向组织中的摄入量不足。

叶酸(FA)是包括肿瘤细胞在内众多细胞维持生长的必须物质。叶酸受体(FR)在许多恶性肿瘤，如食管癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌和脑瘤中高表达。此外，叶酸的γ-羧基通过化学衍生化作用后可以保留叶酸的高效靶向性。乙醇胺官能化(聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGEA)为基础的载体表现出很好的传递DNA或RNA的特点，可能是因为PGEAs的化学结构包含丰富的羟基和仲胺基团，而且，其星状结构有利于转染功能的发挥。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用。

本发明技术方案如下：

一种富含羟基的纳米基因载体，该载体以季戊四醇为核心，具有四条臂，为星型结构，每条臂的分子量相等，化学结构如下所示：

式中：n值为33～48，m值为2～5。

根据本发明优选的，所述载体的数均分子量为3.3×10⁴～5.2×10⁴g/mol。

上述载体中的臂含有丰富的羟基和仲胺以及少量的叶酸残基。

在食管癌细胞中介导MALAT1沉默的富含羟基的纳米基因载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别将季戊四醇与2-溴异丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(6～8)，在45～55℃反应22～26小时，制得PER-Br；

(2)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和步骤(1)中制得的PER-Br加入二甲基亚砜(DMSO)中，GMA的浓度为3.8～6.3mmol/mL，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸缩水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩尔比为1:(300～400):1:2，在室温下经原子转移自由基聚合反应2.5～3.5小时，制得星型的s-PGMA，然后将s-PGMA与乙醇胺分别加入到二甲基亚砜(DMSO)中，s-PGMA与乙醇胺的摩尔比为1:(3000～4000)，75～85℃反应30～50分钟，制得s-PGEA；

(3)将步骤(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亚砜中，s-PGMA的浓度为0.17～0.25mg/mL，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA与ED的摩尔比为1:(2700～3600):(300～400)，在75～85℃搅拌反应30～50分钟，经纯化，制得s-PGEAED溶液；

(4)配制含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为19.76～59.28μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为19.76～59.28μmol/mL，按摩尔浓度16.5～49.4μmol/mL的比例向混合液中加入二水合叶酸(FA)，室温搅拌22～26小时，制得叶酸体系；然后，向叶酸体系中加入质量浓度为8.3～12.5mg/mL的步骤(3)制得的s-PGEAED溶液，叶酸体系与s-PGEAED溶液的体积比为1:5，氮气保护下反应22～26小时，经纯化，制得终产物s-PGEA-FA。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的纯化，采用截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-60～-50℃、0～100pa条件下冻干48h以上。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中的纯化，采用截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-60～-50℃、0～100pa条件下冻干48h以上。

原理说明

在本发明中，含叶酸配体的功能化的星形PGEA(s-PGEA-FA)是通过原子转移自由基聚合(ATRP)反应、开环反应、酰胺化反应合成的复合物。为了合成叶酸(FA)功能化的s-PGEA(s-PGEA-FA)，s-PGMA与过量的EA和ED反应，生成s-PGEAED。s-PGEAED不仅包含羟基和仲胺基，还包含少量的伯胺，伯胺可以通过酰胺化与叶酸上的羧基连接以生成s-PGEA-FA(如图1所示)。

有益效果

1、本发明首次公开了基于星型聚阳离子衍生物(s-PGEA-FA)的纳米基因载体，其侧基含有FA配体和/或丰富的亲水性的羟基与仲胺基团，该载体通过原子转移自由基聚合、开环反应、酰胺化反应而合成出来，在不同的食管癌细胞系中介导miR-101、miR-217的高效递送，可高效沉默lncRNA MALAT1表达并进而杀伤食管癌细胞并抑制其侵袭转移；在食管癌的治疗方面具有广阔的应用前景；

2、本发明制备的s-PGEA-FA与现有s-PGEA相比，在不同的食管癌细胞中，将s-PGEA-FA作为肿瘤抑癌miRNA的有效载体，络合而成的miR-101及miR-217形成的s-PGEA-FA/miRNA纳米复合物表现出良好的miRNA递送效率，可高效沉默lncRNA MALAT1表达并进而杀伤食管癌细胞并抑制其侵袭转移，在不同的食管癌细胞系如KYSE30、KYSE450和KYSE150中具有较高的miRNA递送能力；可有效地诱发细胞增殖的抑制、细胞周期的阻滞，从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭；

附图说明

图1、不同的s-PGEA-FA/RNA纳米复合物的检测结果图；

其中：A、不同的s-PGEA-FA/RNA纳米复合物的(a1)粒径和(a2)电位；B、s-PGEA/NC(阴性对照RNA)和s-PGEA-FA/NC纳米复合物在N/P比5和10的原子力显微镜图片；

图2、s-PGMA、s-PGEA、s-PGEAED和s-PGEA-FA由¹H NMR检测结果及化学结构图；

其中：(a)s-PGMA的¹H NMR检测结果及化学结构图；(b)s-PGEA的¹H NMR检测结果及化学结构图；(c)s-PGEAED的¹H NMR检测结果及化学结构图；(d)s-PGEA-FA的¹H NMR检测结果及化学结构图；

图3、s-PGEA或s-PGEA-FA相对表达结果柱状图；

其中：A、在不同的ESCC细胞中利用s-PGEA或s-PGEA-FA介导的miR-101和miR-217的相对表达；B、s-PGEA/miRNA和s-PGEA-FA/miRNA在最佳N/P比介导的MALAT1的相对表达；

图4、s-PGEA-FA递送miR-101及miR-217从而诱发食管细胞增殖曲线图；

图5、s-PGEA-FA递送miR-101及miR-217从而降低食管癌细胞的体外平板克隆形成能力的照片；

图6、s-PGEA-FA递送miR-101及miR-217从而引起食管癌细胞S期细胞周期阻滞的流式细胞仪检测结果图；

图7、s-PGEA-FA递送miR-101及miR-217从而抑制食管癌细胞的划痕愈合能力的结果照片；

图8、s-PGEA-FA递送miR-101及miR-217从而抑制食管癌细胞侵袭能力的结果照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

原料来源：

季戊四醇(PER)，2-溴异丁酰溴(BIBB，98％)，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，98％)，N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA，99％)，溴化亚铜(CuBr，99％)，乙醇胺(EA，98％)，乙二胺(ED，>98％)，支化聚乙烯亚胺(PEI，Mw～25000Da)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，98％)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC，≥98％)均购自Sigma-Aldrich化学公司；

二水合叶酸(FA，97％)购自AflaAesar公司；

实施例1

一种富含羟基的纳米基因载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别将季戊四醇与2-溴异丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:6，在50℃反应24小时，制得PER-Br；

(2)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入步骤(1)中制得的PER-Br中，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸缩水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩尔比为1:350:1:2，在室温下经原子转移自由基聚合反应3小时，制得星型的s-PGMA，然后将s-PGMA与乙醇胺分别加入到二甲基亚砜(DMSO)中，s-PGMA与乙醇胺的摩尔比为1:3500，80℃反应40分钟，制得s-PGEA；

(3)将步骤(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亚砜中，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA与ED的摩尔比为1:3000:350，在80℃搅拌反应40分钟，经截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-56℃、10pa条件下冻干50h，制得s-PGEAED溶液；

(4)配制含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羟基琥珀亚胺摩尔浓度为40μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐摩尔浓度为40μmol/mL，按摩尔浓度33μmol/mL的比例向混合液中加入二水合叶酸(FA)，室温搅拌24小时，制得叶酸体系；然后，向2mL叶酸体系中加入质量浓度10.4mg/mL的步骤(3)中制得的10mLs-PGEAED溶液，氮气保护下反应24小时，经截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-56℃、8pa条件下冻干50h，制得终产物s-PGEA-FA。

经检测，产率为67.8％，产物s-PGEA-FA化学结构由¹H NMR表征，如图2(d)所示，化学结构如下所示：

该载体以季戊四醇为核心，具有四条臂，为星型结构。该载体的每条臂的分子量相等，含有丰富的羟基和仲胺以及少量的叶酸残基，其中n值为41，m值为3。该载体的数均分子量为4.1×10⁴g/mol，约有7％的单体单元接有叶酸残基。

对比例

具有四个臂的星型s-PGMA(M_n＝2.8×10⁴g/mol，分散度为1.2)是通过GMA的原子转移自由基聚合反应(ATRP)制得的。星型的s-PGEA载体是通过利用过量的EA对s-PGMA上的环氧基团进行开环反应而得到的。s-PGEA具有大量的侧羟基和仲胺。羟基能够屏蔽氨基的毒性，因而s-PGEA的细胞毒性比“金标”PEI的低。仲胺能够赋予s-PGEA络合核酸的能力。在不同的细胞系中，s-PGEA表现出很有前途的传递DNA或RNA的能力。

s-PGMA，s-PGEA和s-PGEAED的化学结构由¹H NMR表征，如图2(a)-(c)所示。

实验例1

分子量采用凝胶渗透色谱(GPC)法测得的。GPC仪器装备有一个Wsters 2414折光率检测仪和一个Waters 2487双波长UV检测仪。待检测聚合物的化学结构利用一台¹H核磁共振(¹H NMR)光谱仪检测，该仪器装备有一个Bruker ARX 400MHz分光仪。

在不同N/P比(表示为聚阳离子中的氮元素与RNA中的磷元素之比)下的聚阳离子/RNA复合物按照以下的步骤获得：

将等量的待检测聚阳离子和RNA溶液(溶于DEPC水)混合后，利用涡旋振荡仪振荡，并于室温下静置30分钟。聚阳离子/RNA复合物的粒径和电位利用一台Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Southborough,MA)检测。聚阳离子/RNA复合物的形貌的图片(分辨率为扫描每条线512个像素)是利用一台原子力显微镜(AFM)采集得到的，该仪器装备有NanoscopeIIIa控制器(Bruker,Santa Barbara,CA)。

s-PGEA和s-PGEA-FA的络合RNA的能力首先采用DLS测定。在大多数情况下，当N/P比等于和大于10时，s-PGEA和s-PGEA-FA络合RNA(包括miR-101，miR-217，NC(阴性对照)，和siR-M(阳性对照))形成尺寸小于300nm的复合物(图1a1)。

由上述结果可以看出，在相同的N/P比的条件下，s-PGEA-FA/RNA复合物比s-PGEA/RNA复合物小；该结果表明FA的引入对络合RNA是有利的。此外，经检测，大多数的s-PGEA-FA/RNA复合物的尺寸小于200nm，该尺寸可能有利于细胞内吞。分布于s-PGEA-FA/RNA复合物上的叶酸配体能够与ESCC细胞的细胞膜上的叶酸受体(FR)结合。来自s-PGEA或s-PGEA-FA的复合物的电位随着N/P比的增加而提高(图1a2)。正电位能够促进颗粒依附于带负电的细胞膜上，进而促进转染。

采用AFM(原子力显微镜)进一步确定s-PGEA-FA的络合RNA的能力(图1B)。s-PGEA/NC和s-PGEA-FA/NC纳米复合物是球形的，前者在相同的N/P比条件下尺寸比后者大。当N/P比增加时，本申请所述的s-PGEA-FA变小。这样的AFM结果与DLS结果是一致的。DLS和AFM的结果都表明s-PGEA-FA具有比s-PGEA更强的复合RNA的能力。

实验例2细胞培养和转染分析

将KYSE30、KYSE450和KYSE150细胞接至含10％胎牛血清(Hyclone)的1640培养基中，在37℃含5％CO₂的培养箱中培3天。将培养后的细胞转至6孔板中，每孔2×10⁵个细胞，12小时后以纳米材料PEI作为材料对照，比较s-PGEA/miRNA和s-PGEA-FA/miRNA两种纳米复合物的转染效率。同时，以NC作为阴性对照，以MALAT1-6108(siR-M)作为阳性对照，通过荧光定量PCR实验比较miR-101、miR-217和MALAT1-6108(siR-M)在3种食管癌细胞中的转染效率。

Trizol(购自Invitrogen公司)被用来提取细胞或是组织样品中的RNA，用无RNase的DNase去除基因组DNA，反转录成cDNA(购自TOYOBO公司，Osaka,Japan)。以U6作为内参，通过SYBR-Green的方法来计算miR-101、miR-217的表达。

在KYSE30、KYSE450和KYSE150(如图3所示)中通过RT-PCR实验比较PEI、s-PGEA和s-PGEA-FA的转染效率。大多数情况下，s-PGEA-FA的转染效率要高于s-PGEA，同时，s-PGEA和s-PGEA-FA的转染效率都高于PEI。

与s-PGEA相比，s-PGEA-FA发挥作用是通过叶酸受体介导的细胞的内吞实现的，其在N/P为10时效果最好。同时，s-PGEA-FA表现出低毒性。所以，在后续实验中选择s-PGEA-FA作为转染材料，N/P为10。转染s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217，和s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物后，观察到了lncRNA MALAT1的表达受抑制。以上的结果表明，s-PGEA-FA有很好的转染效率。

实验例3细胞增殖和克隆形成分析

将KYSE30和KYSE150细胞铺到12孔板中，每孔1×10⁵个细胞，用s-PGEA-FA/NC、s-PGEA-FA/miR-101、s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物来处理。分别在转染后24小时、48小时用胰酶消化细胞，并用台盼蓝染色后来计数。

将KYSE30细胞铺到6孔板中，每孔3000个细胞，用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物来处理。12天后，用PBS洗两遍后，用3.7％的甲醛溶液固定，用结晶紫染色后对每个孔的克隆数目进行计算。

在KYSE30和KYSE150细胞中发现s-PGEA-FA/miR-101和s-PGEA-FA/miR-217纳米复合物介导的细胞增殖率低于s-PGEA-FA/NC纳米复合物介导的(图4)。而且，转染s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物也发现有相同的增殖抑制，说明miR-101和miR-217像siR-M那样通过抑制MALAT1的表达而起到抑制细胞增殖的目的。而且，在食管癌细胞中克隆形成实验同样也证实s-PGEA-FA/miR-101和s-PGEA-FA/miR-217纳米复合物有长期的抑制细胞增殖效果(图5)。转染12天后，miR-101，miR-217和siR-M组里的细胞克隆数明显少于NC组的。以上结果表明s-PGEA-FA有很高的转染效率。

实验例4细胞周期分析

将KYSE30细胞铺到12孔板中，每个孔1×10⁵个细胞，用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物来处理细胞。48小时后，用PBS洗两遍后，用乙醇在-20℃固定过夜，在37℃用RNase A消化30分钟后用PI染色，上流式细胞仪检测细胞周期。

用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物转染KYSE30后观察细胞周期受到的影响(如图6所示)。发现细胞周期停留在S阶段(如图6所示)，和对照组NC比起来，其他组中停留在DNA复制阶段的细胞数都有不同程度的增加，miR-101组是26.7％，miR-217组是31.2％，siR-M组是29.9％。以上的结果表明，miR-101和miR-217通过影响DNA的合成来抑制细胞的增殖。

实验例5划痕和侵袭实验分析

将KYSE30和KYSE450细胞铺到12孔板中，每个孔1×10⁵个细胞，用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物处理细胞，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。在细胞接近愈合的时候用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，按0，24，36，48小时取样，拍照。

细胞划痕试验(如图7所示)，用s-PGEA-FA/N转染C纳米复合物KYSE30细胞48小时后细胞划痕消失，有很大差别的是，miR-101，miR-217和siR-M组里的划痕仍然存在，它们的伤痕愈合率分别是65％，45％和53％。在KYSE450细胞中观察到了相同的现象。结果表明：在食管癌细胞中，以s-PGEA-FA作为载体能抑制细胞的迁移。

在侵袭试验中，膜上均匀铺100微升/孔的人工基底膜胶(Matrigel，Biosciences Clontech公司)在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。在上室中加入200微升含0.2％血清的无双抗培养基(含1×10⁴个细胞)，在下室中加入650微升含10％血清的培养基。48小时后，将transwell小室中的培养基吸出，用PBS洗两遍；给小室中加入3.7％甲醛溶液进行固定，然后用PBS洗两次；加入100％甲醇1mL，通透细胞20min，加入结晶紫进行染色，用棉签小心地将小室擦干净，风干并拍照。

细胞侵袭试验结果如图8所示，在食管癌细胞KYSE30和KYSE450中，经s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217和s-PGEA-FA/siR-M纳米复合物处理的细胞和经s-PGEA-FA/NC处理过的比起来，穿过人工基底膜的细胞数减少。这些结果表明，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217纳米复合物能高效的抑制食管癌细胞的侵袭。

结果分析

通过上述实验例的结果可以看出，本发明所述的s-PGEA-FA(星型聚阳离子衍生物)侧基含叶酸配体和丰富的亲水性羟基与仲胺基团，该聚合物作为一个的基因载体是通过原子转移自由基聚合、开环反应、酰胺化反应而合成的，在不同的食管癌细胞中介导miR-101、miR-217沉默lncRNA MALAT1。s-PGEA-FA与s-PGEA相比，s-PGEA-FA在不同的食管癌细胞系包括KYSE30、KYSE450和KYSE150中具有较高的miRNA递送能力，本发明也验证了miR-101、miR-217像siR-M那样通过下调MALAT1的表达来抑制食管癌细胞。在食管癌细胞中，s-PGEA-FA可以递送miR-101、miR-217有效地诱发细胞增殖的抑制、细胞周期的阻滞，以及抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。制备的s-PGEA-FA纳米复合物能有效地沉默MALAT1，在食管癌的治疗方面具有广阔的应用前景。

实施例2

一种富含羟基的纳米基因载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别将季戊四醇与2-溴异丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:6，在50℃反应24小时，制得PER-Br；

(2)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入步骤(1)中制得的PER-Br中，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸缩水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩尔比为1:300:1:2，在室温下经原子转移自由基聚合反应3小时，制得星型的s-PGMA，然后将s-PGMA与乙醇胺分别加入到二甲基亚砜(DMSO)中，s-PGMA与乙醇胺的摩尔比为1:3500，80℃反应40分钟，制得s-PGEA；

(3)将步骤(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亚砜中，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA与ED的摩尔比为1:2700:300，在80℃搅拌反应40分钟，经截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-56℃、10pa条件下冻干50h，制得s-PGEAED；

(4)配制含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羟基琥珀亚胺摩尔浓度为19.76μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐摩尔浓度为19.76μmol/mL，按摩尔浓度21μmol/mL的比例向混合液中加入二水合叶酸(FA)，室温搅拌24小时，制得叶酸体系；然后，向1mL叶酸体系中加入质量浓度为8.3mg/mL的步骤(3)中制得的5mLs-PGEAED溶液，氮气保护下反应24小时，经截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-56℃、8pa条件下冻干50h，制得终产物s-PGEA-FA。

经检测，产率为67.8％，产物s-PGEA-FA的化学结构如实施例1所示，不同之处在于，n值为35，m值为2，数均分子量为3.3×10⁴g/mol，约有5％的单体单元接有叶酸残基。

实施例3

一种富含羟基的纳米基因载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别将季戊四醇与2-溴异丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:6，在50℃反应24小时，制得PER-Br；

(2)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入步骤(1)中制得的PER-Br中，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸缩水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩尔比为1:400:1:2，在室温下经原子转移自由基聚合反应3小时，制得星型的s-PGMA，然后将s-PGMA与乙醇胺分别加入到二甲基亚砜(DMSO)中，s-PGMA与乙醇胺的摩尔比为1:3500，80℃反应40分钟，制得s-PGEA；

(3)将步骤(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亚砜中，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA与ED的摩尔比为1:3600:400，在80℃搅拌反应40分钟，经截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-56℃、10pa条件下冻干50h，制得s-PGEAED；

(4)配制含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羟基琥珀亚胺摩尔浓度为59.28μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐摩尔浓度为59.28μmol/mL，按摩尔浓度49.4μmol/mL的比例向混合液中加入二水合叶酸(FA)，室温搅拌24小时，制得叶酸体系；然后，向1.5mL叶酸体系中加入质量浓度为12.5mg/mL的步骤(3)中制得的7.5mL s-PGEAED溶液，氮气保护下反应24小时，经截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析，然后在-56℃、8pa条件下冻干50h，制得终产物s-PGEA-FA。

经检测，产率为67.8％，产物s-PGEA-FA的化学结构如实施例1所示，不同之处在于，n值为45，m值为5，数均分子量为4.9×10⁴g/mol，约有10％的单体单元接有叶酸残基。