玉米母本单倍体主效诱导基因及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及玉米母本单倍体主效诱导基因及应用。

背景技术：

玉米是世界上第一大作物，具有食用、饲用和工业加工等多方面用途。玉米的增产对于供应当前食用、饲用和工业加工需求具有十分重要的意义。在当前耕地面积逐渐减少的情况下，培育高产、多抗和广适的玉米杂交种是关键。玉米杂交种的育成依赖于优良自交系的选育。传统选育自交系的方法费时费力，常常需通过7代以上方能育成一个稳定的自交系。近年来，单倍体育种技术具有育种周期短、效率高、易于结合分子标记辅助育种方法等优点，已经逐渐成为选育玉米自交系的主要技术。目前，玉米中单倍体主要来源于玉米孤雌生殖诱导系的诱导，即Stock6或其衍生的诱导系作为父本，与其他材料杂交后产生的。由于大多数诱导系导入了R1-nj标记，因而可以使用胚和胚乳颜色标记进行玉米单倍体的鉴别。因而大大提高了玉米单倍体育种的效率。

由于诱导系通过生产孤雌生殖而产生母本单倍体的方法具有广泛的应用前景和价值，因此，全球多家科研单位对于Stock6及其衍生系诱导产生母本单倍体的遗传基础和生物学基础进行了大量的研究。结果表明，玉米孤雌生殖诱导能够产生玉米单倍体这一性状是可遗传的，并受到多个遗传位点的控制。(1999)等检测到2个控制诱导率性状的遗传位点，分别位于1号染色体和2号染色体。能够解释约17％的表型变异。Barrant等(2008)也检测到位于1号染色体的遗传位点，验证了前人研究的结果。Prigge等(2012)利用多个群体进行全基因组扫描，共发现8个控制诱导率的遗传位点，其中包括位于1号染色体1.04bin的主效遗传位点，并命名为qhir1。因此，位于qhir1是多个控制单倍体诱导率相关QTL中的效应最大、功能最为重要的QTL。董昕等(2014)对qhir1进行了精细定位，并成功将定位区间缩小至243Kb的范围。研究qhir1的候选基因对于新型诱导系的选育及孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体的遗传学及生物学机理尤为重要，鉴于目前育种行业中单倍体育种技术利用的广泛性，该发明具有十分广泛的应用空间和市场前景。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供玉米母本单倍体主效诱导基因，ZmPLA突变基因。

本发明提供的ZmPLA突变基因，其核苷酸序列为将野生ZmPLA基因核苷酸序列上进行插入或/和缺失或/和替换突变，得到序列；

所述野生ZmPLA基因核苷酸序列为序列1。

上述基因中，所述ZmPLA突变基因的核苷酸序列为如下1)-4)中任一种(下面对应实施例中的ZmPLA突变基因ZmHIR1-1、ZmHIR1-2、ZmHIR1-3、ZmHIR1-Stock6)：

1)为野生ZmPLA基因核苷酸序列第280位和281位之间插入T碱基，其他碱基不变，得到的序列；

2)为野生ZmPLA基因核苷酸序列第271位-281位碱基缺失，其他碱基不变，得到的序列；

3)为野生ZmPLA基因核苷酸序列第281位碱基G缺失，其他碱基不变，得到的序列；

4)为野生ZmPLA基因核苷酸序列第1569位后插入CGAG，且第409位的C突变为T、第421位的C突变为G，第441位的T突变为C，第887位的T突变为G，第1210位的G突变为C，第1306位的T突变为C，第1435位的G突变为A，第1471位的C突变为A，第1541位的A突变为C，第1588位的T突变为C，第1591位的C突变为A，得到的序列所示的DNA分子。第1687位碱基A突变为C，第1691位碱基G突变为A，第1706位碱基T突变为C，第1708位碱基G突变为C，第45-46碱基位缺失两个碱基TA，第65-67为碱基由TCG替换为CAA，第67-68碱基位之间插入两个碱基TC，第80-81位碱基由TT替换为CG，499-503位碱基GTAC缺失，524位碱基C突变为G，530位碱基G突变为T，553-560位碱基GCATGCAT缺失，第806-809位碱基GTAC缺失，第1741位碱基G突变为A，第1781位碱基C突变为T，第1787位碱基A突变为T，其他碱基不变，得到的序列。

上述的突变基因或所述野生ZmPLA基因核苷酸序列在诱导产生玉米或其他植物单倍体或在双单倍体系(Double Haploid，DH)育种中的应用也是本发明保护的范围。

沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因在生产植物单倍体中的应用也是本发明保护的范围；

或，沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因的物质在生产植物母本单倍体中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用为，沉默或抑制或敲除目的植物基因组中ZmPLA基因的表达，得到转基因植物，再将所述转基因植物用于杂交或自交，得到母本单倍体。

上述应用中，所述沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因为使目的植物基因组中ZmPLA基因表达量降低或发生缺失或插入突变；

上述应用中，所述使目的植物基因组中ZmPLA基因发生缺失或插入突变为所述使目的植物基因组中ZmPLA基因第一外显子和/或第二外显子和/或第三外显子和/或第四外显子发生缺失或插入突变；

或所述使目的植物基因组中ZmPLA基因发生缺失或插入突变的方式为CRISPER/Cas9和/或TELLEN技术和/或T-DNA插入和/或EMS诱变。

上述应用中，所述使目的植物基因组中ZmPLA基因第一外显子发生缺失或插入突变的方式为CRISPER/Cas9；

或所述沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因的物质为使目的植物基因组中ZmPLA基因第一外显子发生缺失或插入突变的物质；

所述使目的植物基因组中ZmPLA基因第一外显子发生缺失或插入突变的物质为CRISPER/Cas9系统；

所述CRISPER/Cas9系统的靶序列为序列3所示的第1外显子中第264-286位碱基；

所述CRISPER/Cas9系统的sgRNA序列为序列4。

沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因在双单倍体系(Double Haploid，DH)选育或基于DH系的杂交种选育中的应用也是本发明保护的范围。

或沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因的物质在双单倍体系(Double Haploid，DH)选育或基于DH系的杂交种选育中的应用也是本发明保护的范围。

上述目的植物为玉米或其他植物。

本发明另一个目的是提供沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA基因的表达或敲除ZmPLA基因的物质。

本发明提供的物质，包括CRISPER/Cas9系统，所述CRISPER/Cas9系统的靶序列为序列3所示的第1外显子中第264-286位碱基。

上述物质中，所述CRISPER/Cas9系统的sgRNA序列为序列4。

本发明的技术方案如下：通过候选基因预测，在qhir1区间内获得了一个编码磷脂酶基因(PLA)命名为ZmPLA，基因通过CRISPER/Cas9定点突变技术和转基因试验，成功获得了目的基因的突变体材料，利用杂合基因型突变体和纯合基因型突变体对其他玉米材料杂交，验证了ZmPLA突变后的材料作为父本能够诱导产生母本单倍体的功能，将序列突变后没有功能的ZmPLA基因命名为ZmHIR1。所述基因ZmPLA人工定点突变采用了CRISPER/Cas9定点突变技术，对ZmPLA基因的第一外显子加以修饰，使得第一外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入而得到。CRISPER/Cas9修饰时修饰靶点设计长度为20bp，位于ZmPLA第1外显子中第264-286位碱基，靶位点序列为：GCTGCAGGAGCTGGACGGACCGG。

所述CRISPER/Cas9定点突变技术在靶位点体产生的ZmPLA人工定点突变体，其特征在于，所述CRISPER/Cas9基因修饰技术在修饰靶位点造成280-281位碱基位之间1bpT碱基插入，得到ZmPLA基因突变体，插入碱基后的第一外显子序列，插入碱基后的基因命名为ZmHIR1-1，该突变体后代中能够产生约1％～2％玉米母本单倍体

所述CRISPER/Cas9定点突变技术在靶位点体产生的ZmPLA人工定点突变体，其特征在于，所述CRISPER/Cas9基因修饰技术在修饰靶位点造成271-281位碱基位之间缺失GAGCTGGACGG，得到ZmPLA基因突变体，缺失碱基后的第一外显子序列，缺失碱基后的基因命名为ZmHIR1-2，该突变体后代中能够产生约1％～2％玉米母本单倍体

所述CRISPER/Cas9定点突变技术在靶位点体产生的ZmPLA人工定点突变体，其特征在于，所述CRISPER/Cas9基因修饰技术在修饰靶位点造成第281位碱基G缺失，得到ZmPLA基因突变体，缺失碱基后的第一外显子序列，缺失碱基后的基因命名为ZmHIR1-3，该突变体后代中能够产生约1％～2％玉米母本单倍体

本发明还提供了一种已知玉米母本单倍体诱导系Stock6的突变基因序列，并将其命名为ZmHIR1-Stock6，其特征ZmHIR1-Stock6导致自交或作为父本与其他材料杂交的后代出现单倍体。该序列是本发明经过候选基因预测和测序获得，并通过转基因试验证明了该基因的功能丧失导致了玉米母本单倍体的产生。

本发明还提供所述所述基因ZmPLA的人工定点突变体在玉米单倍体育种中的应用。

本发明的基本原理如下：针对候选基因ZmPLA，在基因的第一个外显子上设计靶位点序列，通过CRISPER/Cas9定点突变的方法，将ZmPLA基因的第一个外显子进行突变筛选，获得ZmPLA基因功能缺失的转基因突变体。将成功突变的单株进行自交后，获得的T1代种子，再种植，并以T1代植株纯合突变体和杂合突变体的花粉对两个玉米杂交种郑单958和京科968杂交，获得后代。将该杂交后代种于田间，根据后代单株田间的长势、分子标记及流式细胞倍性鉴定等方法验证其中是否出现母本单倍体。

本发明的实验证明，ZmPLA的突变能够导致玉米母本单倍体的产生，对于揭示玉米母本单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础。同时，利用本实验或本方法所获得的突变单株，具有玉米母本的单倍体诱导能力，对于选育新型的诱导系，进一步提高诱导率，以及提高玉米单倍体育种效率方面具有重要的意义。

附图说明

图1为ZmPLA基因结构示意图及利用Crisper/Cas9技术的靶位点的设定。

图2为利用PCR和Sanger测序检测CRISPER介导的ZmPLA基因定点突变及测序结果。

图3为ZmPLA在与杂交种郑单958、京科968杂交后，出现的单倍体照片。

图4为田间单倍体叶片倍性鉴定结果。

图5为田间单倍体分子标记鉴定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、诱导产生玉米母本单倍体的方法

一、玉米母本单倍体表型相关基因的定位

通过对玉米母本单倍体Stock6衍生诱导系中的诱导率相关QTL进行定位，获得了控制单倍体诱导的主效QTL-qhir1，通过对定位区间内的基因进行功能注释与候选基因预测，最终确定了一个候选基因ZmPLA。

二、敲除玉米ZmPLA基因后获得玉米母本单倍体诱导能力

1、CRISPER/Cas9系统敲除玉米ZmPLA基因

1)sgRNA序列的选择

图1为基因结构及靶位点示意图。

玉米ZmPLA基因的基因组序列如序列表1所示。玉米ZmPLA基因的第一外显子的序列如序列表2所示(序列2在序列1第91-450位)。

在玉米ZmPLA基因的第一外显子序列上设计靶位点序列，长度为21bp，位于第一外显子的第264-286碱基位。

靶位点序列为GCTGCAGGAGCTGGACGGACCGG(序列3)。

靶位点设计sgRNA序列为GCUGCAGGAGCUGGACGGACCGG(序列4)，该sgRNA的编码DNA分子为序列3。

2)、CRISPER/Cas9载体的构建

CRISPER/Cas9载体为将将序列表中序列3所示的sgRNA的编码DNA分子插入pBUN411载体(记载在如下文献中：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC plant biology,2014,14(1):1.)得到的载体。

3)、转基因玉米的获得

将CRISPER/Cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞EHA105，得到重组菌EHA105/CRISPER/Cas9载体。

农杆菌EHA105感受态细胞购自华越洋生物科技有限公司，公众可通过购买获得

再将重组菌EHA105/CRISPER/Cas9载体采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，使用扩繁后的菌液对玉米幼胚进行侵染)转化玉米Xu178(记载在如下文献中：项艳,吴大强,江海洋,等.玉米优良自交系成熟胚再生体系的建立[J].激光生物学报,2007,16(5):649-654.，公众可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得)幼胚，经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因玉米植株。

4)、发生突变的ZmPLA基因转基因玉米鉴定

采集T0代转基因玉米植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用如下引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。

ZmPLA突变序列检测引物：

1240F:CCCUCGACGAGUAUCUAUAGC

1240R:GAAGAUGAUAGGCUGCAGC。

将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果与野生型玉米ZmPLA基因的第一外显子(序列2)进行比对，鉴定T0代转基因玉米不同株系中ZmPLA基因是否发生突变。

结果如下：21株T0代转基因玉米植株中，8株中的ZmPLA基因发生突变，具体突变形式如下，部分如图2所示：

ZmPLA突变基因ZmHIR1-1为ZmPLA基因核苷酸序列1第280位-281位之间插入T碱基，得到的序列所示的DNA分子；

ZmPLA突变基因ZmHIR1-2为ZmPLA基因核苷酸序列1第271位-281位11个碱基缺失，得到的序列所示的DNA分子。

ZmPLA突变基因ZmHIR1-3为ZmPLA基因核苷酸序列1第281位碱基G缺失，得到的序列所示的DNA分子；

将ZmPLA基因发生突变的植株记做阳性T0代转基因玉米。

5)T1代ZmPLA基因发生突变的转基因玉米的基因型鉴定

将上述1得到的阳性T0代转基因玉米，收获种子后再播种，得到T1代转基因玉米。

鉴定T1代转基因玉米的ZmPLA基因是否为突变的基因型，具体如下：T1代转基因玉米的基因组DNA作为模板，利用ZmPLA突变序列检测引物：1240F：CCCTCGACGAGTATCTATAGC和1240R：GAAGATGATAGGCTGCAGC进行扩增，将PCR产物进行Sanger测序，根据测序结果对T1代转基因玉米的基因型进行分类。

测序结果中，自靶位点序列起具有双峰特征的序列，则为杂合基因型，则为T1代转基因玉米杂合型ZmPLA基因突变(同源染色体的1条中ZmPLA基因突变，同源染色体的另1条中ZmPLA基因未突变)；

自靶位点序列起具有特异单峰特征的序列，与玉米ZmPLA基因的第一外显子(序列2)对比，若一样，则为野生型，没有发生突变，下面分析不考虑；若有突变，则为T0代植株自交后获得的纯合突变，则为T1代转基因玉米ZmPLA基因突变纯合型(同源染色体的2条中ZmPLA基因均发生突变)。T1代转基因玉米杂合型ZmPLA基因突变株系有ZmHIR1-1、ZmHIR1-2，且各个株系的突变类型如下：

T1代转基因玉米ZmPLA基因突变杂合型株系ZmHIR1-1中同源染色体中的1条含有ZmPLA突变基因，该突变基因为ZmPLA基因核苷酸序列1第280位-281位之间插入T碱基，且其他碱基不变得到的序列所示的DNA分子，另一条含有野生型ZmPLA基因；

T1代转基因玉米ZmPLA基因突变杂合型株系ZmHIR1-2中同源染色体中的1条含有ZmPLA突变基因，该突变基因为ZmPLA基因核苷酸序列1第271位-281位缺失GAGCTGGACGG碱基，且其他碱基不变得到的序列所示的DNA分子，另一条含有野生型ZmPLA基因；

T1代转基因玉米ZmPLA基因突变纯合型株系ZmHIR1-3中两条同源染色体中均含有ZmPLA突变基因，该突变基因为ZmPLA基因核苷酸序列1第281位缺失G碱基，且其他碱基不变得到的序列所示的DNA分子。

2、CRISPER/Cas9系统敲除玉米ZmPLA基因所获得突变体的单倍体诱导能力的鉴定

1)T1代杂合基因型转基因玉米ZmPLA基因突变单株单倍体诱导能力鉴定

(1)田间表型鉴定

将T1代转基因玉米ZmPLA基因杂合突变株系ZmHIR1-1、ZmHIR1-2的花粉分别授予杂交种郑单958(堵纯信,曹春景,曹青,等.玉米杂交种郑单958的选育与应用[J].玉米科学,2006,14(6):43-45或从奥瑞金种业股份有限公司获得)和杂交种京科968(杂交种京科968购自北京屯玉种业有限责任公司，货号为屯玉京科968，公众可以通过北京屯玉种业有限责任公司购买获得)，获得杂交后代；

将T1代转基因玉米ZmPLA基因杂合突变株系ZmHIR1-2自交，获得自交后代。

将上述所得后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常。

以野生型玉米(ZmPLA基因未突变)与杂交种的后代为对照。每个株系检测数量如表1所示。

统计结果如表1和图3所示：

T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-1与杂交种郑单958杂交的54个后代中得到1个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-1与杂交种京科968杂交的50个后代中得到1个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-2与杂交种郑单958杂交的93个后代中得到2个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-2与杂交种京科968杂交的57个后代中得到2个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

在T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-2自交的27个后代中获得1个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

(2)流式细胞检测叶片倍性

将上述(1)ZmHIR1-1与杂交种后代中鉴定获得的共2个表现为单倍体性状植株，ZmHIR1-2与杂交种后代中鉴定获得的共4个表现为单倍体性状植株，ZmHIR1-2自交后代中鉴定获得的1个表现为单倍体性状植株进行流式细胞检测，方法如下：

提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体玉米叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)；若待测植株的信号峰出现在100附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，该待测植株为二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则认为该待测植株为单倍体植株。

每个株系检测数量如表1所示。

结果如图4所示，上图为野生型玉米流式细胞检测结果，下图为T1代转基因玉米ZmPLA基因突变杂合型株系流式细胞检测结果；

结果如下：

ZmHIR1-1与杂交种杂交后代中2个经表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体，记做T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-1拟单倍体植株。

ZmHIR1-2与杂交种杂交后代中4个经表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体，记做T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-2拟单倍体植株。

ZmHIR1-2自交后代中1个表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体，记做T1代转基因玉米ZmPLA杂合型基因突变株系ZmHIR1-2拟单倍体植株。

(3)分子标记鉴定

在基因组上随机设计30对分子标记，利用转基因材料Xu178(项艳,吴大强,江海洋,等.玉米优良自交系成熟胚再生体系的建立[J].激光生物学报,2007,16(5):649-654.，公众可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得)和杂交种郑单958、京科968的基因组DNA作为模板，进行扩增和多态性分子标记筛选，最终获得一对分子标记，其PCR产物在Xu178中为500bp，而在杂交种郑单958与杂交种京科968的产物长度为300bp，具有较大差异，可以利用琼脂糖凝胶电泳进行分辨，Xu178PCR产物较大，电泳速度慢，而杂交种郑单958和杂交种京科968的PCR产物片段较小，电泳速度快，因此，Xu178的条带位于杂交种郑单958和杂交种京科968条带的上方。(图5，3、4泳道分别为杂交种郑单958、杂交种京科968带型，5泳道为Xu178带型)

对上述T1代杂合型基因突变株系ZmHIR1-1与杂交种杂交后代中出现的2个拟单倍体植株和T1代杂合型基因突变株系ZmHIR1-2与杂交种杂交后代中出现的4个拟单倍体植株进行基因组DNA提取、PCR及琼脂糖带型检测，若待测单株只有郑单958的条带(图5，1泳道)，则认为该单株不存在父本材料的带型，因此是母本单倍体。若杂交后代单株中同时存在Xu178和郑单958/京科968的条带(图5,2泳道)，则认为该单株是正常杂交的后代，是二倍体。

结果如图5所示，M：Marker，5为父本Xu178带型，4为母本郑单958带型，3为母本京科968带型，1为后代中单倍体带型，2为后代中杂合二倍体带型。

分子标记鉴定结果如下：

2个ZmHIR1-1与杂交种后代中经表型鉴定出的拟单倍体的分子标记鉴定结果表明，均为母本单倍体植株。

4个ZmHIR1-2与杂交种后代中经表型鉴定出的拟单倍体的分子标记鉴定结果表明，均为母本单倍体植株。

因此，杂合转基因株系与杂交种的后代单株或者杂合转基因株系自交后代单株中，若按照上述3种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为玉米母本单倍体；若上述3种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为玉米母本单倍体。

统计上述鉴定结果如表1所示，单倍体诱导率(％)＝(单倍体数/测验总株数)*100，可以看出，ZmPLA基因突变后与其他材料杂交，在后代中可获得玉米母本单倍体。

表1杂合突变株系测验后代中单倍体植株的出现频率

注：对照是用野生型Xu178材料与杂交种郑单958及京科968授粉后获得的后代。

2)T1代纯合基因型转基因玉米ZmPLA基因突变单株单倍体诱导能力鉴定

(1)田间表型鉴定

将T1代转基因玉米ZmPLA基因纯合突变株系ZmHIR1-3的花粉授予杂交种郑单958，获得杂交后代；

将T1代转基因玉米ZmPLA基因杂合突变株系ZmHIR1-3自交，获得自交后代。

将上述所得后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常。

结果如下：

T1代转基因玉米ZmPLA纯合型基因突变株系ZmHIR1-3与杂交种郑单958的256个杂交后代中得到4个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

T1代转基因玉米ZmPLA纯合型基因突变株系ZmHIR1-3的30个自交后代中，得到了2个表现为单倍体性状的单株，拟定为单倍体植株。

(2)流式细胞检测叶片倍性

将T1代转基因玉米ZmPLA纯合型基因突变株系ZmHIR1-3与杂交种郑单958杂交后后代中的4个拟单倍体，以及ZmHIR1-3纯合突变自交后代中2个拟单倍体单株进行流式细胞检测，方法如下：

提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以野生型玉米(ZmPLA基因未突变，二倍体)叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)；若待测植株的信号峰出现在100附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，该待测植株为二倍体。若待测植株细每个株系检测数量如表2所示。

结果如图4所示，上图为野生型玉米流式细胞检测结果，下图为T1代转基因玉米ZmHIR1-3纯合株系后代拟单倍体流式细胞检测结果；

结果如下：

ZmHIR1-3与郑单958杂交后代中出现的4个拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体。

ZmHIR1-3纯合突变材料的自交后代产生的2个拟单倍体植株经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体。

(3)分子标记鉴定

在基因组上随机设计30对琼脂糖分子标记，利用转基因材料Xu178和杂交种郑单958、京科968的基因组DNA作为模板，进行扩增和多态性分子标记筛选，获得一对分子标记，其PCR产物在Xu178中为500bp，而在杂交种郑单958与杂交种京科968的产物长度为300bp，具有较大差异，可以利用利用琼脂糖凝胶电泳可以分辨，Xu178PCR产物较大，电泳速度慢，而杂交种郑单958和杂交种京科968的PCR产物片段较小，电泳速度快，因此，Xu178的条带位于杂交种郑单958和杂交种京科968条带的上方。(图5，3、4泳道分别为杂交种郑单958、杂交种京科968带型，5泳道为Xu178带型)

对田间选出的ZmHIR1-3T1代转基因玉米纯合型基因突变株系与郑单958杂交后代中的4个拟单倍体植株进行基因组DNA提取、PCR及琼脂糖带型检测，若待测单株只有郑单958的条带(图5，1泳道)，则认为该单株不存在父本材料的带型，因此是母本单倍体。若杂交后代单株中同时存在Xu178和郑单958的条带(图5,2泳道)，则认为该单株是正常杂交的后代，是二倍体。

结果如图5所示，M：Marker，5为Xu178带型，4为杂交种郑单958带型，3为杂交种京科968带型，1为后代中单倍体带型，2为后代中纯合二倍体带型；

结果如下：

T1代转基因玉米ZmHIR1-3基因纯合突变株系与郑单958的杂交后代中得到的4个拟单倍体经分子标记鉴定后均表现为母本单倍体。

因此，纯合转基因株系与杂交种的后代单株或者纯合转基因株系自交后代单株中，若按照上述3种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为玉米母本单倍体；若上述3种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为玉米母本单倍体。

结果如表2所示，诱导率(％)＝(单倍体株数/测验总株数)*100，可以看出，ZmPLA基因突变后与其他材料杂交，在后代中可获得玉米母本单倍体。

表2杂合突变株系测验后代中单倍体植株的出现频率

三、玉米母本单倍体Stock6的基因型鉴定

Stock6是首次报道的能够诱导产生玉米母本单倍体的特殊材料(Coe EH(1959)A line of maize with high haploid frequency.Am Nat 93:381–382)经过对诱导率主效QTL的精细定位和候选基因预测，发现与B73相比，在Stock6的基因ZmPLA上存在多处SNP突变以及一个4bp的插入(表3)，使得该基因丧失了正常功能。利用Crisper技术对野生型玉米材料的ZmPLA基因进行定点突变后，证明该基因突变后作为父本与其他材料授粉，后代中能出现一定频率的单倍体。Stock6基因组中的ZmPLA基因为将序列1所示的基因ZmPLA的发生了如下的突变后所得到的突变序列，命名为ZmHIR-Stock6。

表3基因ZmPLA的外显子突变形式

基因ZmPLA的5’UTR区域突变为：第45-46碱基位缺失两个碱基TA，第65-67为碱基由TCG替换为CAA，第67-68碱基位之间插入两个碱基TC，第80-81位碱基由TT替换为CG

基因ZmPLA的内含子区域突变为：499-503位碱基GTAC缺失，524位碱基C突变为G，530位碱基G突变为T，553-560位碱基GCATGCAT缺失，第806-809位碱基GTAC缺失。

基因ZmPLA的3’UTR区域突变为:第1741位碱基G突变为A，第1781位碱基C突变为T，第1787位碱基A突变为T。

上述诱导系Stock6中的ZmPLA突变基因4相比于B73中的ZmPLA野生型基因所发生的SNP和Insertion突变，具体突变形式如下：

ZmHIR-Stock6突变序列为ZmPLA基因核苷酸序列1第1569位后插入CGAG，且第409位的C突变为T、第421位的C突变为G，第441位的T突变为C，第887位的T突变为G，第1210位的G突变为C，第1306位的T突变为C，第1435位的G突变为A，第1471位的C突变为A，第1541位的A突变为C，第1588位的T突变为C，第1591位的C突变为A，得到的序列所示的DNA分子。第1687位碱基A突变为C，第1691位碱基G突变为A，第1706位碱基T突变为C，第1708位碱基G突变为C，第45-46碱基位缺失两个碱基TA，第65-67为碱基由TCG替换为CAA，第67-68碱基位之间插入两个碱基TC，第80-81位碱基由TT替换为CG，499-503位碱基GTAC缺失，524位碱基C突变为G，530位碱基G突变为T，553-560位碱基GCATGCAT缺失，第806-809位碱基GTAC缺失，第1741位碱基G突变为A，第1781位碱基C突变为T，第1787位碱基A突变为T。

上述位于1482碱基后的CGAG插入导致该基因发生了移码突变。位于319碱基、331碱基和1120碱基处的SNP变异导致了氨基酸的变化，也影响了蛋白质的功能。

玉米母本单倍体Stock6后代中从单倍体性状、流式细胞检测叶片倍性和分子标记鉴定均证明有单倍体。

因此，无论玉米ZmPLA基因哪种突变导致功能丧失均能使其形成玉米母本单倍体。

序列表

<110>中国农业大学

<120>玉米母本单倍体主效诱导基因及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1795

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

agttcatcac taatcacact tattgtgccc tcgacgagta tctatagcta gctcattaat 60

cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120

aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180

cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240

atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300

gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360

gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420

cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc 480

atccatccag catcgtacgt acgtcctcta tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt 540

tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga gcaggcttgc ggccgccatg tccgcgctga 600

ggaagccaaa gtacaacggc aagtgcatgc gcagcctgat taggagcatc ctcggcgaga 660

cgagggtaag cgagacgctg accaacgtca tcatccctgc cttcgacatc aggctgctgc 720

agcctatcat cttctctacc tacgacgtac gtacgtcgtc acgaatgatt catctgtacg 780

tcgtcgcatg cgaatggctg cctacgtacg ccgtgcgcta acatactcag ctctttccta 840

tctgctgcgc caatttgcag gccaagagca cgcctctgaa gaacgctctg ctctcggacg 900

tgtgcattgg cacgtccgcc gcgccgacct acctcccggc gcactacttc cagactgaag 960

acgccaacgg caaggagcgc gaatacaacc tcatcgacgg cggtgtggcg gccaacaacc 1020

cggtaactga ctagctaact ggaaaacgga cgcacagact ccatgtccat ggcggcccac 1080

aaggtcgatg ctaattgttg cttatgtatg tcgcccgatt gcacatgcgt agacgatggt 1140

tgcgatgacg cagatcacca aaaagatgct tgccagcaag gacaaggccg aggagctgta 1200

cccagtgaag ccgtcgaact gccgcaggtt cctggtgctg tccatcggga cggggtcgac 1260

gtccgagcag ggcctctaca cggcgcggca gtgctcccgg tggggtatct gccggtggct 1320

ccgcaacaac ggcatggccc ccatcatcga catcttcatg gcggccagct cggacctggt 1380

ggacatccac gtcgccgcga tgttccagtc gctccacagc gacggcgact acctgcgcat 1440

ccaggacaac tcgctccgtg gcgccgcggc caccgtggac gcggcgacgc cggagaacat 1500

gcggacgctc gtcgggatcg gggagcggat gctggcacag agggtgtcca gggtcaacgt 1560

ggagacaggg aggtacgaac cggtgactgg cgaaggaagc aatgccgatg ccctcggtgg 1620

gctcgctagg cagctctccg aggagaggag aacaaggctc gcgcgccgcg tctctgccat 1680

caacccaaga ggctctagat gtgcgtcgta cgatatctaa gacaagtggc tttactgtca 1740

gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaata tatat 1795

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg 60

agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc 120

ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag 180

gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg gactacttcg actacatcgc cggaaccagc 240

accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac 300

gctgccaagg acatcaacca cttttacatg cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag 360

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gctgcaggag ctggacggac cgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gcugcaggag cuggacggac cgg 23