一种脂肪干细胞分离培养方法与流程

文档序号:12411408阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种脂肪干细胞分离培养方法,其特征在于,包括:

S1,洗涤脂肪组织,除去血细胞,向T175培养瓶中加入50ml脂肪组织、100ml氯化钠注射液,拧紧盖子,剧烈晃动3min以充分洗涤脂肪组织,接着静止3~5min,使不同相分离,吸去下层水相,重复S1步骤三次,直到下层液较为清澈;

S2,I型胶原酶消化,加入0.1%预热的I型胶原酶溶液,封口,剧烈晃动T175培养瓶5~10秒,置于振动气浴锅中,37℃,70rpm,消化60min,每隔15min剧烈晃动培养瓶5~10秒,直到脂肪组织看起来较为平滑;

S3,分离脂肪基质血管组分,将消化后的脂肪组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中,室温下400g离心10min,得到的沉淀即为脂肪基质血管组分;

S4,净化沉淀,离心后,脂肪基质血管组分沉积于离心管底部,用移液管自上而下除去上层油脂和下层的胶原酶溶液,再加入适量生理盐水重悬细胞,吹散,室温400g离心10min,离心完毕,再次吸取上层清液,最后加入10ml培养基悬浮细胞,将细胞汇总到50ml离心管中,过100目筛,再次在室温下,300g离心10min;

S5,细胞种植,离心后加20ml培养基充分混匀,按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种,即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量,每100ml脂肪组织,最终可以接种8个T75培养瓶,进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算,进而接种细胞;

S6,细胞培养,将T75培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱,原代培养第24h后,进行全量换液,此后每隔3天全量换液,并且保持在二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养;

S7,原代细胞收获,7天左右,原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70%~80%时,收获原代细胞,在T75培养瓶中每75cm2加入2ml由125%Trypsin~0.01%EDTA组成的消化酶溶液,消化1.5~2.5min,再加入培养基2~3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,将脱落下来的原细胞移入50ml离心管中,并往原T75培养瓶中加入4~5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁,最终加入50ml离心管中并定容至50ml,使用移液管吹打悬浮后,通过100目无菌滤网过滤,过滤液收集到另一个50ml离心管中,1000rpm,10min离心洗涤;

S8,原代细胞传代,观察单个离心管内余下细胞沉淀量,适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中,加入适量培养基,轻轻吹打重悬浮细胞,定容至30ml,吹打混匀,取样计数,计数后进行1000rpm,10min二次离心,去除上清液,在离心管中加入培养基适量,轻轻吹打重悬浮细胞,定容后接种至新的培养容器中,传代细胞密度为5000~6000个/cm2,即(3.75~4.5)×105个cells/T75,在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息,将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养,直至培养至细胞融合达85%~90%。

2.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法,其特征在于:在S1步骤中,T175培养瓶需用75%的酒精擦拭外壁。

3.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法,其特征在于:在S2步骤中,I型胶原酶溶液的预热方法为提前半小时于37℃的气浴摇床预热。

4.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法,其特征在于:在S4步骤中,移液管吸取下层的胶原酶溶液时,需要在脂肪基质血管组分沉淀上方留下少量的溶液,以免扰动沉淀细胞。

5.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法,其特征在于:在S6、S8步骤中,培养箱中温度为37±0.5℃,二氧化碳体积分数为5±0.2%。

6.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法,其特征在于:在S4至S8步骤中,所述培养基为Media31+GF30。

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