本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种血清型的大肠杆菌的培养方法。
背景技术：
牛黄是脊索动物门哺乳纲牛科动物牛肝脏的胆结石。天然牛黄极其珍贵，国际上价值堪比黄金。目前市场上多以人工体内外培植为主，而影响牛黄质量和产量的最核心因素就是致使牛黄产生的菌株。为了提高牛黄的质量和产量填补市场，人们一直寻找可以高效产牛黄的菌株。
牛黄的形成过程中，菌株在牛的胆囊内生存，会产生一种叫做β——葡萄糖醛酸酶(β-g酶)的关键酶，这种含量的高低直接决定了牛黄的产量和牛黄中胆红素的含量(此为牛黄质量的关键指标)。
高效致牛黄菌株满足的条件为：高效产生β-g酶、低毒性(对牛本身的生长影响小)、在胆囊环境中稳定繁殖生存。
现有技术中，有一种致黄菌：eco-mixture型血清型的大肠杆菌；但其存在很多缺陷。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有的致黄菌株在筛选过程中不注重低毒性筛选、没有浓度梯度的驯化培养过程，驯化培养的之后没有针对于高效产生β-g酶进行在筛选培养和纯化步骤，以及没有考虑在变化浓度环境中的致黄菌的生长稳定和性质稳定检测，故现有牛黄致黄菌株不能更高效的产生β-g酶；和在牛黄形成过程中对牛本身的生长影响相对较大；在胆囊环境的生长周期较短，繁殖活力较弱。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种血清型的大肠杆菌的培养方法。
本发明是这样实现的，一种血清型的大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：
原料采集：将屠宰后的鸡立即结扎胆管；
大肠杆菌筛选：无菌采集各胆内胆汁接种于麦康凯琼脂平板，同时另取胆内胆汁接种于普通肉汤增菌，经扩大培养后，挑选生长良好的菌落使用甘油保存；
毒素测验：以保存的大肠杆菌标株o8为阳性对照，用胆囊分离出大肠杆菌分别接种于葡萄糖、蛋白胨肉汤；增菌，培养后作兔肠结扎试验，判定结果；再进行小鼠的中长期注射毒性检测，筛选出对小鼠生长影响小的菌种；
胆汁存活筛选：取毒素测验步骤中分离菌种的肉汤培养物接种于牛胆汁中，培养，取存活菌落使用甘油条件下保存；
高浓度胆汁耐受筛选：用肉汤配制含牛胆汁的无菌培养基；使用胆盐配成无菌肉汤；取胆汁存活筛选步骤中分离菌的肉汤培养物和接种于胆盐牛胆汁琼脂中由低度胆汁到高度逐步培养驯化；重复胆汁存活筛选步骤；
将驯化得到的菌株分别进行牛胆囊动态生长模拟环境：取分离菌种的肉汤培养物分别接种于灭菌的牛胆汁中，上调和下调胆汁中的胆红素浓度；培养；取培养后的菌种涂布于麦糠凯琼脂平板培养；检测生长好的菌落对葡萄糖醛酸的利用情况进行再次筛选；
分离提纯：重复大肠杆菌筛选、毒素测验、胆汁存活筛选步骤，得到血清型的大肠杆菌。
进一步，所述大肠杆菌筛选具体包括：无菌采集各胆内胆汁0.01ml分别接种于麦康凯琼脂平板，同时另取1ml接种于普通肉汤增菌，37℃培养24～h48h：
麦糠凯琼脂平板上出现直径约2mm～3mm、圆形、隆起、光滑、湿润的红色菌落视为可疑，麦糠凯无菌落生长、肉汤清亮透明者视为无菌，麦糠凯上无红色的菌落但是肉汤浑浊者再取0.1ml肉汤培养物转接于麦糠凯平板上37℃培养24h从麦糠凯培养基上挑选标准菌落，接种于普通培养基上，经扩大培养后，挑选生长良好的菌落使用甘油于4℃条件下保存。
进一步，所述毒素测验具体包括：以保存的大肠杆菌标株o8为阳性对照，用胆囊分离出的26株大肠杆菌分别接种于1％葡萄糖、2％蛋白胨肉汤，于37℃增菌，培养36h后作兔肠结扎试验，每肠段注射菌液1ml，对照肠段注入普通无菌肉汤，判定结果；
进行小鼠的中长期注射毒性检测，筛选出对小鼠生长影响较小的菌种。
进一步，所述胆汁存活筛选具体包括：取毒素测验步骤中分离菌种的肉汤培养物各1铂耳，分别接种于2ml灭菌的牛胆汁中，37℃培养24h后置于室温18℃下，后每隔24h取1铂耳涂布于麦糠凯琼脂平板，37℃培养24h；
平板上有多量密集的菌落为存活，少量稀疏菌落为生长不良，无菌落为生长死亡；取存活菌落使用甘油于4℃条件下保存。
进一步，所述高浓度胆汁耐受筛选具体包括：用肉汤配制含经高压灭菌后冰箱内保存的牛胆汁6％、10％、20％、40％、50％和100％的无菌培养基；
使用胆盐配成胆酸含量为0.25％、0.5％、1.25％、2.5％、6.0％、10.0％、20.0％、25.0％、30.0％和35.0％的无菌肉汤；
每管总量均为1ml；取胆汁存活筛选步骤中分离菌的肉汤培养物各0.05ml和接种于胆盐牛胆汁琼脂中由低度胆汁到高度逐步培养驯化；重复胆汁存活筛选步骤。
进一步，将驯化得到的菌株分别进行牛胆囊动态生长模拟环境：取分离菌种的肉汤培养物各1铂耳，分别接种于2ml灭菌的牛胆汁中，每6个小时上调和下调胆汁中的胆红素浓度1％，37℃培养24h后置于室温(大约18℃)下，后每隔24h取1铂耳培养后的菌种涂布于麦糠凯琼脂平板，37℃培养24h。平板上有多量密集的菌落为存活，少量稀疏菌落为生长不良，无菌落为生长死亡。检测生长较好菌落对葡萄糖醛酸的利用情况进行再次筛选。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述的血清型的大肠杆菌的培养方法培养的牛黄菌株。
本发明的优点及积极效果为：
本发明解决了现有牛黄不能更高效的产生β-g酶、牛黄形成过程中对牛本身的生长影响相对较大、在胆囊环境的生长周期较短，繁殖活力较弱的问题。与现有技术相比，稳定繁殖时长可提高10％左右。
附图说明
图1是本发明实施例提供的血清型的大肠杆菌的培养方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中的大肠杆菌escherichiacoliwj-zh-01于2016年10月27日由中国典型培养物保藏中心收入保藏，保藏号：m2016596。请求保藏人：四川农业大学动物医学院徐志文。保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学。保藏日期：2016年10月27日，保藏编号：cctccno:m2016596，分类命名：大肠杆菌escherichiacoliwj-zh-01。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的血清型的大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：
s101：原料采集：将屠宰后的鸡立即结扎胆管。
s102：大肠杆菌筛选：无菌采集各胆内胆汁0.01ml分别接种于麦康凯琼脂平板，同时另取1ml接种于普通肉汤增菌，37℃培养24-48h。麦糠凯琼脂平板上出现直径约2-3mm、圆形、隆起、光滑、湿润的红色菌落视为可疑，麦糠凯无菌落生长、肉汤清亮透明者视为无菌，麦糠凯上无红色的菌落但是肉汤浑浊者可以再取0.1ml肉汤培养物转接于麦糠凯平板上37℃培养24h从麦糠凯培养基上挑选标准菌落，接种于普通培养基上，经扩大培养后，挑选生长良好的菌落使用甘油于4℃条件下保存。
s103：毒素测验：以保存的大肠杆菌标株o8为阳性对照，用胆囊分离出的26株大肠杆菌分别接种于1％葡萄糖、2％蛋白胨肉汤，于37℃增菌，培养36h后作兔肠结扎试验，每肠段注射菌液1ml，对照肠段注入普通无菌肉汤，按常规判定结果。进行小鼠的中长期注射毒性检测，筛选出对小鼠生长影响较小的菌种。
s104：胆汁存活筛选：取s103分离菌种的肉汤培养物各1铂耳，分别接种于2ml灭菌的牛胆汁中，37℃培养24h后置于室温(大约18℃)下，后每隔24h取1铂耳涂布于麦糠凯琼脂平板，37℃培养24h。平板上有多量密集的菌落为存活，少量稀疏菌落为生长不良，无菌落为生长死亡。取存活菌落使用甘油于4℃条件下保存。
s105：高浓度胆汁耐受筛选：用肉汤配制含牛胆汁(经高压灭菌后冰箱内保存的)6％、10％、20％、40％、50％和100％的无菌培养基。使用5号胆盐(上海长江生化制药厂生产，胆酸含70-85％)配成胆酸含量为0.25％、0.5％、1.25％、2.5％、6.0％、10.0％、20.0％、25.0％、30.0％和35.0％的无菌肉汤。每管总量均为1ml。取2.2.4分离菌的肉汤培养物各0.05ml和接种于胆盐牛胆汁琼脂中由低度胆汁到高度逐步培养驯化。重复s104实验过程。
s106：将驯化得到的菌株分别进行牛胆囊动态生长模拟环境：取分离菌种的肉汤培养物各1铂耳，分别接种于2ml灭菌的牛胆汁中，每6个小时上调和下调胆汁中的胆红素浓度1％，37℃培养24h后置于室温(大约18℃)下，后每隔24h取1铂耳涂布于麦糠凯琼脂平板，37℃培养24h。平板上有多量密集的菌落为存活，少量稀疏菌落为生长不良，无菌落为生长死亡。检测生长较好菌落对葡萄糖醛酸的利用情况进行再次筛选。
s107：分离提纯重复s102～s104，得到血清型的大肠杆菌。
本发明解决了现有牛黄不能更高效的产生β-g酶、牛黄形成过程中对牛本身的生长影响相对较大、在胆囊环境的生长周期较短，繁殖活力较弱的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。