一株高活性饲用植物乳杆菌及其培养方法和应用与流程

技术领域：

本发明属于乳酸菌培养技术领域，涉及一株高活性饲用植物乳杆菌及其培养方法和应用。

背景技术：
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植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）是农业部《饲料添加剂品种目录》所列菌种，属于人及动物肠道中的正常菌群，进入肠道后可有效定殖。植物乳杆菌代谢碳水化合物产生乳酸，有利于降低肠道环境ph，抑制有害菌的生长。植物乳杆菌代谢过程中还会产生过氧化氢，细菌素等物质，对致病菌有一定的杀灭作用，而且不会有药物残留。鉴于植物乳杆菌的以上特性，越来越多的厂家选择其作为微生态制剂产品的生产菌种之一。

传统的乳酸菌发酵多选用mrs培养基，价格昂贵，发酵后的活菌数低于1×10⁹cfu/ml，在益生菌有效使用剂量固定的情况下，低发酵水平等于变相的增加了成本。低成本的培养基，高效的可放大的发酵工艺对于推进益生菌产品的产业化有重大指导及实践意义。

总之，筛选一株高活性植物乳杆菌，并开发一种低成本、高产量，能长期保持活性的植物乳杆菌微生态制剂，对于发展绿色饲料，保证食品安全具有重要的意义。

技术实现要素：
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（一）发明目的：

本发明的第一个目的是提供一株饲用植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747。

采集60日龄健康仔猪的粪便，从中分离、筛选，鉴定出一株植物乳杆菌lactobacillusplantarum，命名为wei-70，并于2015年11月26日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为cgmccno.11747，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所邮编:100101电话：86-10-64807596。

植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747为革兰氏阳性细菌，圆端杆状，，无芽孢，无鞭毛；兼性厌氧，最适生长温度为30-40℃，最适ph为6.0-7.0。在mrs培养基中培养20h以上，活菌数可接近1×10⁹cfu/ml。

本发明的第二个目的是提供植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的高密度液体培养方法。

本发明提供的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的高密度液体培养方法，是将该菌接种至专用的液体培养基进行培养，液体培养基的主要成分如下：

麦芽糊精20g/l、玉米浆粉32g/l，三水合乙酸钠3g/l，三水合磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，七水合硫酸镁0.6g/l，一水合硫酸锰0.1g/l、吐温801g/l，ph值为6.5。

在上述培养方法中，接种比例为1%；培养温度为34-37℃；静置或不通气培养，培养时间为16-20h。

在50l发酵罐条件下，利用上述培养基在37℃，转速100rpm，不通气的条件下发酵24h后获得的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的发酵液的活菌数可达到5.0×10⁹-6.0×10⁹cfu/ml。而同样条件下，植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在mrs培养基中培养后的活菌数只有9.2×10⁸cfu/ml，优化后的培养基使活菌数提高了5倍以上。

本发明的第三个目的是提供植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747作为微生态制剂的制备方法，将菌种经一级种子摇瓶和50l发酵罐富集后的发酵液通过高速管式离心机收集菌泥，与菌体保护剂混合均匀，先于-70℃预冻4-5h，然后置于真空冷冻干燥机中，在以下冻干参数下进行冻干：真空度小于30pa，冷阱温度为-40℃至-50℃，冻干41h，干燥后获得活性菌粉，将菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的玉米芯粉混合，获得微生态制剂产品。

所述高速管式离心机收集菌体的转速为15000-20000rpm。

所述菌体保护剂配方为：每1000ml水中含有：脱脂奶粉100g，谷氨酸钠10g，海藻糖10g，甘油30g。

所述菌泥与菌体保护剂的质量体积比为1:5。

饲用植物乳杆菌wei-70cgmccno.11747可以作为微生态制剂产品应用在调节畜禽肠道微生态平衡中。

饲用植物乳杆菌wei-70cgmccno.11747可以作为微生态制剂产品应用在预防或辅助治疗畜禽细菌性腹泻中。

（二）意义：

本发明提供了一株植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747，并优化了该菌的发酵培养基，实现了降低成本、提高发酵活菌数的效果。植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747以此工艺进行50l发酵罐水平的发酵，活菌数最高可达到6.0×10⁹cfu/ml，是mrs培养基的6倍以上。在此基础上制作的微生态制剂冻干粉活菌数最高可达7.0×10¹¹cfu/g。

本发明提供的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747具有显著的益生特性，动物服用后可以通过胃液和胆盐，并在肠道中存活。按照上述培养方法和后处理方法制备的微生态制剂产品，用作畜禽微生物饲料添加剂，可以抑制肠道有害菌的增殖，调节畜禽肠道微生态平衡，提高畜禽生产能力、抗病能力，最终减少饲用抗生素的使用。

附图说明

图1为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在人工胃液（ph2.0）中的存活曲线。

图2为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在猪胆盐溶液（胆盐浓度20g/l）中的存活曲线。

图3为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747对人工胃肠消化液的耐受性。图中前2h（虚线为界）是菌株在人工胃液中的存活曲线，随后的22h是菌株从人工胃液转接至人工肠液后的存活曲线。

图4为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵碳源的优化。

图5为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵氮源的优化。

图6为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵温度的优化。

图7为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵ph的优化。

图8为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在50l发酵罐条件下的生长曲线。

具体实施方式:

下列具体实例可以更好地说明本发明，但本发明的应用范围并不仅限于以下实例。

实施例一：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的分离和鉴定：

称取60日龄健康仔猪的粪便25g，放入盛有225ml灭菌的0.85%生理盐水的三角瓶中（三角瓶中预先放入20粒无菌玻璃珠），37℃，180rpm震荡30min，吸取1ml悬浊液做十倍递增梯度稀释，选取2-3个适宜稀释度，吸取1ml稀释液于无菌培养皿中，每个稀释度做两个平行；向加有稀释液的培养皿中加入融化后冷却至46℃的mrs琼脂培养基，小心转动培养皿使试样与培养基充分混合，37℃培养48-72h。从培养皿上挑选不同形态的菌落划线纯化，分别保藏并进行16srdna的测序鉴定。

实施例二：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747耐受低ph胃液、猪胆盐和人工胃肠消化液：

从植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的保藏斜面（mrs培养基）挑一环菌苔接于装有100ml液体mrs培养基的250ml三角瓶中，于37℃，静置培养18h，将菌液在6000rpm的条件下离心10min，弃去上清，用灭菌的0.85%的生理盐水洗涤一次，再用同体积生理盐水悬浮。吸取10ml悬浮菌液分别接于装有90mlph分别为1、2、3、4、5的人工胃液和90ml人工猪胆盐溶液的250ml三角瓶中，猪胆盐浓度分别为3g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l，每种条件做三个平行，同时以不加胆盐的样品为对照。然后在37℃，静置培养180min，分别于初始接种、30min、60min、120min、180min对培养物进行活菌计数，绘制活菌数变化曲线，计算菌株在不同ph人工胃液和不同浓度猪胆盐中保温180min时的存活率。菌液在人工胃液中保温2h后吸取10ml菌悬液接于装有90ml人工肠液的250ml三角瓶中，同样在37℃，静置培养，分别于初始接种、0.5h、1h、1.5h、2h、6h、12h、18h、24h对培养物进行活菌计数，绘制活菌数变化曲线。

结果分析：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在ph2.0的人工胃液中保持180min，存活率达到85%以上，结果见图1；在浓度为20g/l的人工猪胆盐溶液中保持180min，存活率超过70%，结果见图2。植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在人工胃肠消化液中保持24h，活菌数可以维持在10⁷cfu/ml，这个时间符合肠道生理周期，能够保证菌体发挥益生作用，结果见图3。

实施例三：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的抑菌活性：

1、培养平板的制备：

从植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的保藏斜面（mrs培养基）挑一环菌苔接种于液体mrs培养基中，37℃，培养18h，取0.1ml菌液涂布于mrs平板，37℃，培养48h。

2、抑菌活性检测平板的制备：

将指示菌的lb培养液稀释100倍后，吸取0.1ml菌液涂布于lb平板。37℃，过夜培养。所述指示菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌和金黄色葡萄球菌。

3、抑菌活性的测定：

用无菌打孔器在植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的培养平板上打孔，然后将菌块放于涂好指示菌的lb平板上，37℃，培养20h，观察并测量抑菌圈直径。

4、结果分析：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747对4种指示菌都有较强的抑制作用，抑菌圈直径大小为30-35mm。

实施例四：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵碳源的优化：

1、配制不含葡萄糖的mrs培养基作为基础培养基，分装至500ml三角瓶中，装液量300ml/瓶。

2、称取适量的葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚异麦芽糖、麦芽糊精、乳清粉、糖蜜作为碳源，分别加入到上述基础培养基中，充分溶解后，用40%氢氧化钠溶液调ph至6.5，补水至300ml/瓶，每瓶中c的终浓度均为0.67m。121℃灭菌20分钟，制成不同的碳源培养基。

3、用5ml无菌生理盐水将新鲜培养的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全冲洗下来，全部接种到上述碳源培养基中，每瓶接种0.8ml菌悬液，37℃静置培养24h后测定活菌数。每种碳源培养基做三个重复。

4、结果分析：碳源优化实验结果表明，植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747以麦芽糊精作为碳源发酵24h后，可以获得最大活菌数。因此，确定麦芽糊精作为发酵最佳碳源，结果见图4。

实施例五：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵氮源的优化：

1、用麦芽糊精替代mrs培养基中的葡萄糖，配制不含有机氮源（即不含蛋白胨、牛肉膏及酵母膏）的mrs培养基作为基础培养基，分装至500ml三角瓶中，装液量300ml/瓶。

2、称取适量的鱼蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆、玉米浆粉、尿素、硝酸钠和硫酸铵，分别加入到上述基础培养基中，充分溶解后，用40%氢氧化钠溶液调ph至6.5，补水至300ml/瓶，每瓶中总氮的含量均为2.59g/l。121℃灭菌20分钟，制成不同的氮源培养基。

3、用5ml无菌生理盐水将新鲜培养的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全冲洗下来，全部接种到上述氮源培养基中，每瓶接种0.8ml菌悬液，37℃静置培养24h后测定活菌数。每种氮源培养基做三个重复。

4、结果分析：氮源优化实验结果表明，植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747以玉米浆粉作为氮源发酵24h后，可以获得最大活菌数。因此，确定玉米浆粉作为发酵最佳氮源，结果见图5。

实施例六：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵温度的优化：

、配制植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747培养基，成份如下：玉米浆粉32g/l、麦芽糊精20g/l，三水合乙酸钠3g/l，三水合磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，七水合硫酸镁0.6g/l，一水合硫酸锰0.1g/l、吐温801g/l，用40%氢氧化钠溶液调ph至6.5，分装至500ml三角瓶中，装液量300ml/瓶。121℃灭菌20min。

2、用5ml无菌生理盐水将新鲜培养的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全冲洗下来，全部接种到上述培养基中，每瓶接种0.8ml菌悬液，分别于31℃、34℃、37℃、40℃和43℃静置培养24h后测定活菌数。每种培养温度做三个重复。

3、结果分析：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在34℃和37℃条件下静置培养24h，可以获得最大活菌数。因此，确定最适培养温度为34-37℃，结果见图6。

实施例七：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最适发酵初始ph的优化：

、配制植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747培养基，成份如下：玉米浆粉32g/l、麦芽糊精20g/l，三水合乙酸钠3g/l，三水合磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，七水合硫酸镁0.6g/l，一水合硫酸锰0.1g/l、吐温801g/l，分装至500ml三角瓶中，装液量300ml/瓶，分别用冰醋酸或40%naoh溶液调ph为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。121℃灭菌20min。

2、用5ml无菌生理盐水将新鲜培养的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全冲洗下来，全部接种到上述培养基中，每瓶接种0.8ml菌悬液，37℃静置培养24h后测定活菌数。每种ph做三个重复。

3、结果分析：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在ph6.5，37℃静置培养24h的条件下，可以获得最大活菌数。因此，确定最适发酵ph为6.5，结果见图7。

实施例八：植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747发酵培养:

用5ml无菌生理盐水将新鲜培养的wei-70斜面上的菌苔完全冲洗下来，吸取0.8ml菌悬液接种至装有300ml专用发酵培养基的500ml三角瓶中，于37℃，静置培养18h，以1%的接种量接于装有30lph为6.5的专用液体发酵培养基的50l发酵罐中，于37℃进行发酵培养，发酵过程中，转速控制在100rpm，不通气，培养20h，ph降至4.0左右，发酵结束，发酵液活菌数最大可达6.0×10⁹cfu/ml。

结果分析：50l发酵罐发酵后的活菌数最高达到6.0×10⁹cfu/ml，是相同条件下在mrs培养基中发酵活菌数的6倍以上。植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.1174750l发酵罐生长曲线图见图8。

植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747专用发酵培养基，成份如下：玉米浆粉32g/l、麦芽糊精20g/l，三水合乙酸钠3g/l，三水合磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，七水合硫酸镁0.6g/l，一水合硫酸锰0.1g/l、吐温801g/l，ph为6.5。

实施例九：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747发酵液的真空冷冻干燥处理：

将实施例八所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747发酵液经过高速管式离心机，在15000-20000rpm的条件下离心收集菌体。为了降低真空冷冻干燥处理成本，提高冻干后菌粉产品的存活率，选择了4种保护剂配方（见表1）加以比较。将4种经灭菌的保护剂按照体积质量比5:1与离心后的菌体均匀混合，-70℃预冻4-5h，置于-40℃至-50℃的真空冷冻干燥机的冷阱中，真空度30pa以下，冻干41h左右。取出菌粉，测定活菌数，计算存活率。

结果分析，保护剂4适合用于植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747发酵液的真空冷冻干燥处理，存活率可达93%，菌粉活菌数可达5.0×10¹¹-7.0×10¹¹cfu/g。因此菌体保护剂配方确定为：每1000ml水中含有：脱脂奶粉100g，谷氨酸钠10g，海藻糖10g，甘油30g。

表1.保护剂编号及配方

饲用植物乳杆菌wei-70cgmccno.11747可以用于调节畜禽肠道微生态平衡，也可以作为微生态制剂产品用于预防或辅助治疗畜禽细菌性腹泻。

序列表

<110>北京伟嘉盛邦生物技术有限公司北京伟嘉人生物技术有限公司

<120>一株高活性饲用植物乳杆菌及其培养方法和应用

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