本发明涉及一种诱导培养基和诱导方法，具体涉及一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基和诱导方法。
背景技术：
皮肤组织工程是近几年的研究热点，但是皮肤的相关细胞都属于终末分化细胞，很难再体外进行大规模的培养扩增，种子细胞来源问题阻碍了组织工程的发展，自体的种子细胞来源有限，异体的种子细胞存在排斥反应，干细胞又存在伦理问题，因此从尿液中收集尿液细胞，将尿液细胞诱导成为IPS细胞，ips细胞再诱导成为中胚层细胞、成纤维细胞、汗腺细胞、中胚层细胞等即可解决皮肤组织工程的种子来源问题，从尿液中获得细胞，方便快捷，不用通过创伤获取，来源广泛。
目前多功能性干细胞诱导分化为皮肤的各个细胞诱导方案主要有单纯细胞因子诱导、共培养诱导、拟胚体诱导等。然而单纯细胞因子诱导效率低，共培养诱导存在免疫原性，拟胚体存在不定向诱导特点，最终形成三个胚层，不能高效获得某一个胚层，因此，本发明提供一种高效诱导多能性干细胞分化为中胚层细胞的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基和诱导方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基，所述诱导培养基包括以下浓度的各组分：
其中LiCl为氯化锂、CHIR99021为GSK-3(糖原合成酶激酶3)抑制剂，b FGF为碱性成纤维细胞生长因子。
本发明所述的诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基及诱导方法可以高效诱导多能性干细胞分化为中胚层细胞，同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。
优选地，上述所述诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基包括以下浓度的各组分：
采用上述所述的诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基及诱导方法可以最大程度、最高效地诱导多能性干细胞分化为中胚层细胞，中胚层细胞标志基因Flk-1的基因表达水平最高。
优选地，所述诱导培养基还包括基础培养液，所述基础培养液为DMEM/F12E。
本发明诱导培养基是在DMEM/F12培养基的基础上通过添加一些特定的细胞因子和补充物从而提高诱导多能干细胞(ips)向中胚层细胞分化的概率，为皮肤组织工程提供种子细胞来源。
另外，本发明提供了一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导方法，所述方法是将诱导多能干细胞的简单拟胚体接种于上述所述的诱导培养基中进行诱导培养的。
优选地，所述诱导培养温度为25～28℃。
优选地，所述拟胚体的获得方法为将单个复苏的诱导多能干细胞接种于含有拟胚体形成培养基中，离心之后放入培养箱中培养48h后，即形成拟胚体。
优选地，所述单个复苏的诱导多能干细胞的接种量为1×106个细胞/孔。
优选地，所述培养板低速离心的参数条件为：700r/min，5min。
优选地，所述培养箱的温度为37℃、二氧化碳含量为5％CO2。
具体地，拟胚体的获得方法为：(1)、复苏细胞：选择P30的IPS细胞进行复苏，用无基质的人胚胎干细胞培养基(mTeSR1)进行细胞培养，细胞达到80％汇合度时，用Accutase细胞消化液消化为单细胞，计数；(2)、然后按每个AggreWellTM800培养板孔中加入1x106个细胞，加入EB形成培养基，按产品使用操作手册，将AggreWellTM800培养板以700r/min低速离心5min，然后放入含5％CO2、37℃培养箱中培养，培养48h后即形成拟胚体。
另一方面，本发明提供一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基在诱导多能干细胞形成中胚层细胞时的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基和诱导方法，采用该诱导培养基和诱导方法能将诱导多能干细胞高效分化为中胚层细胞。
附图说明
图1为本发明实施例1中在本发明所述诱导培养基和对照培养基中诱导分化简单拟胚体后所形成细胞中的Flk-1的表达情况对比图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例所述一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基包括以下浓度的各组分：
实施例2
本实施例所述一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基包括以下浓度的各组分：
实施例3
本实施例所述一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基包括以下浓度的各组分：
实施例4体外诱导ips向中胚层细胞分化
一、实验组培养基的配制
按照500ml DMEM/F12培养基中加入胰岛素30mg，氢化可的松0.2mg，转铁蛋白50mg，亚硒酸钠5μg，β巯基乙醇0.05mmol，bFGF 6μg，CHIR99021 10μM，LiCl 10mM，非必需氨基酸5ml，谷氨酰胺5ml，青霉素50mg，链霉素50mg的比例配制本发明所述的诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基，并作为以下实验中的实验组培养基。
二、对照组培养基的配制
将500ml EB培养基作为对照组培养基。
三、复苏细胞
选择P30的IPS细胞进行复苏，用无基质的人胚胎干细胞培养基(mTeSR1)进行细胞培养，细胞达到80％汇合度时，用Accutase细胞消化液消化为单细胞，计数。
四、拟胚体的形成：按每个AggreWellTM800培养板孔中加入1×106个细胞，加入EB形成培养基，按产品使用操作手册，将AggreWellTM800培养板以700r/min低速离心5min，然后放入含5％CO2、37℃培养箱中培养，培养48h后即形成拟胚体。
五、诱导分化
将简单拟胚体转移至低吸附24孔板中，24孔板分为两组，分别为实验组和对照组，每组12孔，实验组用实验组培养基培养，即继续用EB培养基培养，对照组用对照组培养基培养，隔天换液，培养到7天后，对中胚层细胞的标志基因Flk-1的基因表达水平进行检测。
其中，中胚层前体细胞鉴定的具体方法为：将对照组和实验组细胞分别用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTANa2的消化液处理1～3分钟，使细胞脱离培养基质并成为单细胞，加入含10％胎牛血清的培养基进行中和消化，1200rpm离心5分钟，用冷PBS缓冲液润洗细胞，将细胞沉淀收集于1.5mlEP管中，使用细胞总RNA提取试剂盒(RNeasyMiniKit,QIAGEN74104)，按其使用说明裂解细胞并提取细胞内总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度后，使用反转录试剂盒(ReverTraAceqPCRRTMasterMix,TOYOBOFSQ-201)将1μg总RNA反转录为cDNA。将cDNA、引物同qPCR反应预混试剂
(THUNDERBIRDSYBRqPCRMix，TOYOBOQPS-201)混合，通过Bio-Rad公司的opticon2荧光实时定量PCR仪对目的基因进行扩增，以人GAPDH基因表达量为参照，每个样本反应独立重复三次以消除系统误差。
六、结果
如图1所示，采用实验组培养基诱导ips形成中胚层细胞时相比采用对照组培养基诱导ips形成中胚层细胞时，实验组的中胚层细胞标志基因Flk-1的基因表达水平远高于对照组的中胚层细胞标志基因Flk-1的基因表达水平，表明实验组的诱导培养基及诱导方法向中胚层细胞分化的效率显著高于对照组，说明本发明所述诱导培养基及诱导方法可以高效诱导多能性干细胞分化为中胚层细胞。同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。