本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种米尔贝霉素的生产方法。
背景技术：
米尔贝霉素是从米尔贝霉素发酵液中分离出的一种具有十六环内酯结构的混合物。米尔贝霉素作为一种新型生物农药，广谱、高效、低毒，为活性最高的杀虫剂之一；同时米尔贝霉素也是合成米尔贝肟的直接原料，米尔贝肟则是一种新型的本合成大环内酯类驱虫药物，对控制和预防大部分寄生虫疾病都有良好效果。
目前，米尔贝霉素的生产方法为包括发酵液过滤出菌渣，利用丙酮或乙醇对菌渣进行提取得米尔贝霉素提取液；向米尔贝霉素提取液中添加与米尔贝霉素提取液等体积的水进行稀释，将稀释后的米尔贝霉素提取液(上柱液)利用树脂吸附，并用乙醇-水或丙酮-水进行洗脱得洗脱液；将洗脱液进行浓缩得浓缩液，再向浓缩液中添加正庚烷进行萃取得萃取液；将萃取液进行浓缩至液体的体积含量在20～30％，即得到米尔贝霉素。该生产方法树脂分离过程一般需耗时3天，且溶剂使用量较大，生产中分离10kg米尔倍霉素需要使用约15m3即15000l丙酮或乙醇，溶媒回收量较大，能耗高，同时，树脂分离所得的米尔贝霉素的纯度为70～80％，得到的米尔贝霉素为膏状，稳定性差，难以保存。
因此，有必要发明一种能生产出高纯度米尔贝霉素的米尔贝霉素的生产方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服了上述缺陷，提供一种能生产出高纯度米尔贝霉素的米尔贝霉素的生产方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：
步骤1：利用第一溶媒对米尔贝霉素浸膏进行溶解，得第一米尔贝霉素溶解液；
步骤2：向步骤1的第一米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒，然后搅拌结晶，制得粗结晶粉；
步骤3：利用第一溶媒对步骤2的粗结晶粉进行溶解，得第二米尔贝霉素溶解液；
步骤4：向步骤3的第二米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒进行搅拌重结晶，得米尔贝霉素重结晶粉；
所述第一溶媒为乙醇、丙酮、乙酸乙酯或异丙醇中的任意一种；所述第二溶媒为正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、正十一烷或正十二烷中的任意一种。
本发明还提供一种米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：
步骤a：将米尔贝霉素发酵液进行过滤得到菌渣；
步骤b：向步骤a的菌渣中添加丙酮或乙醇进行搅拌提取，所述丙酮或乙醇与所述菌渣的液料比为6～10l∶3kg，搅拌的时间为5～7h，然后过滤得到米尔贝霉素提取液；
步骤c：将步骤b中的米尔贝霉素提取液浓缩至丙酮的体积含量或乙醇的体积含量为20～30％，得到米尔贝霉素浸膏；
步骤d：利用第一溶媒对步骤c所得的米尔贝霉素浸膏进行溶解，得第一米尔贝霉素溶解液，其中所述第一溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为9～11l∶150kg；
步骤e：向步骤d的第一米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒，然后搅拌结晶，制得粗结晶粉，其中所述第二溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为24～26l∶75kg，添加所述第二溶媒的流速为5.3～8.7l/min，搅拌的时间为4.5～5.5h，控制反应的温度为20～30℃；
步骤f：利用第一溶媒对步骤e的粗结晶粉进行溶解，得第二米尔贝霉素溶解液，其中所述第一溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为9～11l∶150kg；
步骤g：向步骤f的第二米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒进行搅拌重结晶，得米尔贝霉素重结晶粉，其中所述第二溶媒的添加量、添加所述第二溶媒的流速、搅拌的时间及反应的温度均与步骤e相同；
所述第一溶媒为丙酮；所述第二溶媒为正庚烷。
本发明的有益效果在于：(1)通过结晶的方法提纯米尔贝霉素，得到米尔贝霉素为白色结晶粉，与传统树脂分离方法制得的膏状物米尔贝霉素(纯度为70～80％)相比，纯度达到95％以上，纯度更高，稳定性更好，方便保存；(2)相对传统的树脂分离方法(周期3天)而言，本发明采用结晶的方法提纯米尔贝霉素，工艺更简单，周期只需1天，大大缩短了生产周期，有效提高了生产效率；(3)生产10kg米尔贝霉素，传统的树脂分离方法需耗费15000l溶媒，溶媒回收量大，相应的设备成本高且能耗高，导致生产成本高，而本发明的结晶方法是从浓缩后的米尔贝霉素浸膏再利用溶媒进行结晶纯化，所耗溶媒少，即使加上菌渣制备米尔贝霉素浸膏所用的溶媒，生产10kg米尔贝霉素也只需约1500l溶媒，溶媒回收量为传统方法的十分之一，能耗低，有效降低生产成本。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明最关键的构思在于：采用结晶的方法提纯米尔贝霉素，以制得纯度高的米尔贝霉素。
本发明提供一种米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：
步骤1：利用第一溶媒对米尔贝霉素浸膏进行溶解，得第一米尔贝霉素溶解液；
步骤2：向步骤1的第一米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒，然后搅拌结晶，制得粗结晶粉；
步骤3：利用第一溶媒对步骤2的粗结晶粉进行溶解，得第二米尔贝霉素溶解液；
步骤4：向步骤3的第二米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒进行搅拌重结晶，得米尔贝霉素重结晶粉；
所述第一溶媒为乙醇、丙酮、乙酸乙酯或异丙酮中的任意一种；所述第二溶媒为正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、正十一烷或正十二烷中的任意一种。
本发明的原理为：鉴于米尔贝霉素在第一溶媒下溶解度很高，在第二溶媒下溶解度较低，杂质在第一、第二溶媒中溶解度都较高，我们利用第一溶媒先将米尔贝霉素浸膏溶解，加入第二溶媒，降低米尔贝霉素的溶解度，达到结晶的目的，且杂质大量存在于母液中，以此达到米尔贝霉素结晶纯化的效果。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：(1)通过结晶的方法提纯米尔贝霉素，得到米尔贝霉素为白色结晶粉，与传统树脂分离方法制得的膏状物米尔贝霉素(纯度为70～80％)相比，纯度达到95％以上，纯度更高，稳定性更好，方便保存；(2)相对传统的树脂分离方法(周期3天)而言，本发明采用结晶的方法提纯米尔贝霉素，工艺更简单，周期只需1天，大大缩短了生产周期，有效提高了生产效率；(3)生产10kg米尔贝霉素，传统的树脂分离方法需耗费15000l溶媒，溶媒回收量大，相应的设备成本高且能耗高，导致生产成本高，而本发明的结晶方法是从浓缩后的米尔贝霉素浸膏再利用溶媒进行结晶纯化，所耗溶媒少，即使加上菌渣制备米尔贝霉素浸膏所用的溶媒，生产10kg米尔贝霉素也只需约1500l溶媒，溶媒回收量为传统方法的十分之一，能耗低，有效降低生产成本。
进一步的，所述第一溶媒为乙醇，所述第二溶媒为正己烷或正庚烷。
由上述描述可知，经过实验验证，选用乙醇为第一溶媒，正己烷或正庚烷为第二溶媒制得的米尔贝霉素结晶粉的纯度更高，高于90％。
进一步的，所述第一溶媒为乙酸乙酯，所述第二溶媒为正己烷、正庚烷或正辛烷中的任意一种。
由上述描述可知，经实验验证，选用乙酸乙酯为第一溶媒，正己烷、正庚烷或正辛烷中的任意一种为第二溶媒制得的米尔贝霉素结晶粉的纯度更高，纯度在90％以上。
进一步的，所述第一溶媒为丙酮，所述第二溶媒为正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷或正十一烷中的任意一种。
由上述描述可知，经实验验证，选用丙酮为第一溶媒，选用正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷或正十一烷中的任意一种作为第二溶媒制得的米尔贝霉素结晶粉的纯度在92％以上。
进一步的，所述第一溶媒为丙酮，所述第二溶媒为正庚烷。
由上述描述可知，经实验验证，选用丙酮为第一溶媒，正庚烷为第二溶媒所制得的米尔贝霉素结晶粉的纯度在97％以上。
进一步的，还包括米尔贝霉素浸膏的制备，所述米尔贝霉素浸膏的制备包括以下步骤：
步骤a：将米尔贝霉素发酵液进行过滤得到菌渣；
步骤b：向步骤a的菌渣中添加丙酮或乙醇进行提取，得到米尔贝霉素提取液；
步骤c：将步骤b中的米尔贝霉素提取液浓缩至丙酮的体积含量或乙醇的体积含量为20～30％，得到米尔贝霉素浸膏。
由上述描述可知，采用上述方法制备米尔贝霉素浸膏得到的米尔贝浸膏质量相对稳定，有利于后期制备高纯度的米尔贝霉素。
进一步的，所述步骤b的具体操作为：向步骤a的菌渣中添加丙酮或乙醇进行搅拌提取，所述丙酮或乙醇与所述菌渣的液料比为6～10l∶3kg，搅拌的时间为5～7h，然后过滤得到米尔贝霉素提取液。
由上述描述可知，控制提取试剂(丙酮或乙醇)与菌渣的液料比及搅拌时间，有利于将菌渣中的米尔贝霉素提取完全，使原料得以充分利用。
进一步的，控制步骤2及步骤4中添加第二溶媒的流速为5.3～8.7l/min，所述步骤2和步骤4的搅拌时间均为4.5～5.5h；控制步骤2与步骤4反应的温度为20～30℃。
由上述描述可知，控制添加第二溶媒的流速、搅拌时间及反应温度，使得溶解及反应成分，提高最终米尔贝霉素的收率。
本发明还提供一种米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：
步骤a：将米尔贝霉素发酵液进行过滤得到菌渣；
步骤b：向步骤a的菌渣中添加丙酮或乙醇进行搅拌提取，所述丙酮或乙醇与所述菌渣的液料比为6～10l∶3kg，搅拌的时间为5～7h，然后过滤得到米尔贝霉素提取液；
步骤c：将步骤b中的米尔贝霉素提取液浓缩至丙酮的体积含量或乙醇的体积含量为20～30％，得到米尔贝霉素浸膏；
步骤d：利用第一溶媒对步骤c所得的米尔贝霉素浸膏进行溶解，得第一米尔贝霉素溶解液，其中所述第一溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为9～11l∶150kg；
步骤e：向步骤d的第一米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒，然后搅拌结晶，制得粗结晶粉，其中所述第二溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为24～26l∶75kg，添加所述第二溶媒的流速为5.3～8.7l/min，搅拌的时间为4.5～5.5h，控制反应的温度为20～30℃；
步骤f：利用第一溶媒对步骤e的粗结晶粉进行溶解，得第二米尔贝霉素溶解液，其中所述第一溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为9～11l∶150kg；
步骤g：向步骤f的第二米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒进行搅拌重结晶，得米尔贝霉素重结晶粉，其中所述第二溶媒的添加量、添加所述第二溶媒的流速、搅拌的时间及反应的温度均与步骤e相同；
所述第一溶媒为丙酮；所述第二溶媒为正庚烷。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：(1)通过结晶的方法提纯米尔贝霉素，得到米尔贝霉素为白色结晶粉，与传统树脂分离方法制得的膏状物米尔贝霉素(纯度为70～80％)相比，纯度达到95％以上，纯度更高，稳定性更好，方便保存；(2)相对传统的树脂分离方法(周期3天)而言，本发明采用结晶的方法提纯米尔贝霉素，工艺更简单，周期只需1天，大大缩短了生产周期，有效提高了生产效率；(3)生产10kg米尔贝霉素，传统的树脂分离方法需耗费15000l溶媒，溶媒回收量大，相应的设备成本高且能耗高，导致生产成本高，而本发明的结晶方法是从浓缩后的米尔贝霉素浸膏再利用溶媒进行结晶纯化，所耗溶媒少，即使加上菌渣制备米尔贝霉素浸膏所用的溶媒，生产10kg米尔贝霉素也只需约1500l溶媒，溶媒回收量为传统方法的十分之一，能耗低，有效降低生产成本。
实施例1
一种米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：
本发明还提供一种米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：
步骤a：将米尔贝霉素发酵液进行过滤得到菌渣；
步骤b：向步骤a的菌渣中添加丙酮或乙醇进行搅拌提取，所述丙酮或乙醇与所述菌渣的液料比为6～10l∶3kg，搅拌的时间为5～7h，然后过滤得到米尔贝霉素提取液；
步骤c：将步骤b中的米尔贝霉素提取液浓缩至丙酮的体积含量或乙醇的体积含量为20～30％，得到米尔贝霉素浸膏；
步骤d：利用第一溶媒对步骤c所得的米尔贝霉素浸膏进行溶解，得第一米尔贝霉素溶解液，其中所述第一溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为9～11l∶150kg；
步骤e：向步骤d的第一米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒，然后搅拌结晶，制得粗结晶粉，其中所述第二溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为24～26l∶75kg，添加所述第二溶媒的流速为5.3～8.7l/min，搅拌的时间为4.5～5.5h，控制反应的温度为20～30℃；
步骤f：利用第一溶媒对步骤e的粗结晶粉进行溶解，得第二米尔贝霉素溶解液，其中所述第一溶媒的添加量与步骤b中的菌渣比为9～11l∶150kg；
步骤g：向步骤f的第二米尔贝霉素溶解液中添加第二溶媒进行搅拌重结晶，得米尔贝霉素重结晶粉，其中所述第二溶媒的添加量、添加所述第二溶媒的流速、搅拌的时间及反应的温度均与步骤e相同；
所述第一溶媒为乙醇、丙酮、乙酸乙酯或异丙酮中的任意一种；所述第二溶媒为正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、正十一烷或正十二烷中的任意一种；将第一溶媒与第二溶媒进行进行任意组合成不同的溶媒体系用于上述各步骤中，所制得的米尔贝霉素的纯度如表1所示；
表1不同溶媒体系对米尔贝霉素纯度影响
实施例2
一种米尔贝霉素的生产方法(以750kg菌渣为原料进行生产，含米尔贝霉素约20kg)，包括以下步骤：
步骤a：将米尔贝霉素发酵液进行过滤得到菌渣；
步骤b：取750kg菌渣，投入萃取罐中，加入2000l丙酮，搅拌6h，然后过滤得到米尔贝霉素提取液；
步骤c：将步骤b中的米尔贝霉素提取液浓缩至丙酮的体积含量为20～30％，得到米尔贝霉素浸膏；
步骤d：向步骤c得到的米尔贝霉素浸膏加入50l丙酮溶解，得第一米尔贝霉素溶解液；
步骤e：向步骤d的第一米尔贝霉素溶解液中缓缓加入250l正庚烷，控制正庚烷加入的流速为5.3～8.7l/min(30～45min内加完)，控制温度20～30℃，搅拌结晶5h，利用滤径为0.8mm的滤膜进行过滤，得粗结晶粉；
步骤f：利用50l丙酮对步骤e的粗结晶粉进行溶解，得第二米尔贝霉素溶解液；
步骤g：向步骤f的第二米尔贝霉素溶解液中缓缓加入250l正庚烷，控制正庚烷加入的流速为5.3～8.7l/min(30～45min内加完)，控制温度20～30℃，搅拌重结晶5h，利用滤径为0.6mm的滤膜进行过滤，得米尔贝霉素重结晶粉16.8kg。
用hplc测定制得的米尔贝霉素重结晶粉的纯度为97.2％，收率约为85％。(收率按以下公式计算：收率＝重结晶粉中米尔贝霉素量÷菌渣中米尔贝霉素总含量)。
实施例3
一种米尔贝霉素的生产方法(以750kg菌渣为原料进行生产)，操作步骤同实施例2，不同之处在于，步骤b中的丙酮添加量改为1500l，搅拌时间改为5h；步骤d及步骤f的丙酮添加量均改为45l；步骤e及步骤g的正庚烷的添加量均改为240l，搅拌结晶时间改为4.5h。得米尔贝霉素重结晶粉16.5kg。
用hplc测定制得的米尔贝霉素重结晶粉的纯度为97.3％，收率约为82.5％。收率计算方式同实施例1。
实施例4
一种米尔贝霉素的生产方法(以750kg菌渣为原料进行生产，约含米尔贝霉素20kg)，操作步骤同实施例2，不同之处在于，步骤b中的丙酮添加量改为2500l，搅拌时间改为7h；步骤d及步骤f的丙酮添加量均改为55l；步骤e及步骤g的正庚烷的添加量均改为260l，搅拌结晶时间改为5.5h。得米尔贝霉素重结晶粉16.9kg。
用hplc测定制得的米尔贝霉素重结晶粉的纯度为98.2％，收率约为84.5％收率计算方式同实施例1。
实施例5
一种米尔贝霉素的生产方法(以750kg菌渣为原料进行生产，约含米尔贝霉素20kg)，操作步骤同实施例2，不同之处在于，将实施例中的丙酮，换成乙醇制得米尔贝霉素重结晶粉17.0kg。
用hplc测定制得的米尔贝霉素重结晶粉的纯度为92.3％，收率约为85％。收率计算方式同实施例1。
实施例6
米尔贝霉素的纯度对米尔贝霉素稳定性的影响，将起始纯度不同的米尔贝霉素置于(25±2℃的环境中，每周采用hplc法对其进行纯度测定，结果见表2，
表2不同起始纯度的米尔贝霉素贮存一定时间后纯度的变化
由上表可知，同样的温度下，米尔贝霉素的起始纯度低于90％时，随着贮存时间的延长，米尔贝霉素的纯度快速降低，米尔贝霉素的起始纯度越高，质量越稳定，因此，制备出高纯度的米尔贝霉素显得尤为重要。
对比例1
树脂分离纯化：取750kg菌渣(约含米尔贝霉素20kg)，投入萃取罐中，加入2m3(2000l)乙醇，搅拌6h，过滤，滤液加入2m3(2000l)水稀释，上大孔树脂吸附，用34.5m3的60％乙醇-水洗脱，洗脱液浓缩后，加入500l正庚烷萃取，正庚烷层浓干后得到米尔贝霉素膏状物，含米尔贝霉素约15kg，纯度75.2％，收率约75％(收率＝膏状物米尔贝霉素量÷菌渣中米尔贝霉素总含量)。
对比例2
树脂分离纯化：取750kg菌渣，投入萃取罐中，加入2m3(2000l)丙酮，搅拌6h，过滤，滤液加入2m3(2000l)水稀释，上大孔树脂吸附，用35m3的60％丙酮-水洗脱，洗脱液浓缩后，加入500l正庚烷萃取，正庚烷层浓干后得到米尔贝霉素膏状物15.2kg，纯度73.8％，收率约为75.1％收率＝膏状物米尔贝霉素量÷菌渣含米尔贝霉素量)。
综上所述，本发明提供的米尔贝霉素的生产方法，通过结晶的方法提纯米尔贝霉素，得到米尔贝霉素为白色结晶粉，与传统树脂分离方法制得的膏状物米尔贝霉素(纯度为70～80％)相比，纯度达到95％以上，纯度更高，稳定性更好，方便保存；相对传统的树脂分离方法(周期3天)而言，本发明采用结晶的方法提纯米尔贝霉素，工艺更简单，周期只需1天，大大缩短了生产周期，有效提高了生产效率；生产10kg米尔贝霉素，传统的树脂分离方法需耗费15000l溶媒，溶媒回收量大，相应的设备成本高且能耗高，导致生产成本高，而本发明的结晶方法是从浓缩后的米尔贝霉素浸膏再利用溶媒进行结晶纯化，所耗溶媒少，即使加上菌渣制备米尔贝霉素浸膏所用的溶媒，生产10kg米尔贝霉素也只需约1500l溶媒，溶媒回收量为传统方法的十分之一，能耗低，有效降低生产成本。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。