本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种肾脏干细胞外泌体的制备方法。
背景技术：
干细胞治疗肾病是近几年流行起来的一种治疗方法。因干细胞具有“无限”增殖，多向分化潜能，具有造血支持，免疫调控和自我复制等特点。可作为理想的“种子”细胞用于病变引起的组织器官损伤修复。近年来基础研究干细胞治疗肾病过程中发现，干细胞可分化成肾固有细胞，肾实质细胞等，所以干细胞移植后对肾脏功能具有良好的修复和重建作用，其与微化中药渗透疗法的作用原理相同，所以二者具有相辅相成的作用。
干细胞治疗肾病有特点和优势：
①具有强大的增殖能力和多向分化潜能，能够增殖分化并产生大量后代。
②通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制t细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。
③具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。
④低免疫原性。因细胞处于原始状态，不易被识别，所以不存在免疫排斥的特性，没有血型匹配问题。
⑤长期传代不改变生物学特性。可分化成肾固有细胞，肌细胞，肝细胞，成骨细胞，软骨细胞等多种细胞的能力。
⑥具有归巢性（靶向性——靶向定位）。损伤性信号可以刺激干细胞向受损器官，组织的迁移、分化，能够归巢到受损病灶，对于受损的细胞进行修复。
但是干细胞的体内归巢特性无法精准掌握，在治疗中有局限性。所以，寻找高效的安全的肾病的细胞治疗是临床上迫切的需求。
外泌体其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年，valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的exosome可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mrna成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mrna，exosomes所转移的microrna同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mrna的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止目前已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microrna、3408种mrna。
一类外泌体中常见的细胞质蛋白是rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(gtpases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，有文献报道称rab4,rab5和rab11主要出现在早期以及回收的核内体中，rab7和rab9主要出现在晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种rab蛋白，除了rab蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白（包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（cd63,cd81和cd9)）、热休克蛋白家族（(hsp60,hsp70,hspa5,cct2和hsp90以及一些细胞特异性的蛋白包括a33（结肠上皮细胞来源）、mhc-ⅱ(抗原提呈细胞来源)、cd86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶（gapdh,烯醇化酶1,醛缩酶1,pkm2,pgk1,pdia3,gstp1,dpp4,ahcy,tpl1,抗氧化蛋白,p4hb,ldh,亲环素a,fasn,mdh1和cnp）、核糖体蛋白（rps3）、信号转导因子（黑色素瘤分化相关因子,arf1,cdc42,人类红细胞膜整合蛋白,slc9a3r1）、粘附因子（mfge8、整合素）、细胞骨架蛋白以及泛素等。
但目前的外泌体培养过程复杂，取材困难，而且取材来源有限，制约了外泌体技术治疗肾病的发展和应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种肾脏干细胞外泌体制备方法，它能克服现有技术的弊端，提供肾病治疗中需要的肾脏干细胞外泌体。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：一种肾脏干细胞外泌体制备方法，它包含如下步骤：
步骤(一)：无菌条件下取健康人尿液150-200毫升，采用无菌塑料瓶密封后送回实验室；
步骤(二)：500u/ml双抗的pbs，400×g10分钟充分漂洗3遍；
步骤(三)：接种在预用1%明胶铺底的24孔板中；
步骤(四)：加入2毫升regm培养基中，放置在37℃下，5%co2的饱和湿度的培养箱内培养；
步骤(五)：隔天半量换液，48h后全量换液，以后每两天换液1次；5-9天能在显微镜下观察到贴壁肾脏干细胞，半量换液后继续培养，三天后换液，肾脏干细胞已经能稳定生长，每三天换液一次，至肾脏干细胞生长铺满瓶底，即可进行传代；
步骤(六)：传代时去除培养基，用pbs缓冲液洗涤贴壁肾脏干细胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-edta，在37℃条件下作用3-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁肾脏干细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将肾脏干细胞悬液转移到50ml离心管中，在1000rpm下离心3-8min，弃上清，用适量l-dmem培养基重悬肾脏干细胞，传代比例为1:2，置于37℃、5%co2孵箱中培养；
步骤(七)：取出对数生长期的肾脏干细胞上清液，ps（磷脂酰丝氨酸）亲和法，将ps与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的ps。
本发明所使用的方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高，由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射，在-20℃下长期保存。
采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：
它能克服现有技术的弊端。具有取材容易、少量组织即可获取大量肾脏干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，并且它取材来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，它的培养过程较为简单，操作容易，适合在医疗业中肾病治疗中使用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本具体实施方式采用以下技术方案：一种肾脏干细胞外泌体制备方法，它包含如下步骤：
步骤一：无菌条件下取健康人尿液150-200毫升，采用无菌塑料瓶密封后送回实验室；
步骤二：500u/ml双抗的pbs，400×g10分钟充分漂洗3遍；
步骤三：接种在预用1%明胶铺底的24孔板中；
步骤四：加入2毫升regm培养基中，放置在37℃下，5%co2的饱和湿度的培养箱内培养；
步骤五：隔天半量换液，48h后全量换液，以后每2d换液1次，约7天左右能在显微镜下观察到贴壁肾脏干细胞，半量换液后继续培养，三天后换液，肾脏干细胞已经能稳定生长，每三天换液一次，至肾脏干细胞生长铺满瓶底，即可进行传代；
步骤六：传代时去除培养基，用pbs缓冲液洗涤贴壁肾脏干细胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-edta，在37℃条件下作用3-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁肾脏干细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将肾脏干细胞悬液转移到50ml离心管中，在1000rpm下离心3-8min，弃上清，用适量l-dmem培养基重悬肾脏干细胞，传代比例为1:2，置于37℃、5%co2孵箱中培养；
步骤七：取出对数生长期的肾脏干细胞上清液，ps（磷脂酰丝氨酸）亲和法，将ps与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的ps；该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高；由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射，在-20℃下长期保存。
本发明能克服现有技术的弊端。具有取材容易、少量组织即可获取大量肾脏干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，并且它取材来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，它的培养过程较为简单，操作容易，适合在医疗业中肾病治疗中使用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。