制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法与流程

文档序号：11570379阅读：440来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法，特别涉及一种用酵母菌制备具有聚体结构和糖基化修饰的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法。

背景技术：

埃博拉病毒是一种单股负链的rna病毒，基因组全长大约19k，全基因组可编码np，vp35，vp40，gp，vp30，vp24和l蛋白7种蛋白质。其中vp40基质蛋白是埃博拉病毒基质中丰度最高的蛋白质，其主要作用是参与病毒骨架的形成，在病毒在宿主细胞中的组装及释放过程中vp40基质蛋白发挥重要作用，其主要的特点就是可以发生自体寡聚化作用，且二聚体是其寡聚作用的基础单元。埃博拉病毒的包膜糖蛋白gp是病毒粒子唯一的表面蛋白，在病毒入侵的过程中发挥着重要的作用，同时也是中和抗体主要的作用靶标。ebov-gp蛋白是一个高度糖基化修饰的蛋白，其糖基化修饰主要集中在glycancap和mucinlikedomain(mld)两个区域，glycancap和mld覆盖于gp蛋白的表面，与病毒粒子的躲避免疫系统的攻击相关，在病毒入侵的过程中由组织蛋白酶b/l切除glycancap和mld两个高度糖基化修饰的糖帽暴露其受体结合区(rbd)，从而介导病毒的入侵。gp蛋白由gp1和gp2两个亚基构成，gp2亚基的主要功能是跨膜、内部融合肽介导与宿主膜融合以及gp蛋白三聚体的形成，gp1亚基主要由信号肽序列sp、rbd、glycancap和mld构成。目前，对于埃博拉病毒蛋白类疫苗的研究主要集中在基于埃博拉病毒糖蛋白gp的亚单位疫苗研究以及基于gp、vp40/gp、np、vp40的病毒样颗粒疫苗研究，而对于将gp蛋白中相关保护性抗原区段与埃博拉病毒基质蛋白vp40融合表达的研究还未见报导。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种制备具有聚体结构和糖基化修饰的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法。本发明中所述的埃博拉病毒糖蛋白均为埃博拉病毒的包膜糖蛋白(gp)。

本发明所提供的方法，可包括如下步骤：

(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；

(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；

所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的n末端后得到的重组蛋白。

获得编码所述博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体基因的方法具体可为全基因合成法、pcr融合法或分片段缺失后片段融合法。

其中，所述酵母可以为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母等。在本发明的一个实施例中，所述酵母具体为毕赤酵母gs115。

其中，所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体基因可以是在苏丹型埃博拉病毒(sudanebolavirus)gp蛋白基因和vp40基因、扎伊尔型埃博拉病毒(zaireebolavirus)gp蛋白基因和vp40基因、科特迪瓦型埃博拉病毒(coted’ivoireebolavirus)gp蛋白基因和vp40基因、本迪布焦埃博拉病毒(bundibugyoebolavirus)gp蛋白基因和vp40基因、雷斯顿型埃博拉病毒(restonebolavirus)gp蛋白基因和vp40基因。

当然，将本发明的方法用于与埃博拉病毒关系密切的马尔堡病毒(marburgvirus)也属于本发明的保护范围。

在步骤(2)中，进行所述培养的过程中，还包括向培养体系中加入体积百分比为0.5％的甲醇的步骤，目的是为了诱导所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的表达。每12小时加入一次甲醇，持续到72小时止。

在步骤(2)中，进行所述破碎的方法可为物理方法、生物方法或化学方法。

其中，所述物理方法具体可为高压匀浆法、玻璃珠震荡法或球磨法；所述生物方法具体可为酶消化裂解法；所述化学方法具体可为碱裂解法。

在步骤(2)中，进行所述破碎后还包括加入去污剂，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白的粗提液的步骤。

其中，所述去污剂了为离液剂、非离子型去污剂、弱离子型去污剂或两性离子去污剂。所述离液剂具体可为尿素或硫脲；所述非离子型去污剂具体可为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；所述弱离子型去污剂具体可为脱氧胆酸盐；所述两性离子去污剂具体可为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-1-烷磺酸。

在本发明的一个实施例中，具体为向破碎后的体系中加入终浓度为如下的各物质：8m尿素、50mmph8.0的磷酸盐缓冲液、500mmnacl、10mm咪唑和5％(体积百分含量)的甘油。

在步骤(2)中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤。

在本发明中，所述纯化具体为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析。

其中，所述亲和层析介质具体可为chelatingfastflow或ni-nta；所述凝胶排阻层析介质具体可为sephadexg25、superdex200或superose6凝胶预装柱；所述离子交换层析具体可为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述阳离子交换层析介质具体可为source30s、sepharosefastflowsp或cmfastflow；所述阴离子交换层析介质具体可为source30qfastflow。

在本发明的一个实施例中，进行所述亲和层析时，采用的介质具体为chelatingfastflow；采用的柱平衡液(a液)组成如下：6m尿素、500mmnacl、50mmph7.5的磷酸盐缓冲液、10mm咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；采用的洗脱液(b液)组成如下：6m尿素、500mmnacl、50mmph7.5的磷酸盐缓冲液、500mm咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。所用洗脱梯度为：(1)5％所述b液和95％所述a液，(2)50％所述b液和50％所述a液，(3)100％所述b液，％表示体积百分含量。目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白)所在的梯度洗脱液为50％b洗脱液(即50％所述b液和50％所述a液)。

在本发明一个实施例中，进行所述凝胶排阻层析时，采用的介质具体为sephadexg25；流动相组成如下：20mmph6.5的磷酸盐缓冲液、6m尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。

在本发明的一个实施例中，进行的所述离子交换层析具体为阳离子交换层析，所采用的介质具体为source30s；采用的平衡液(a液)组成如下：20mmph6.5的磷酸盐缓冲液、6m尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；采用的洗脱液(b液)组成如下：20mmph6.5的磷酸盐缓冲液、6m尿素、5％(体积百分含量)的甘油，和1mnacl，余量为水。所用洗脱梯度为：(1)15％所述b液和85％所述a液，(2)30％所述b液和70％所述a液，(3)50％所述b液和50％所述a液，(4)100％所述b液，(5)100％0.5mnaoh，％表示体积百分含量。目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白)主要所在的梯度洗脱液为15％b洗脱液(即15％所述b液和85％所述a液)。

步骤(1)中，所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的氨基酸序列为如下(a1)-(a5)中任一：

(a1)序列表中序列8的第33-637位(不含6his标签，成熟多肽)；

(a2)序列表中序列8的第33-649位(c端有6his标签，成熟多肽)；

(a3)序列表中序列8的第1-637位(不含6his标签，原肽)；

(a4)序列表中序列8的第1-649位(c端有6his标签，原肽)；

(a5)将(a1)-(a4)任一限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；

其中，序列8的第1-32位为信号肽。

在步骤(1)中，编码所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因可为如下(b1)-(b4)中任一所示dna分子：

(b1)序列表中序列7的第1-1950位所示dna分子；

(b2)序列表中序列7的第97-1950位所示dna分子；

(b3)序列表中序列7的第1-1911位所示dna分子；

(b4)序列表中序列7的第97-1911位所示dna分子；

(b5)在严格条件下与(b1)-(b4)任一限定的dna分子杂交且编码所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的dna分子；

(b6)与(b1)-(b5)任一限定的dna序列具有90％以上同源性且编码所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的dna分子。其中，(b3)和(b4)所示dna分子不含有6his标签的编码基因；(b1)和(b2)所示dna分子在3’端有6his标签的编码基因。

本发明中，序列1、3、5、7所示基因是按照毕赤酵母偏好密码子进行密码子优化后的基因。

利用以上方法制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白也属于本发明的保护范围。

采用该方法制备获得的埃博拉病毒糖蛋白突变体具有聚体结构且拥有糖基化修饰。

进一步，本发明中制备得到的所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的氨基酸序列具体为如下(a1)-(a5)中任一：

(a1)序列表中序列8的第33-637位(不含6his标签，成熟多肽)；

(a2)序列表中序列8的第33-649位(c端有6his标签，成熟多肽)；

(a3)序列表中序列8的第1-637位(不含6his标签，原肽)；

(a4)序列表中序列8的第1-649位(c端有6his标签，原肽)；

(a5)将(a1)-(a4)任一限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；

其中，序列8的第1-32位为信号肽。

如下(a)或(b)所述的应用也属于本发明的保护范围：

(a)所述“编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因”和酵母在制备所述埃博拉病毒糖蛋白突变体中的应用；

其中，所述酵母可为毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母具体为毕赤酵母gs115。

(b)所述埃博拉病毒糖蛋白突变体在制备埃博拉出血热预防用疫苗中的应用。

本发明还保护下述任一生物材料：

a)蛋白质，其氨基酸序列为如下(a1)-(a5)中任一：

(a1)序列表中序列8的第33-637位(不含6his标签，成熟多肽)；

(a2)序列表中序列8的第33-649位(c端有6his标签，成熟多肽)；

(a3)序列表中序列8的第1-637位(不含6his标签，原肽)；

(a4)序列表中序列8的第1-649位(c端有6his标签，原肽)；

(a5)将(a1)-(a4)任一限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；

b)编码a)中所述蛋白质的基因；

c)含有b)中所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

进一步，所述基因为如下(b1)-(b6)中任一所示dna分子：

(b1)序列表中序列7的第1-1950位所示dna分子；

(b2)序列表中序列7的第97-1950位所示dna分子；

(b3)序列表中序列7的第1-1911位所示dna分子；

(b4)序列表中序列7的第97-1911位所示dna分子；

(b5)在严格条件下与(b1)-(b4)任一限定的dna分子杂交且编码所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的dna分子；

所述生物材料在制备埃博拉出血热预防用疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明旨在以埃博拉病毒基质蛋白vp40载体蛋白融合展示剔除gp1的mld后保留的gp1蛋白核心区(gp1core)，从而为该病毒亚单位疫苗的开发提供新的途径。实验证明，采用该方法制备获得的埃博拉病毒糖蛋白突变体具有聚体结构且拥有糖基化修饰。本发明具有工程菌株构建周期短、培养周期短、培养条件简单、成本低、适宜于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可以进行蛋白质翻译后修饰加工这些典型的特点，使得在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产成为可能。

附图说明

图1为ebov-gp1corefusionvp40表达质粒构建图。左图为ebov-gp1core片段和ebov-vp40片段获取的图；右图为ebov-gp1core片段和ebov-vp40片段融合后pcr结果图。

图2为westernblot鉴定阳性表达菌株结果图。左图为利用特异性抗gp蛋白抗体做westernblot结果图；右图为利用特异性抗vp40蛋白抗体做westernblot结果图。

图3为chelatingffni亲和层析粗纯化ebov-gp1corefusionvp40蛋白色谱图。

图4为chelatingffni亲和层析粗纯化ebov-gp1corefusionvp40蛋白鉴定图。左图为sds-page考马斯亮蓝染色图，右图为westernblot结果图。箭头处为目的蛋白。

图5为chelatingffni亲和层析50％b洗脱液用sephadexg25脱盐色谱图。

图6为source30s阳离子交换层析精细纯化ebov-gp1corefusionvp40蛋白色谱图。

图7为source30s阳离子交换层析精细纯化ebov-gp1corefusionvp40蛋白sds-page考马斯亮蓝染色图。

图8为source30s阳离子交换层析15％b2洗脱液蛋白电泳和westernblot检测鉴定结果图。左图为westernblot结果图，右图为sds-page考马斯亮蓝染色图。箭头处为目的蛋白。

图9为ebov-gp1corefusionvp40蛋白pngasef酶切分析。左图为sds-page考马斯亮蓝染色图，右图为westernblot结果图。

图10为ebov-gp1corefusionvp40蛋白superdex200凝胶柱分离。左图为westernblotantigp结果图；右图为sds-page考马斯亮蓝染色结果图。

图11为superose6凝胶柱分离样品westernblot分析结果图。

图12为superose6凝胶柱分离样品蛋白电泳分析结果图。

图13为superose6凝胶柱分离440kd蛋白标准品色谱图。

图14为superose6凝胶柱分离igg标准品(150kd)色谱图。

图15为superose6凝胶柱分离bsa蛋白标准品(67kd)色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

ppicz-αa质粒为invitrogen公司产品；毕赤酵母gs115为invitrogen公司产品；ebov-gpantibody，rabbitpab为北京义翘神州生物科技有限公司产品；ebov-vp40antibody，rabbitpab为北京义翘神州生物科技有限公司产品；goatantirabbitigg(h+l)x-adsorbed-hrp为sigma公司产品；goatpabtohumanigg(h+l)hrp为abcam公司产品；humanigg标准品为北京欣经科生物科技有限公司产品，bsa标准品为sigma公司产品；bstbi、bglii、bamhi、sali、noti等限制性内切酶为neb公司产品；q5热启动高保真dna聚合酶为neb公司产品；t4-dna连接酶为neb公司产品；碱性磷酸酶ciap为neb公司产品；infusion连接试剂盒为clonetech公司产品；pngasef肽n-糖苷内切酶f为neb公司产品。

实施例1、埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体表达载体的构建

一、埃博拉病毒糖蛋白基因以及基质蛋白基因的获取

通过人工合成的方式，合成了ebov-gp蛋白全长基因和ebov-vp40蛋白全长基因(>km034549|zaire_ebolavirus_isolate_hsapiens-wt/sle/2014/manoriver-em095b_|homo_sapiens|01-jun-2014)，并按照毕赤酵母偏好密码子进行密码子优化，同时在合成ebov-gp基因时为了合成得到能够表达全长的gp蛋白的基因，人为的在其发生rna编辑的位置加入了一个“a”，合成工作委托给南京金瑞斯生物科技有限公司进行合成。其中，ebov-gp蛋白全长基因如序列表中序列1所示；ebov-vp40蛋白全长基因如序列表中序列5所示。

二、埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体表达载体的构建

1、设计并合成引物：

2、ebov-gp1core核心区片段、ebov-vp40片段的获取

以南京金斯瑞公司合成返回的质粒作为模板(当然也可以以序列1为模板)，以gp-infu5和gp1δmld-vp40-infumediater为上下游引物，用q5热启动超保真dna聚合酶pcr扩增ebov-gp1core核心区片段，其核苷选序列为“5'-atcaaaaaacaactaattattcgaaacg+序列3+cgtagagtcatcttgcccac-3'”。

以金斯瑞公司合成返回的质粒作为模板(当然也可以以序列5为模板)，以gp1δmld-vp40-infumediatef和vp40-infu3为上下游引物，用q5热启动超保真dna聚合酶pcr扩增ebov-vp40片段，其核苷酸序列为“5'-tgagttttactgcagtttcc+序列5的第4-978位+ggtggtggtggtggtgtcgaccatcatcatcatcatcat-3'”。

pcr扩增获得的产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离(图1中左图)，利用离心柱型的dna片段回收试剂盒进行片段回收。

3、用限制性内切酶bstbi、sali酶切ppicz-αa质粒，得到线性化ppicz-αa质粒。

4、infusion试剂盒连接步骤2获得的ebov-gp1core核心区片段、ebov-vp40片段和步骤3获得的线性化ppicz-αa质粒，得到重组质粒，将其命名为ppicz-gp1corefusionvp40。以ppicz-gp1corefusionvp40为模板，以gp-infu5和vp40-infu3为上下游引物，pcr扩增获得的产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离结果如图1中右图所示，目的条带大小与预期相符。

将ppicz-gp1corefusionvp40测序，该重组质粒为将序列表中序列7所示的含有埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的dna分子(ebov-gp1corefusionvp40)插入ppicz-αa载体aox1启动子之后得到的重组载体。

实施例2、埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的表达、纯化及鉴定

一、重组酵母的构建和筛选

将实施例1构建好的表达质粒ppicz-gp1corefusionvp40约10μg用限制性内切酶bglii进行单点线性化，酶切体系(50μl)如下：表达质粒picz-gp1corefusionvp4043μl；bglii2μl；10×neb3.1buffer5μl。

37℃酶切1h后取样，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，分析质粒是否线性化完全。分离结果显示线性化完全的酶切产物用离心柱型的dna片段回收试剂盒进行片段回收，最后洗脱线性化的质粒时用30μl纯水洗脱。

以下步骤中制备酵母电转化感受态细胞的方法参照invitrogen公司的相关操作手册和“molecularcloning，alaboratorymanual(fourthedition)”，2012coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork。

将毕赤酵母gs115划线于ypd平板上复苏，分离单克隆。挑取复苏的单克隆，接种到ypd液体培养基中，试管培养至其对数期后取1ml转接到100mlypd摇瓶中25℃200rpm摇床培养至od600nm≈1.3-1.5。以上摇瓶培养的培养液1500g4℃离心5min弃上清，用等体积的预冷的蒸馏水重悬后1500g4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次。再用等体积的预冷的1m山梨醇重悬后1500g4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次。以上经3次蒸馏水和3次山梨醇洗涤的菌体沉淀，添加适量的1m山梨醇至刚好能吸起来后，100μl每只分装到无菌离心管中，-80℃保存。

线性化的重组质粒电转酵母。取一只制备好的酵母感受态细胞，置冰上放置5min左右，待溶解后取80μl的感受态细胞与20μl上一步线性化得到的质粒进行预混后转入预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min。按照酵母电转手册要求，2kv电压电击后迅速加入900μl预冷的1m山梨醇，转入一只洁净试管中，置25℃培养箱中静置2小时。之后再加入1ml无抗生素添加的ypd液体培养基，置25℃，200rpm摇床培养3-4小时。将以上摇床培养得到的菌液，取300μl涂布于筛选抗性为zeocin的ypd平板，25℃温箱倒置培养60-72h。

待所涂平板长出单克隆后，随机挑取8个单克隆穿刺接种至新的ypd/zeocin的平板上，25℃温箱倒置培养。待穿刺菌落长出来后，接种至3ml的ypd液体培养基中，25℃，200rpm摇床培养，待ypd菌液长浓后，按照5％(体积百分含量)的接种量转接到3mlbmgy(配方：酵母抽提物10g/l，胰蛋白胨20g/l，100mmph6.0的磷酸盐缓冲液，13.4g/l的ynb，4×10^-4g生物素/l，1％甘油)，培养基中25℃200rpm摇床培养，48小时后每12小时补加一次甲醇(补加量为0.5％，体积百分含量)。诱导72h后，12000rpm，3min收集菌体。

以上经72小时甲醇诱导后所收集的菌体，加1/5体积的水和适量的玻璃珠，漩涡震荡破碎，破菌液4000rpm，2min离心取上清利用抗ebov-gp蛋白的特异性抗体和抗ebov-vp40蛋白的特异性抗体，westernblot筛选出能够表达目的蛋白的阳性克隆。

westernblot步骤大致如下：(1)10％的sds-page胶分离样品；(2)将sds-page胶上的样品转印到pvdf膜上；(3)5％的牛奶封闭液封闭转印有目的蛋白的pvdf膜，室温封闭1小时；(4)转到用5％的牛奶以1:4000的稀释度稀释一抗(ebov-gpantibody，rabbitpab/ebov-vp40antibody，rabbitpab)孵育2小时；(5)pbst洗涤5min，清洗5次；(6)转到用5％的牛奶以1:10000的稀释度稀释二抗(goatantirabbitigg(h+l)x-adsorbed-hrp)孵育1小时；(7)pbst洗涤5min，清洗5次；(8)添加pro-lighthrpchemiluminescentkit，显色。检测到分子量大小约为95kd的特异性条带即为阳性克隆，如图2(左图为antigp印迹图；右图为antivp40印迹图)。

二、重组埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的表达和纯化

1、重组酵母菌培养表达

挑取步骤一鉴定得到的阳性克隆接种到ypd液体培养基中，25℃，200rpm培养约48小时。再转接至ypd液体摇瓶培养基100ml中，接种量为1％(体积百分含量)，25℃，200rpm培养至菌密度od600nm＞10。以上培养得到的od600nm＞10的菌液，以5％(体积百分含量)的接种量转接到bmgy培养基(配方同上)中，25℃，200rpm培养24小时后加入体积百分比为0.5％的甲醇诱导目的蛋白的表达，每12小时诱导一次，诱导72小时候离心收集菌体。

2、埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体重组蛋白的纯化

(1)取经甲醇诱导72小时，摇瓶培养的菌液1l，8000rpm离心20min收集菌体。用300ml纯水重悬菌体，高压均质仪以600bar的压力匀浆3次，取得的匀浆液中补加8m尿素、50mmph8.0的磷酸盐缓冲液、500mmnacl、10mm咪唑和5％(体积百分含量)的甘油(其中各物质的浓度为在匀浆体系中的终浓度)，室温搅拌溶解3小时，12000rpm离心20min后取上清。

(2)对以上溶解上清调ph7.5后用chelatingfastflow层析介质鳌合ni亲和层析进行粗纯化。纯化所用柱平衡液(a液)：6m尿素、500mmnacl、50mmph7.5的磷酸盐缓冲液、10mm咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；洗脱液(b液)：6m尿素、500mmnacl、50mmph7.5的磷酸盐缓冲液、500mm咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。所用洗脱液由a液和b液组成，洗脱梯度为5％b、50％b和100％b，％表示体积百分含量。

结果如图3、图4(图3为色谱图，图4左为还原型sds-page蛋白电泳结果，右为利用抗ebov-gp蛋白的特异性抗体westernblot检测埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体糖蛋白的结果)所示，可见目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白)所在的梯度洗脱液为50％b洗脱液。

(3)步骤(2)中检测到富集有目的条带的50％b梯度洗脱样品利用sephadexg25脱盐处理，所用流动相为20mmph6.5的磷酸盐缓冲液、6m尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。收集蛋白洗脱峰。色谱图如图5。

(4)经sephadexg25脱盐处理得到的样品，再经一步source30s阳离子交换层析进行进一步的纯化。纯化所用柱平衡液(a液)：20mmph6.5的磷酸盐缓冲液、6m尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；洗脱液(b液)：20mmph6.5的磷酸盐缓冲液、6m尿素、5％(体积百分含量)的甘油和1mnacl，余量为水。按照以下梯度进行梯度洗脱，所用洗脱梯度为：1)15％所述b液和85％所述a液，2)30所述b液和70％所述a液，3)50％所述b液和50％所述a液，4)100％所述b液，5)100％0.5mnaoh，％表示体积百分含量。结果如图6、图7(图6为色谱图，图7为还原型sds-page蛋白电泳图)，根据电泳条带分子量大小，确定目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白)主要所在的梯度洗脱液为15％b洗脱液洗脱的第一个主峰里(图6、图7所示15％b2)。利用抗ebov-gp蛋白的特异性抗体westernblot检测证实纯化得到的条带确为埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白，结果如图8所示(左图为westernblot结果图，右图为sds-page考马斯亮蓝染色图)。

3、埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白的鉴定

(1)糖基化修饰鉴定

用pngasef酶切处理可用来分析糖基切除前后蛋白的分子量变化，pngasef酶切可以分析步骤2(4)制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白，具体步骤如下：取步骤2(4)中纯化得到的糖蛋白样品90μl，加入10μl的10×糖蛋白变性缓冲液，沸水浴10min使糖蛋白充分变性。然后，在含有1％(体积百分含量)np40的1×nebglycobuffer2反应缓冲液中，37℃水浴酶切2小时，同时设置不加酶的对照组。

具体酶切体系如下：

将酶切处理后的样品进行还原sds-page检测，结果如图9所示(左为考马斯亮蓝染色，右为westernblot检测)。

图9中，pngasef代表肽n-糖苷酶f；ebov-gp1corefusionvp40+pngasef代表步骤2(4)制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白用pngasef酶切处理；ebov-gp1corefusionvp40代表步骤2(4)制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白未做酶切处理的阴性对照；marker代表蛋白分子量标志物。图9表明制备得到的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白未用pngasef酶切时分子量约为95-100kd，pngasef酶切处理后分子量下降为约70kd，与未被糖基化的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体成熟蛋白理论分子量(71344da)一致。说明制备得到的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白是被糖基化修饰的糖蛋白。

(2)聚体形式测定

步骤2(4)制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白样品，利用透析脱盐脱尿素进行蛋白复性，这里采用的是梯度透析的方式来进行所用梯度分别为：含4m尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水；含3m尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水；含2m尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水；含1m尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水；最终透析至不含尿素，含5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水中。

天然状态下gp蛋白是以三聚体的形式存在的，gp蛋白聚体形式的形成主要依赖gp2亚基上的七肽重复区形成的。而在本处选用的是不包含七肽重复区的gp1core区作为研究对象。同时，为了实现gp1core区作为保护性抗原的聚体展示，选用了埃博拉病毒基质内丰富度最高的蛋白质vp40来展示gp1core核心区，基质蛋白vp40蛋白的一大特性就是其自我寡聚功能，在天然状态下vp40蛋白首先形成一个二聚体的结构之后再在此基础上形成诸如六聚体、八聚体的结构并最终形成病毒的骨架结构。为了验证以上得到的重组目的蛋白是否也形成了聚体结构，所以选用superdex200型凝胶柱(φ1.0×30cm)对纯化得到的样品进行分离分析鉴定。所用流动相为含有5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水。在对埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白进行分离时加入人igg标准品和bsa标准品作为内参。从第6ml开始收集洗脱液，以1ml为一段，分段收集。收集得到的样品利用sds-page和蛋白印迹进行分析，结果如图10所示，结果显示目的蛋白的洗脱在第8-13ml且主要集中于第9-11ml中(图10中左图)。而人igg标准品主要于11-13ml洗脱液中(图10中右图)，bsa标准品主要在13-15ml被洗脱(图10中右图)。说明非变性状态下埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体重组蛋白的分子量要比分子量为150kd的igg要大。同时，结果也显示还原状态与非还原状态下埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体重组蛋白的分子量大都不变。

基于以上结果，初步认为制备得到的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体重组蛋白以聚体的形式存在。为了达到更好的分离效果，选用了更适合大蛋白和蛋白复合体纯化的更高分辨率的superose6increase凝胶过滤预装柱进行分析，所用流动相为含有5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)tween20的生理盐水。在利用superose6凝胶对纯化得到的ebov-gp1corefusionvp40蛋白进行分析时，为了验证结果聚体结构的形成与否，选用大于ebov-gp1corefusionvp40蛋白单体分子量的并且便于电泳检测的人igg标准品作为内参与ebov-gp1corefusionvp40重组蛋白混合后用superose6凝胶柱分离，分段收集洗脱液，经sds-page考马斯亮蓝染色，结果显示人igg标准品变性还原后轻重链大小分别约为26kd和55kd，其洗脱集中于15-17ml但并不终止于17ml，且其主峰位置位于15.5-16.5之间(图12)，而ebov-gp1corefusionvp40重组蛋白完全糖基化修饰后分子量约为95-100kd，其洗脱集中在14.5-16.5ml(图11)，略早于人igg标准品被洗脱，说明在非变性状态下发生完整糖基化修饰的ebov-gp1corefusionvp40重组蛋白的分子量大于人igg标准品，也就是大于其单体分子量。ebov-gp1corefusionvp40重组蛋白中发生不完全糖基化修饰后分子量约为70-80kd，其洗脱集中在15.5-17ml，且主要位于16-16.5ml(图11)，与人igg标准品的洗脱主峰位置正好重叠，说明在非变性状态下发生不完整糖基化修饰的ebov-gp1corefusionvp40重组蛋白的平均分子量与igg标准品相近，也大于其单体分子量。同时为了更直观的判断ebov-gp1corefusionvp40重组蛋白在非变性状态下的分子量大小，分别以440kd蛋白标准品、人igg(150kd)和bsa(67kd)为外标测定其洗脱体积(ve)。结果如图14，结果显示人igg(150kd)标准品的ve＝16.11ml与上述电泳的结果相吻合。同样的测得440kd蛋白标准品和bsa(67kd)标准品的ve分别为14.65ml(图13)和16.98ml(图15)。这与上述凝胶分离后电泳及印迹检测的结果相呼应，说明制备得到的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体重组蛋白以聚体的形式存在。

基于以上结果，表明我们所纯化得到的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白(ebov-gp1corefusionvp40)，主要以聚体的形式存在。

由于采用本发明方法制备获得的埃博拉病毒糖蛋白突变体具有聚体结构且拥有糖基化修饰，因而其具有作为埃博拉出血热预防用疫苗的潜质。且本发明方法具有工程菌株构建周期短、培养周期短、培养条件简单、成本低、适宜于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可以进行蛋白质翻译后修饰加工这些典型的特点，使得在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产成为可能。

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所；安徽大学

<120>制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法

<130>gncln170890

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<170>patentinversion3.5

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