调控水稻抗飞虱基因BGIOSGA015651及其应用的制作方法

文档序号：11570375阅读：401来源：国知局

本发明属于分子生物学和农业领域，具体涉及调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651及其应用。

背景技术：

随着人类进入后基因组时代，全面开展功能基因组研究已成为生命科学研究的前沿领域。由于水稻的转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而被视做模式植物。目前，水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，进一步对水稻功能基因进行研究，对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

目前世界上有超过一半的人以水稻为主食。粮食安全问题，是全世界人民面临的挑战。20世纪50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大幅度提高。但近几十年来水稻受到大面积的病虫危害，使水稻生产受到威胁。褐飞虱(nilaparvatalugens)是我国水稻生产中的主要害虫，其成虫和若虫以口针刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，导致减产或绝收。据中国农业年鉴记载，褐飞虱虫害在1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，危害面积达到水稻总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。

目前，褐飞虱已经成为我国水稻生产中的第一大虫害，对我国粮食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。又由于连年大量施用化学杀虫剂，褐飞虱的抗药性成倍增加，药剂防治的效果十分有限。同时，使用化学杀虫剂防治褐飞虱，不但会增加农民的生产成本，还会造成对非目标生物的毒杀、对环境和粮食的污染等环境和生态问题。

利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。国际水稻研究所(irri)的研究结果和东南亚的水稻生产实践证明，即使是只有中等抗性水平的水稻品种，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成实际的危害和产量损失。因此，挖掘水稻抗褐飞虱基因并在水稻育种项目中加以应用，是防治水稻褐飞虱的根本措施。

自20世纪60年代始，褐飞虱的抗性遗传和育种研究就已经开始进行，但是随着新生物型(或新致害型)的出现，抗虫品种面临着使用寿命缩短、抗性丧失的风险。例如国际水稻研究所于1973年推出具有bph1基因的品种ir26，经过2-3年后即出现能致害的生物型2；1977-1978年推出具bph2抗性基因的品种ir36和ir42，结果1982年相继在一些国家出现了褐飞虱新的生物型，不得不在1983年又培育出相应的新抗性品种ir56和ir64。而且以前常见的高抗水稻品种的抗性水平相当一部分已经降到中抗甚至到了感虫的级别。

除了褐飞虱，危害水稻的飞虱的常见种类还有白背飞虱(sogatellafurcifera)和灰飞虱(laodelphaxstriatellus)，其中，褐飞虱有远距离迁飞习性，是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫。白背飞虱全国所有稻区均有发生。白背飞虱除直接刺吸汁液外，还是水稻病毒病的主要传播媒介。现有技术中所研发的某些抗性水稻品种主要是针对褐飞虱具有抗性，而对白背飞虱的抗性不明确或没有抗性，影响了这些抗性水稻品种的适用范围。

因此，继续深入筛选与研究抗源材料、寻找新的抗性基因，并对其相关基因进行定位与克隆，研发新的能在广泛地区适用的、具有高抗性基因材料的水稻品种，具有非常重大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651，其核苷酸序列如seqidno：1，或seqidno：2所示，或与seqidno：1或seqidno：2至少90％以上相同的同源序列。

调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651的cdna，其序列如seqidno：3，或seqidno：4所示，或与seqidno：3或seqidno：4至少90％以上相同的同源序列。

调控水稻抗飞虱蛋白，其氨基酸序列如seqidno：5，或seqidno：6所示。

编码上述所述水稻抗飞虱蛋白的核苷酸序列。

优选的，该核苷酸序列选自seqidno：1-4，或序列seqidno：1-4经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651在培育抗飞虱水稻中的应用，所述基因bgiosga015651的核苷酸序列选自seqidno：1，seqidno：2，与seqidno：1或/和seqidno：2至少90％以上相同的同源序列，seqidno：3，seqidno：4，与seqidno：3或/和seqidno：4至少90％以上相同的同源序列。

所述调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651，定位于籼稻(oryzasativaindica)基因组第四染色体2,507,775–2,510,316位置，全长为2542bp。

优选的，所述飞虱包括褐飞虱和白背飞虱。

一种提高水稻抗飞虱性能的方法，敲除或降低上述所述的bgiosga015651基因的表达量从而提高水稻抗飞虱性状。

所述bgiosga015651基因为调控水稻抗飞虱基因，其核苷酸序列如seqidno：1，或seqidno：2所示，定位于籼稻(oryzasativaindica)基因组第四染色体2,507,775–2,510,316位置，全长为2542bp。

优选的，通过分子育种方法或基因工程的方法，敲除或降低bgiosga015651基因的表达量。

优选的，基因工程方法包括rna干扰和基因编辑。

优选的，所述飞虱包括褐飞虱和白背飞虱。

本发明的有益效果是：

本发明申请人通过对褐飞虱具有稳定抗性的水稻品种bg1222和感虫水稻品种tn1的研究找到一种调控水稻抗飞虱的基因并进行了测序，记名为bgiosga015651。抗虫品种与感虫品种相比bgiosga015651的基因表达量存在显著差异。在抗虫品种bg1222中bgiosga015651的表达量比感虫水稻品种tn1的表达量低数百倍以上。无论是否受到褐飞虱吸食，bg1222中的bgiosga015651的表达量都远低于tn1的表达量。之前发现的抗飞虱基因需要有表达甚至要高表达才能有抗虫性的表现，而本发明中调控水稻抗飞虱的基因bgiosga015651在bg1222中是极低表达、或不表达(基因敲除)的情况下，即可具有良好的抗虫性。

杂交f2后代验证表明bgiosga015651的表达量与水稻抗虫性成负相关(表达量越低抗虫性越强)。后代中抗虫性越强，其抗性分数值(grade)越小相对应bgiosga015651的表达量越低。

通过基因编辑技术敲除(knockout)bgiosga015651基因，使bgiosga015651基因在tn1中没有任何表达，这样感虫水稻品种tn1就获得与水稻品种bg1222一样的高抗抗虫性。对褐飞虱与白背飞虱表现高抗性等级。其中，bgiosga015651基因未敲除前，感虫水稻品种tn1的抗性级别为9级，bgiosga015651基因敲除后，其抗性级别显著提高到0级-1级(高抗性等级)。而申请人对以前的抗性品种进行苗鉴发现，它们的抗虫性丧失厉害。目前mudgo(含有bph1)的平均抗性级别5.4级，asd7(含有bph2)的平均抗性级别8.89级，rathuheenati(含有bph3)的平均抗性级别4.61级，babawee(含有bph4)的平均抗性级别8.14级，而抗虫品种bg1222的平均抗性级别是1.07级。通过对比可以发现，本发明所公开的调控水稻抗飞虱的基因bgiosga015651在水稻育种以及提高水稻抗飞虱抗性的应用中将具有重大意义。

本发明的水稻调控抗飞虱的基因bgiosga015651可在水稻育种中应用。通过分子育种方法或基因工程的方法，降低或敲除该蛋白编码基因的表达可导致感虫植株具有高抗抗虫功能，从而可以培育高抗飞虱(抗褐飞虱与白背飞虱)植物。因此，本发明所述基因及其编码蛋白可以应用于植物遗传改良。

由于本发明的水稻调控抗飞虱的基因bgiosga015651对于褐飞虱与白背飞虱同样有效，而对于灰飞虱的抗虫性还在研究中。由于褐飞虱有远距离迁飞习性，是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫，不过不能在北纬25℃以北的稻区越冬。而白背飞虱在全国所有稻区均有发生(我国南至海南岛，北至黑龙江各稻区，东南亚各国均有分布)。所以本技术用于育种的水稻可在各地广泛的水稻种植地区进行推广，具有很高的经济价值与突出的生态效益。

附图说明

图1为受到褐飞虱吸食后的水稻品种bg1222和tn1的bgiosga015651表达量时间序列变化；

图2为杂交f2后代中bgiosga015651的表达量与水稻抗虫性分数值的关系。

具体实施方式

褐飞虱是危害水稻生产的主要害虫，近年来由于褐飞虱生物型发生变异及产生抗药性等原因，褐飞虱灾害发生日趋严重。生产实践证明，利用抗性品种是最经济、安全而有效的措施。按照“标准苗盘鉴定法”对bg1222进行了多年的苗期抗虫级别检测，发现其对褐飞虱具有稳定高抗性，因此在育种上具有较高的利用价值。但是bg1222对褐飞虱有哪些关键的基因与抗虫性表现相关联，国内外至今未见文献涉及。tn1是国际公认不含任何抗虫基因的感虫水稻品种。

除了褐飞虱，危害水稻的飞虱的常见种类还有白背飞虱和灰飞虱，而我国南方主要是褐飞虱和白背飞虱危害。白背飞虱除直接刺吸汁液外，还是水稻病毒病的主要传播媒介。而bg1222对白背飞虱也有一定抗性，bg1222对白背飞虱的抗性也由发明人经过苗期抗虫级别检测确认得到，文献中并无报道。

本发明申请人通过研究对褐飞虱和白背飞虱具有稳定抗性的水稻品种bg1222和感虫水稻品种tn1，找到一种调控水稻抗飞虱的基因，记名为bgiosga015651。抗虫品种与感虫品种相比bgiosga015651的基因表达量存在显著差异。在抗虫品种bg1222中bgiosga015651的表达量比感虫水稻品种tn1的表达量低数百倍以上。无论是否受到褐飞虱吸食，bg1222中的bgiosga015651的表达量都远低于tn1的表达量。杂交f2后代验证表明bgiosga015651的表达量与水稻抗虫性成负相关(表达量越低抗虫性越强)。后代中抗虫性越强，其抗性分数值(grade)越小相对应bgiosga015651的表达量越低。利用基因编辑技术敲除bgiosga015651基因，使感虫水稻品种tn1获得与水稻品种bg1222一样的高抗抗虫性。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1抗虫品种与感虫品种相比bgiosga015651的基因表达量存在显著差异

一.水稻totalrna提取

1)水稻样品的研磨:将超低温冻结的水稻样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。可以向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的rnaisoplus。对于新鲜的组织样品，立即加入rnaisoplus，充分匀浆。将匀浆液转移至离心管中，室温(15-30℃)静置5分钟。12,000g4℃离心5分钟。小心吸取上清液，移入新的离心管中。

2)totalrna的提取:向上述的匀浆裂解液中加入氯仿(rnaisoplus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5分钟。12,000g4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含rna)、中间的白色蛋白层(大部分为dna)及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。向上清中加入0.5-1倍rnaisoplus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。12,000g4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现rna沉淀。

3)rna沉淀的清洗：小心弃去上清，切勿触及沉淀，可残留少量异丙醇。加入与rnaisoplus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500g4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。

4)rna的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的rnase-free水溶解沉淀。

二.去基因组

使用rnase-free的dnasei，按以下体系配置反应液：

37℃消化30min，65℃灭活10min。

然后按以下步骤操作：

1)加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min，取上清；

2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心10min，取上清；

3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min；

4)4℃下，10,000g离心10min，收集rna沉淀，去上清；

5)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；

6)加入10μldepc水溶解沉淀。

三.纯度检测及电泳检测

纯度检测：取2μlrna样品60倍稀释，在微量分光光度计上测定od值，od260/od280的比值大于1.8，说明制备的rna较纯，无蛋白质污染。

四.逆转录

按下列组份配制rt反应液(反应液配制请在冰上进行)。

*表示反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的totalrna。

将上述10μl反应溶液在takara-tp600pcr仪上进行反应：37℃15min；85℃5sec；4℃保温，之后-20℃保存备用。

五.定量

利用下列引物对进行bgiosga015651的基因表达量的分析，其碱基序列如下所示：

re-f：tccagagcaggaaacaaggac(seqidno：7)，

re-r：gcctacgccagcacatgaaa(seqidno：8)。

1)反应体系：

2)进行realtimepcr反应：

cfx96real-time(bio-rad)pcr仪上进行：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，40个循环。融解曲线分析：温度60℃-95℃。

结果见图1。

图1为受到褐飞虱吸食后的水稻品种bg1222和tn1的bgiosga015651表达量时间序列变化。

图1结果表明：抗虫品种与感虫品种相比bgiosga015651的基因表达量存在显著差异。在抗虫品种bg1222中bgiosga015651的表达量比感虫水稻品种tn1的表达量低数百倍甚至上千倍以上。无论是否受到褐飞虱取食(取食不同小时数)，bg1222中的bgiosga015651的表达量都远低于tn1的表达量。

实施例2bgiosga015651的基因的克隆，以及多肽分析

分别对抗虫品种bg1222以及感虫品种tn1的bgiosga015651基因进行克隆，测序和分析。

其中抗虫品种bg1222中的bgiosga015651基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示(包括外显子和内含子)，感虫品种tn1中的bgiosga015651基因，其核苷酸序列如seqidno：2所示(包括外显子和内含子)，两者之间有多处核苷酸的区别。

其中抗虫品种bg1222中bgiosga015651基因的cdna序列如seqidno：3所示；而感虫品种tn1中bgiosga015651基因的cdna序列如seqidno：4所示。

抗虫品种bg1222中bgiosga015651基因的编码蛋白如seqidno：5所示；而感虫品种tn1中bgiosga015651基因的编码蛋白如seqidno：6所示，两者之间共有16处氨基酸的区别。

实施例3抗虫品种与感虫品种进行杂交f2代

通过bg1222与tn1的杂交建立f2后代群体，其中f2后代群体的样本n＝512。从中选取了60个不同抗性分数值的个体检测，并对不同抗性级别表型的f2后代个体分别检测其bgiosga015651的表达量，以确定bgiosga015651的表达量与水稻抗虫表型的相关性。

结果见图2。

图2为杂交f2后代中bgiosga015651的表达量与水稻抗虫性分数值的关系。

图2结果表明：杂交f2后代中基因bgiosga015651的表达量与水稻抗虫性成负相关(表达量越低抗虫性越强)。后代中抗虫性越强，其抗性分数值(grade)越小相对应bgiosga015651的表达量越低。

实施例4基因敲除实验

利用基因编辑技术，在基因敲除实验(knockout)中敲除bgiosga015651基因，使感虫水稻品种tn1获得与水稻品种bg1222一样的高抗抗虫性。

一.水稻基因敲除载体的构建

根据bgiosga015651基因cdna序列，选择其前端的序列作为靶标序列，设计并合成grna(guiderna)序列(序列如下所示，但靶标序列和对应的grna序列不限于此序列。)把grna序列片段重组到包含有潮霉素抗性标签的pbwa(v)h载体(武汉伯远公司)中。利用此crispr/cas9基因组编辑载体系统，将靶标序列其中的一个碱基突变掉(删除或添加一个碱基到靶标序列上)。使bgiosga015651基因cdna序列发生移码突变，其表达的产物并不是原来的氨基酸产物，从而达到敲除bgiosga015651基因的目的。

grna序列：5'-catctctcagtgcacggct-3'(seqidno：9)；

靶标序列：5'-acatctctcagtgcacggctggg-3'(seqidno：10)。

二.通过遗传转化获取水稻基因敲除苗

1)以感虫水稻tn1的成熟胚为材料诱导愈伤组织：取培养好的农杆菌(eha105)菌液置于离心管，离心取上清，制农杆菌悬浮液；将长到一定大小的愈伤组织挑出，置于农杆菌悬浮液侵染；将愈伤组织置于共培养基上。

2)筛选：将愈伤组织取出；将晾干的愈伤转入筛选培养基上进行第一次筛选；将长有抗性愈伤的初始愈伤转导新培养基，进行第二次筛选。

3)抗性愈伤的诱导分化及生根：挑取抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿，封口膜封好，放入恒温培养室中等待分化成苗。待苗生长至1cm左右，移至生根培养基壮苗。

4)潮霉素(hyg)抗性基因的pcr检测：用潮霉素抗性基因特异引物，常规pcr法扩增检测水稻苗是否含有该基因。如果含有即为转化阳性苗。

抗性基因特异引物：

hyg-f：5'-acggtgtcgtccatcacagtttgcc-3'(seqidno：11)；

hyg-r：5'-ttccggaagtgcttgacattggga-3'(seqidno：12)。

5)阳性苗的基因敲除检测：在靶标附近设计检测引物进行pcr，之后测序，检测基因敲除情况(是否获得成功敲除的纯合苗)。获得对感虫水稻tn1的bgiosga015651基因成功敲除的纯合苗。

三.水稻基因敲除苗抗虫性鉴定

将感虫水稻tn1的bgiosga015651基因敲除的纯合苗进行苗期抗虫性鉴定。

鉴定结果是：感虫受体品种tn1的死苗率为100％，bgiosga015651基因敲除纯合苗的死苗率为0％，而且其抗性级别是0级-1级(高抗性级别)。

验证了基因bgiosga015651的表达量与水稻抗虫性成负相关的关系(表达量越低抗虫性越强)，基因bgiosga015651是水稻抗飞虱相关的重要基因。

实施例5bgiosga015651与现有抗褐飞虱基因效果的比较

本发明将感虫水稻品种tn1(抗性级别9级)的bgiosga015651基因敲除后，其抗性级别显著提高到0级-1级(高抗性级别)，和抗虫品种bg1222的抗性相当(抗性级别1.07级)，或更佳。

申请人对以前的抗性品种进行苗鉴发现，它们的抗虫性丧失厉害。目前，mudgo(含有bph1)的平均抗性级别5.4级，asd7(含有bph2)的平均抗性级别8.89级，rathuheenati(含有bph3)的平均抗性级别4.61级，babawee(含有bph4)的平均抗性级别8.14级，而抗虫品种bg1222的平均抗性级别是1.07级。

通过比较可以发现，利用本发明的水稻抗飞虱基因bgiosga015651用于水稻育种，具有良好的前景。通过分子育种方法或基因工程的方法，降低或敲除该蛋白编码基因的表达可导致感虫植株具有高抗抗虫功能，从而可以培育高抗飞虱(抗褐飞虱与白背飞虱)水稻。

实施例6bgiosga015651抗白背飞虱的效果

本发明将感虫水稻品种tn1(抗性级别9级)的bgiosga015651基因敲除后，通过苗期鉴定的方法鉴定其对白背飞虱的抗性级别。

结果是：感虫受体品种tn1的死苗率为100％，bgiosga015651基因敲除纯合苗的死苗率为0％，而且其抗性级别是0级-1级(高抗性级别)。

因此，本发明的调控水稻抗飞虱的基因bgiosga015651应用于抗白背飞虱的育种也有良好的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院植物保护研究所

<120>调控水稻抗飞虱基因bgiosga015651及其应用

<130>

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2542

<212>dna

<213>水稻（oryza.satival.）

<400>1

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<213>水稻（oryza.satival.）

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