SeZn7MT3的组成、制备方法及其在防治阿尔茨海默症中的应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及sezn7mt3的创新金属蛋白的化学组成、制备方法，及其在防治阿尔茨海默症和制备抗阿尔茨海默症等神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默症（alzheimer’sdisease,ad）,俗称老年痴呆症，是由德国学者alosialzheimer于1907年首次报道。这是一种常发于老年人群中的中枢神经系统原发性退行性疾病，目前全世界有超过五千多万例ad患者，其临床表现为不同程度的记忆力丧失，语言困难，定向力障碍，认知能力降低，人格及行为和感情活动异常，进行性智力障碍，最后全身衰竭，并发感染而亡。目前ad已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。ad最典型的病理特征是：大脑皮层和海马组织内出现大量的老年斑（senileplaques,sp）、神经纤维缠结（neurofibrillarytangles,nfts）、神经元数量减少、颗粒空泡变性和慢性神经炎症。ad的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果。迄今为止，其确切的发病机理还是一个未解之谜，但在近三十年的研究证据表明，淀粉样多肽（amyloid-betapeptide,abeta）、淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein,app）、金属硫蛋白（metallothionein,mt3）及其所参与调节的金属离子内稳态平衡与ad的发生、发展有着密切的联系。

国内外已对ad的神经病理机制进行了大量的研究。70年代中期以来，大量药理学研究集中于提高突触裂隙中的乙酰胆碱水平，发现了一系列乙酰胆碱酯酶的抑制剂类药物。然而，这种治疗仅是缓解症状的治标疗法。80年代中期以来，许多研究围绕abeta的形成、聚集以及清除机制，或abeta的神经毒性机制进行。以abeta为靶标治疗ad病的药物有abeta前体蛋白app分泌酶的抑制剂、抗abeta聚集的金属离子螯合剂和abeta的抗体等。然而，2008年lancet报道，abeta疫苗能有效地清除脑内abeta斑，但并不能阻止痴呆症状的发展。这一报道对围绕abeta斑的治疗研究提出了疑问。这些结果说明，abeta斑本身并不是神经细胞毒性的主要根源，可能的机制是，abeta斑在形成过程中产生的ros对神经细胞造成毒性。运用同步辐射x-射线荧光分析技术发现老年斑中有高浓度的金属离子聚集，如铜、铁、锌离子的含量分别高达1.0、0.4和1.0mm。大脑中这些过渡金属离子异常高浓度聚集及其相关的蛋白质（如abeta、tau蛋白等）异常聚集是多种神经退行性疾病的共有特征。因此，金属离子与神经医学高度关联的这一领域受到科学家和神经医学科学家的极大关注。大量研究报道显示：脑神经中某些过渡金属离子（cu、fe、zn）的内稳态失衡是ad病人神经元死亡的主要起因之一；脑中这些过渡金属离子，特别是能够进行单电子氧化还原的cu和fe离子的内稳态调节，以及有关的活性氧物种（ros）水平的调控很可能是治疗ad病的有效策略。

金属硫蛋白-3（metallothionein-3,mt3），也称为神经生长抑制因子（gif），在人大脑中特异性表达。mt3由68个氨基酸组成，其中就包括了20个保守的半胱氨酸。它的两个结构域含有两个金属簇，总共能够结合7个二价的金属离子。n-端beta-结构域中的m3s9和存在于c-端的alpha-结构域的m4s11。两个结构域之间通过kks三个氨基酸连接。大脑中mt3大量分布于神经星形细胞，但是在ad患者脑中，mt3的表达量明显下降约三分之一。mt3表达的受损可能与ad症状的发生或神经功能损伤有关。mt3可以将no信号转化为zn2+信号。no通过与mt3中结合zn2+的半胱氨酸直接发生s-亚硝基反应或者与s-亚硝基硫醇发生亚硝基转换反应，将zn2+从mt3中释放出来。

锌离子是大脑中的信使，大脑具有最高的锌含量，最典型的是在灰质中可达到约150μm。大脑中处于自由离子形式的锌大量富集在许多谷氨酸能神经末端（10-15%）。当锌被释放后进入突触间隙，在突触间隙内离子浓度可上升至毫摩尔数量级。和铜离子一样，释放的锌离子在突触间隙内与神经受体如nmda相互作用，同时也会作用于多种神经元离子通道及转运子来调控神经信号传导。多种锌转运蛋白（znts）以及mts等结合胞质中的zn离子，从而阻止游离的zn离子转变为有毒状态。相比于cu离子，血浆中的zn离子含量从出生后逐步下降，且ad患者的血浆中zn离子含量比同龄正常人有进一步的减少。尽管zn离子总含量与大脑年龄的老化没有关系，然后已知一些特定区域含有高浓度的zn离子，如高谷氨酸能支配的海马区，随着年龄的增长表现出zn离子含量的降低。现在的多篇文献报道，大脑补锌可能是防治老年痴呆症的有效策略之一。

金属硫蛋白mt3是神经元内部zn的主要来源，近期的研究发现，结合于mt3上的zn离子能够同abeta-cu复合物发生金属置换，从而抑制了abeta还原cu2+所产生的氧化损伤。ad脑中zn离子失衡，可能源自zn离子输出的抑制，abeta-cu还原活性产生的一种过氧化物4-hydroxynoenal（4-羟基巴比妥）被认为具有这种作用。小鼠动物研究指出，系统性zn离子的缺失引起了脑中zn离子的滞留，而这种作用是通过抑制胞内zn离子输出蛋白znt1所致。

神经突触中，mt3、abeta和铜金属离子可能形成一种动态平衡。在znt3的作用下，zn离子和谷氨酸同时聚集于前突触囊泡中，zn离子在突触间隙中浓度高达0.3mm，而nmda介导的激活使铜离子在突触后释放，转运到突触间隙，随之铜离子在突触间隙的浓度达到毫摩尔级。反过来铜和锌都可以抑制nmda受体的应答反应。abeta经淀粉样蛋白前体蛋白app酶切后释放到突触间隙后可以与间隙内的铜发生反应，然后交联形成可溶性的abeta聚集体甚至形成淀粉样沉淀。mt3由邻近的星形胶质细胞释放进入突触间隙，可以缓解这一不利反应的发生。神经金属离子、abeta、mt3在突触间隙形成一个动态平衡，这种平衡可阻止abeta在突触间隙中形成纤维沉淀。适当的神经突触活动可能会促进这一平衡系统，但是过度的或异常的神经活动可能对这一系统有害。调控脑神经[金属离子-abeta-mt3]形成有益的平衡可能是治疗老年痴呆症的创新思路，对ad病的调控治疗有重要意义。

维持大脑活性氧物种（ros）内稳态平衡是大脑正常生理功能的必要条件。大脑消耗人体五分之一的氧，而且抗氧化剂和相关酶的浓度相对较低又富含不饱和脂肪酸，易受氧化损伤。正常情况下，细胞可以通过调节内稳态平衡对抗氧化攻击，但随着年龄增长，细胞保持平衡的能力减低，导致自由基积累，线粒体功能失调，神经元损伤。氧化损伤诱发信号传导通路，操纵细胞对压力的反应，这个反应的表现就是ros的增加。当ros的数量超过了神经元细胞对抗的能力时就会发生氧化胁迫，进而导致线粒体机能障碍以及神经元细胞损伤。线粒体中缺乏组蛋白以及线粒体中dna修复功能的减弱都是造成线粒体易产生氧化胁迫的原因。铜离子等被认为是ad中氧化胁迫发生的重要原因。在ad病中，氧化损伤的增加不是最终的结果，而是具有起始作用。ad的初期，神经细胞尽管氧化损伤增加，但实际上仍然是处于内稳态平衡的。随着ad病的发展及相应的ros水平的增加，abeta-金属化合物和过度磷酸化的tau蛋白将不能有效的被去除，导致淀粉样斑块和神经纤维缠结的不可控地增加，而这又会导致反应活性物质的进一步增多，这种恶化的反馈机制最终造成神经元功能丧失。

铜、铁等具有氧化还原活性的过渡金属离子被认为是ad中氧化胁迫发生的重要原因，具有很强的介导ros产生的能力。ros内稳态调控与超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶、细胞色素c氧化酶、过氧化物歧化酶、硫氧还蛋白还原酶等硒酶等密切相关。如果这些系统功能异常，或者ros量超过了系统的负荷，堆积的ros将通过对蛋白和脂质等分子的攻击，破坏突触相关蛋白的功能，引起突触功能损害。硒蛋白/酶，如hpgpx、sel-p、gpxs，具有其独特的抗氧化作用，可防止过多ros对神经突触机制的损害，selp基因被干扰的小鼠神经功能紊乱。硒为脊椎动物脑发育、代谢所必需，当硒摄入量不足时，它被优先供给中枢神经系统（cns）。而长期缺硒会引起脑疾病，如阿尔海茨默病（alzheimer，ad病）、癫痫、帕金森病、神经分裂症等神经退行性疾病。亚硒酸钠通过作用于erkmapk而抑制g-分泌酶活性、减少abeta肽产生，发挥神经保护作用。硒代甲硫氨酸（semet）能通过对gpx的调控，降低自由基的产生，调控大脑活性氧物种的稳态平衡。

以补充阿尔茨海默等神经退行性疾病大脑中缺少的金属稳态调控蛋白mt3，增加神经营养元素锌和硒为目的，通过生物基因工程和化学合成相结合的复合方法，制备了sezn7mt3重组金属蛋白。在此基础上，运用阿尔茨海默症转基因小鼠模型，研究了sezn7mt3在脑神经中的调控功能，研究发现，sezn7mt3可以改善阿尔兹海默症模型小鼠的认知和记忆能力，抑制神经细胞凋亡，抑制淀粉样蛋白沉积等，能有效阻止老年痴呆症病情发展。因此，sezn7mt3在防治老年痴呆等神经退行性疾病方面有重要应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种创新金属蛋白sezn7mt3及其制备方法。该重组锌的硒代金属硫蛋白sezn7mt3是通过基因重组和化学合成相结合的复合方法制备。利用基因重组、生物合成金属硫蛋白mt3，mt3中的甲硫氨酸被硒代甲硫氨酸取代，再经过化学重组，有7个金属锌离子与mt3蛋白配位构成重组锌硒代金属硫蛋白。

本发明的目的在于提供sezn7mt3的创新组成、制备方法，及其在防治阿尔茨海默症中的应用。本发明研究表明，sezn7mt3可以调控大脑金属离子稳态和ros稳态平衡，抑制神经细胞的凋亡，抑制淀粉样蛋白聚集，改善认知记忆能力，具有明显的抗阿尔茨海默症发展的作用，可用于制备抗阿尔茨海默症药物。

本文提及人源mt3，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及ncbi数据库、欧洲基因数据库一致。mt3（metallothionein3）又称神经生长抑制因子（neuronalgrowthinhibitoryfactor），含有68氨基酸残基，其genbank名为：eaw82868.1.

具体实施方式

下面通过实施例，具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1：sezn7mt3的制备

所有生物化学试剂、试剂盒，除特别说明外，均购自sigama或invitrogen公司。

（1）smt-mt3质粒构建

人源性金属硫蛋白mt3和融合标签蛋白基因smt3购自广州福能基因公司。基因载体质粒mbpht-mcherry-2购自invitrogen公司，基因引物合成由上海杰瑞生物技术公司完成，利用设计的引物p1、p2（扩增smt3基因）和p3、p4（扩增mt3基因）扩增出pcr产物。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测验证并胶回收正确的片段。产物1和产物2按相同浓度比例混合后作为模板，利用p1和p4引物扩增出smt3-mt3序列，其5’端带有bamhi酶切位点ggatcc，3’端带有hindiii酶切位点aagctt。设计的扩增引物如下：

p1:5’-cgcggatccatggctagcatgtcggactc-3’

p2:5’-ggcaggtctcagggtccataccaccaatctgttctc-3’

p3:5’-gagaacagattggtggtatggaccctgagacctgcc-3’

p4:5’-cgcaagctttcactggcagcagctgcac-3’

分别将载体mbpht-mcherry-2和扩增的smt3-mt3基因序列用bamhi和hindiii内切酶，在37℃双酶切6小时，用1%琼脂糖凝胶检测验证酶切成功，胶回收酶切片段。酶切的大小片段按1：3混合，用t4连接酶在16℃连接8小时，连接产物转化到top10克隆感受态细胞，挑取阳性克隆进行pcr鉴定和测序证明，成功构建了融合蛋白smt3-mt3表达质粒。

（2）野生型semt3蛋白的生物表达

将构建的smt3-mt3表达质粒转化入宿主菌bl21（de3）中，挑取单菌落于3mllb培养基中，37℃下摇床培养8小时后以1：100的比例接入50ml的lb培养基中，在37℃摇床中培养6小时后,离心收集菌体，弃掉培养基水溶液，然后用m9培养基悬浮后加入到m9培养基中（1：100的比例接入m9培养基中，培养基均含有100μg/ml氨苄青霉素钠）。37℃200rpm摇床培养至od值为0.6~0.8时，加入iptg诱导剂（终浓度0.5mm）和硒代甲硫氨酸（每升m9培养基15mg硒代甲硫氨酸）,于20℃过夜表达。

（3）semt3蛋白的纯化

用高速离心机离心收菌，加tris缓冲液（20mmtris-hcl，500mmnacl，10%甘油，5mmβ-巯基乙醇，ph=7.5）悬浮（1ml/g菌体），加少量溶菌酶、dna酶、1%pmsf，搅拌溶菌并用超声破碎机破菌，然后，用高速离心机离心（12000rpm、离心30min），取上清液穿流已经平衡好的亲和ni-nta柱，使得带有his标签的融合蛋白挂柱。用含20mm咪唑的tris缓冲液洗脱杂蛋白，至考马斯亮蓝检测不变色为止。用含200mm咪唑的tris缓冲液洗脱融合蛋白。洗脱的融合蛋白装入透析袋中透析，透析液为tris缓冲液，每次1l，每隔6小时换液，共换三次，之后按1%的比例加入sumo酶酶切6小时，酶切产物穿流已经平衡好的ni-nta柱，共穿流三次除去标签蛋白及sumo酶，再用superdex-g75凝胶分子筛进一步除去杂蛋白，纯化得到的semt3蛋白经15%sds－page胶检测纯度达98%以上。

（4）sezn7mt3的金属重组

取2mlsemt3蛋白溶液（5mg/ml），加入dtt至终浓度为5mm，4℃还原2小时。加入6m的hci溶液调节ph至l-2，酸化l小时后，过superdexg-25柱除去杂金属离子，用ph2.0的hci溶液洗脱mt3蛋白。流出液用紫外光谱仪检测，收集。脱金属的apo-semt3蛋白溶液脱气后立即载入厌氧手套箱中，加入dtt至终浓度为5mm，加20倍于蛋白浓度的zncl2，慢慢滴加2m的tris碱调节ph至8-9，室温下放置过夜，然后透析去除过剩的锌离子，蛋白浓缩后得到sezn7mt3。

（5）sezn7mt3的性质表征

semt3蛋白浓度标定方法：采用2，2’-二硫二吡啶(2-pds)比色法。原理是利用2，2’一二硫二吡啶氧化蛋白中的巯基，形成的产物2-硫代吡啶在343nm处有敏锐吸收。取10μl蛋白溶液，加入到500μl测定液中（2mm2，2’一二硫二吡啶，1mmedta，0.2m乙酸钠，ph4.0），混匀后室温下静置5分钟，用紫外光谱仪测量343nm吸光度值并用比尔朗伯定律(lamber-beerslaw)计算蛋白质中疏基（-sh）的浓度。c(-sh)=a343/(ε343·l)，其中a343为反应产物（2一硫代吡啶）在343nm的吸光度，ε343为反应产物在343nm的摩尔消光系数(7.06×103m^-1)，l为光径长度(cm)。由于金属硫蛋白中含有多个巯基，所以用测得的疏基浓度除以疏基数即可得到蛋白的浓度。

sezn7mt3金属含量测定：取一定量的重组好的蛋白，加少量浓硝酸于65℃硝化过夜，稀释10倍后在电感耦合等离子体发射光谱仪（icp-oes）上测定金属zn和se的含量。结果显示重组后每摩尔semt3蛋白含有的zn为7±0.3摩尔,se为1±0.2摩尔。

（6）sezn7mt3内毒素的去除

sezn7mt3（分子量约7kd）先用10kd的超滤膜截留聚集态的内毒素（lps），再用polymyxinb亲和柱除去残留的内毒素。

实施例2：阿尔茨海默症小鼠模型及sezn7mt3的药效检测

c57普通小鼠，雄性，体重24-26g，5月龄，spf级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：scxk（沪）2007-0005]。app/ps1转基因小鼠购自北京中科泽晟生物技术有限公司，5月龄，体重24-26g。所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温（23±2）℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。实验鼠随机均分为3组，每组10只小鼠。分别为a：正常c57小鼠组，b：app/ps1转基因小鼠，阴性对照组（生理盐水组）；c：sezn7mt3给药组，app/ps1转基因小鼠。

受试药物名称：sezn7mt3；

溶媒：生理盐水；

配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。

给药方式：小鼠脑室给药。实验动物为app/ps1二转基因小鼠，正常鼠用c57小鼠。使用alzet微渗泵model2006，进行6周的缓释给药。给药部位为侧脑室，埋管时使用立体定位仪精确定位（以前囟为原点，左侧或右侧1.0mm，后侧0.4mm，深度0.3mm），给药剂量为2mg/kg/天，给药6周后取血清和脑组织。

实施例3：用morris水迷宫验证阿尔茨海默症小鼠认知能力

实验鼠随机均分为2组，每组10只小鼠。分别为a：app/ps1转基因小鼠；b：sezn7mt3给药组，app/ps1转基因小鼠。

装置:圆形水池，直径1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水温保持在23±2℃；池壁上标记四个等距离点n、e、s、w作为试验的起始点，分水池为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限)且保持不变，供小鼠用来定位平台。定位航行试验:试验共历时6天，每天定于固定时间训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点（不同象限）放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。

空间探索试验：定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后将小鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限（第三象限）的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。数据用spss10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-wayanova）检验比较给药效果的显著性。

结果表明：sezn7mt3治疗的阿尔茨海默症小鼠具有认知能力改善的现象。相比ad鼠对照组，给药组ad鼠在第三象限停留时间和穿越原站台所在位置的次数几率平均提高了25%以上，说明sezn7mt3能有效阻止治疗的阿尔茨海默症小鼠病情发展。

实施例4：sezn7mt3对阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞的调控

ad鼠给药6周后，取小鼠脑组织，在4％多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋，在切片机上切成4微米厚的组织切片，然后用苏木精和曙红（he）染，在光学显微镜下（leica,germany）观察海马体ca1区的细胞形态）。实验结果如图1所示（a：为正常鼠对照组，b：为ad鼠模型组，c：为ad鼠模型脑室定位缓释sezn7mt3给药组）。ad模型鼠脑组织ca1区的细胞变形皱缩，观察不到染色质及核糖体，给药sezn7mt3后细胞形态趋于正常。使用sezn7mt3后，能够抑制小鼠大脑神经细胞的退化变性，调控神经细胞恢复正常功能。

实施例5：sezn7mt3抑制阿尔茨海默症小鼠脑淀粉样蛋白聚集

本实验为硫黄素s染色实验，实验流程为：ad鼠给药6周后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，tbs洗三次，0.3%硫黄素s（溶于50%乙醇）滴于组织上，室温孵育10min，50%乙醇洗三次，tbs清洗，阴干，封片，激光共聚焦显微镜下观察。实验结果如附图2所示。硫磺素s本身自带绿色荧光，能特异性的与成熟的abeta淀粉样蛋白结合，用于标记脑组织中淀粉样蛋白的含量和分布，评价阿尔兹海默症的病理状况。实验结果如图2所示（a为正常鼠对照组，b为ad鼠模型组，c为ad鼠模型脑室定位缓释sezn7mt3给药组）。给药后aβ淀粉样蛋白较模型组有明显减少。sezn7mt3能够显著降低ad鼠脑内abeta蛋白的沉积。

实施例6：sezn7mt3抑制阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞凋亡

tunel凋亡试剂盒（g3250试剂盒）购自promega公司。小鼠给药6周后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，pbs洗涤，蛋白酶k室温孵育10min，切片pbs洗涤后甲醛固定，加入平衡缓冲液预平衡后洗涤，之后加入孵育缓冲液（内含平衡缓冲液，核苷混合物和rtdt酶），37℃避光孵育1h，终止反应后共染dapi，阴干，封片，激光显微镜拍照。实验结果如图3所示（a为对照组，b为ad鼠模型组，c为ad鼠模型脑室定位缓释sezn7mt3给药组），结果表明：sezn7mt3能够抑制小鼠大脑神经细胞的凋亡。

说明书附图

图1.sezn7mt3对阿尔茨海默症鼠脑组织海马体ca1区细胞形态的调控作用（a为正常鼠对照组，b为ad鼠模型组，c为ad模型鼠脑室给药组sezn7mt3）。图2.sezn7mt3抑制ad鼠脑内abeta蛋白的沉积（a为对照组，b为ad鼠模型组，c为ad模型鼠脑室给药sezn7mt3六周）。

图3、sezn7mt3对阿尔茨海默症鼠脑内神经细胞凋亡的影响（a为对照组，b为ad鼠模型组，c为ad模型鼠脑室给药sezn7mt3六周）。

semt3蛋白氨基酸序列（1-68）：

semdpetcpcpsggsctcadsckcegckctsckksccsccpaecekcakdcvckggeaaeaeaekssccq。