具有CDK或HDAC抑制活性的新型苯并杂环联嘧啶抑制剂的制作方法

本发明涉及新型杂环衍生物及其药物组合物，特别是作为cdk或hdac抑制剂的新型杂环衍生物及其药物组合物。本发明还涉及这些化合物和组合物在治疗过度增殖性紊乱如癌症中的用途。

背景技术

细胞的生命始于细胞周期，细胞周期的正常运行依赖于精细的调控机制。已发现细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase,cdk）是细胞周期调控的核心。cdks家族主要分为两类:cdk1-4，6控制细胞周期，与相应细胞周期蛋白结合调控细胞进入g1期，从而影响细胞dna的合成；cdk5，7-9控制细胞转录，研究发现，癌症等疾病发生、发展与细胞周期的调控异常有关，有超过90%的癌症中cdk及相应cyclin表达失常。由于细胞周期失控的分子机制常常是通过cdk的不适当激活导致的，因此，cdk是肿瘤等疾病治疗极具潜力的靶点。

在肿瘤细胞中，hdac的过度表达导致去乙酰化作用的增强，通过恢复组蛋白正电荷,从而增加dna与组蛋白之间的引力,使松弛的核小体变得十分紧密,不利于一些肿瘤抑制基因的表达。cdk的高度活化以及hdac过度表达同时促进了肿瘤细胞的增殖。靶向cdk的同时靶向hdac的抑制剂能够更加有效地抑制肿瘤等过度增殖细胞。

因此，同时靶向cdk和hdac的抑制剂具有更好的药效，能够降低耐药性和毒副作用。

技术实现要素：

本发明的化合物是cdk或hdac抑制剂，可用于治疗受cdk或hdac介导的疾病和紊乱，例如癌症、包括套细胞淋巴瘤、脂肉瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、鳞状细胞食管癌和乳腺癌。本发明还涉及使用本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物来治疗与其有关的紊乱。

本发明涉及新的具有式(i)的苯并吡咯联嘧啶环化合物及其盐、包括可药用盐：

其中：

r1选自h、、、、、、、、、、烷基、烯基、炔基、杂环基、芳基、杂芳环，其中r7和r8分别是氢基、烃基、环烷基、杂原子环烷基、芳基或杂芳环；

r2是c1-8烷基；任选被一个选自c1-8烷基、卤素原子和oh的取代基取代的c4-7环烷基；任选被一个选自c1-8烷基、c(ch3)2cn、卤素原子和oh的取代基取代的苯基；任选被一个环丙基或c1-8烷基取代的哌啶基；任选被一个环丙基或c1-8烷基取代的四氢吡喃基；或二环[2.2.1]庚烷基，其中卤素原子包括f、cl、br、i；

r3和r4是氢原子或是氟原子，其中r3和r4至少有一个是氟原子；

r5选自取代或未取代的芳基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的嘧啶基，取代或未取代的氧化吡啶基，取代或未取代的吡嗪基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡唑基，取代或未取代的咪唑基，取代或未取代吲哚基，取代或未取代异吲哚基，取代或未取代呋喃基，取代或未取代噻唑基，取代或未取代噁唑啉基，取代或未取代噻吩基；

r6选自、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、其中n=1~9，a、d各自独立选自价键、o、nh、nr11、c(o)、c(o)nh、nhc(o)、ch2、ch2c(o)nh、ch2nhc(o)或s(o)1~2，r9、r10可各自独立的选自h、oh、c1-c8烷烃、-(ch2)t(c1-c10烷烃)、-(ch2)t(c3-c10杂烷烃)、-(ch2)t(c3-c10)环烷烃)、-(ch2)t(c6-c10环杂烷烃)，其中t代表数字0-6，所有的烷烃可选择被一个或更多的f、cl或br取代；

l是价键、o、nh、c(o)、c(o)nh、nhc(o)、ch2、ch2c(o)nh、ch2nhc(o)、ch2s(o)1~2或s(o)1~2；

x和z各自独立选自ch、n，当z选n时，r1为无取代基。

本发明所述苯并吡咯联嘧啶环化合物可以根据常规药物配制技术与药物载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体和赋形剂)混合形成药物制剂。可以将所述苯并吡咯联嘧啶环化合物化合物作为活性成分混合在任何常用的口服剂型中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂和液体制剂(例如酏剂和混悬剂)，其中包含着色剂、矫味剂、稳定剂和掩盖味道的物质。对于混合口服剂型来说，所述苯并吡咯联嘧啶环化合物作为活性成分可以与各种普通片剂材料(例如淀粉、碳酸钙、乳糖、蔗糖和磷酸二钙)混合以助于压片和装入胶囊。可以将所述苯并吡咯联嘧啶环化合物在药学上可接受的无菌液体载体例如无菌水、无菌有机溶剂或者两者的混合物中溶解或混悬。液体载体可以是适合注射剂的载体，比如生理盐水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。在其他情况下，还可以将微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纤维素钠的水溶液中或分散在适当的油(例如花生油)中来制得。液体药物制剂(指无菌溶液或混悬剂)可以用于静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射或者皮下注射。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含至少一种作为活性成分的本发明所述苯并吡咯联嘧啶环化合物。除此之外，所述药物组合物还可以包含一种或多种无机或有机、固体或液体的药学上可接受的载体或者赋形剂。术语“药学上可接受的”是指当给药至动物例如哺乳动物(例如人类)时生理学上可耐受且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如头晕等)的添加剂或组合物。药物载体和赋形剂可以包括但不限于稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；润滑剂；聚乙二醇；粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的话，还包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；和/或吸附剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂和甜味剂。

具体实施方式

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。

在本发明化合物的制备中所采用的起始原料是已知的、能够根据已知方法制备的或者可商购获得的。

本发明还涉及新的中间体和/或起始原料。特别优选与实施例中提到的那些相同或者相似的反应条件和新中间体。

中间体和终产物都可以根据常规方法进行后处理和/或纯化，所述常规方法包括调节ph、萃取、过滤、干燥、浓缩、色谱法、研磨、结晶等。

另外，本发明化合物还可以通过本领域已知的各种方法或者本文所述方法的变通方法进行制备。

下列实施例仅用于举例说明本发明，不以任何方式对本发明进行限制。

实施例1n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-8-羟氨氧代辛酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(400mg，0.71mmol)，羟胺水溶液(50%，4ml)，甲醇20ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得305mg，产率=76%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(s,1h),9.80(s,1h),9.70(s,1h),8.69(s,1h),8.60(d,j=3.9hz,1h),8.26(s,1h),7.67(dd,j=19.3,10.3hz,3h),7.55(d,j=8.5hz,2h),4.91–4.76(m,1h),2.64(s,3h),2.28(t,j=7.4hz,2h),1.95(t,j=7.3hz,2h),1.66–1.45(m,12h),1.28(d,j=7.4hz,2h)。

实施例2n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-7-羟氨氧代庚酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-7-氧代庚酸甲酯(200mg,0.36mmol），羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得140mg，产率=70%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(s,1h),9.80(s,1h),9.70(s,1h),8.69(s,1h),8.60(d,j=3.9hz,1h),8.26(s,1h),7.67(dd,j=19.3,10.3hz,3h),7.55(d,j=8.5hz,2h),4.92–4.78(m,1h),2.64(s,3h),2.28(t,j=7.4hz,2h),1.95(t,j=7.3hz,2h),1.67–1.46(m,10h),1.31-1.23(m,2h)。

实施例3n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-9-羟氨氧代壬酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-9-氧代壬酸甲酯(200mg,0.35mmol)，羟胺水溶液（50,2ml），甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得124mg，产率=62%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.36(s,1h),9.81(s,1h),9.69(s,1h),8.69(s,1h),8.59(d,j=3.9hz,1h),8.26(s,1h),7.67(dd,j=20.5,10.3hz,3h),7.55(d,j=8.5hz,2h),4.90–4.74(m,1h),2.64(s,3h),2.28(t,j=7.4hz,2h),1.94(t,j=7.3hz,2h),1.62(d,j=6.8hz,6h),1.50-1.47(s,2h),1.39–1.11(m,8h)。

实施例4n-1-(5-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)-n-8-羟氨氧代辛酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-((5-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶吡啶-2-基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(200mg,0.35mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得148mg，产率=74%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(d,j=4.8hz,1h),9.85(s,1h),8.69(s,0h),8.63(dd,j=7.5,3.2hz,1h),8.19(dd,j=12.0,2.0hz,1h),8.08(d,j=9.0hz,1h),7.67–7.61(m,1h),4.87-4.81(m,1h),2.64(s,2h),2.36(t,j=7.4hz,1h),1.94(t,j=7.4hz,1h),1.61(d,j=6.8hz,4h),1.49(t,j=6.9hz,1h),1.29-1.25(m,2h)。

实施例5n-1-(3-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-8-羟氨氧代辛酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-((3-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(200mg,0.35mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得142mg，产率=71%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(s,1h),9.85(s,1h),9.76(s,1h),8.72–8.50(m,2h),7.97(s,1h),7.75–7.68(m,1h),7.51(d,j=7.0hz,1h),7.20(d,j=7.3hz,2h),4.86-4.80(m,1h),2.63(s,3h),2.29(t,j=7.4hz,2h),1.93(t,j=7.4hz,2h),1.60(d,j=6.8hz,6h),1.48(t,j=7.1hz,2h),1.31–1.21(m,4h)。

实施例64-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(8-(羟基氨基)-8-氧代丁基)苯甲酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰氨基)辛酸甲酯(200mg,0.346mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得100mg，产率=50%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.36(s,1h),10.07(s,1h),8.70–8.57(m,2h),8.27(d,j=32.6hz,2h),8.00–7.77(m,4h),7.66(d,j=11.9hz,1h),4.89–4.74(m,1h),3.24(d,j=6.6hz,2h),2.64(s,3h),1.94(t,j=7.3hz,2h),1.62(d,j=6.5hz,6h),1.51(s,2h),1.26(d,j=17.8hz,8h)。

实施例7n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)-n-8-羟氨氧代辛酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)胺)-8-氧代辛酸甲酯(200mg,0.346mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得134mg，产率=67%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.36(s,1h),9.76(s,1h),8.70(s,1h),8.60(d,j=3.8hz,1h),8.25(s,1h),7.74(d,j=8.1hz,2h),7.64(d,j=12.1hz,1h),7.18(d,j=8.2hz,2h),4.92-4.75(m,1h),4.22(d,j=5.4hz,2h),2.64(s,3h),2.12(t,j=7.4hz,2h),1.93(t,j=7.3hz,2h),1.61(s,4h),1.54–1.42(m,4h),1.27-1.19(m,4h)。

实施例84-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(6-(羟基氨基)-6-氧代己基)苯甲酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入6-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰氨基)己酸甲酯(200mg,0.36mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得132mg，产率=66%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.37(s,1h),10.07(s,1h),8.75–8.60(m,2h),8.27(d,j=34.8hz,2h),7.94–7.77(m,4h),7.66(d,j=12.0hz,1h),4.85(q,j=6.8hz,1h),3.29–3.04(m,3h),2.64(s,3h),1.95(d,j=7.5hz,2h),1.62(d,j=6.7hz,6h),1.52(d,j=7.4hz,4h),1.29(d,j=7.4hz,2h)。

实施例9n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-6-羟氨氧代己酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入6-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-6-氧代己酸甲酯(200mg,0.37mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得122mg，产率=61%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.40(s,1h),9.75(d,j=49.2hz,2h),8.65(d,j=53.7hz,2h),8.26(s,1h),7.77–7.36(m,5h),4.84(s,1h),2.63(s,3h),,2.30(s,2h)1.99(s,2h),1.59(d,j=25.7hz,10h)。

实施例10n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)-n-5-羟氨氧代戊酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入5-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯(200mg,0.37mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得116mg，产率=58%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.78(s,1h),8.63(d,j=3.9hz,1h),8.38–8.12(m,1h),7.75(d,j=8.5hz,2h),7.66(d,j=13.1hz,1h),7.19(d,j=8.4hz,2h),4.92–4.69(m,1h),4.23(d,j=5.8hz,2h),2.65(s,3h),2.15(t,j=7.5hz,2h),1.98(t,j=7.5hz,2h),1.76(t,j=7.5hz,2h),1.63(d,j=6.8hz,6h)。

实施例11n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)-n-6-羟氨氧代己酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入6-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)氨基)-6-氧代己酸甲酯(200mg,0.36mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得146mg，产率=73%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.37(s,1h),9.78(s,1h),8.70(s,1h),8.63(d,j=3.9hz,1h),8.32–8.16(m,2h),7.80–7.70(m,2h),7.66(dd,j=11.9,1.2hz,1h),7.20(d,j=8.4hz,2h),4.85(q,j=6.9hz,1h),4.23(d,j=5.8hz,2h),2.65(s,3h),2.14(t,j=4.8hz,2h),2.00–1.88(m,2h),1.63(d,j=6.9hz,6h),1.54–1.48(m,4h)。

实施例12n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)-n-7-羟氨氧代庚酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入7-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)胺)-7-氧代庚酸甲酯(200mg,0.346mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得140mg，产率=70%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(s,1h),9.77(s,1h),8.68(s,1h),8.63(d,j=3.9hz,1h),8.26(d,j=1.3hz,1h),7.74(d,j=8.6hz,2h),7.66(dd,j=11.9,1.2hz,1h),7.25–7.12(m,2h),4.91–4.78(m,1h),4.22(d,j=5.8hz,2h),2.65(s,3h),2.12(t,j=7.5hz,2h),1.94(t,j=7.4hz,2h),1.63(d,j=6.9hz,6h),1.51(dt,j=10.4,7.5hz,4h),1.24(ddt,j=9.0,6.9,3.6hz,2h)。

实施例13n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)-n-9-羟氨氧代壬酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入9-((4-((5-氟-4-（4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基）嘧啶-2-基)氨基)苄基)氨基)-9-氧代壬酸甲酯(200mg,0.34mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得134mg，产率=67%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.33(s,1h),9.76(s,1h),8.67(s,1h),8.63(d,j=3.9hz,1h),8.25(d,j=1.4hz,2h),7.74(d,j=8.5hz,2h),7.68–7.62(m,1h),7.18(d,j=8.3hz,2h),4.87-4.82(m,1h),4.21(d,j=5.8hz,2h),2.64(s,3h),2.12(t,j=7.4hz,2h),1.92(t,j=7.3hz,2h),1.62(d,j=6.8hz,6h),1.49(dt,j=20.3,6.9hz,4h),1.24(s,6h)。

实施例144-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)-n-羟基丁酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入4-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)丁酸甲酯(200mg,0.37mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得138mg，产率=69%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.37(s,1h),9.74(s,1h),8.71(s,1h),8.62(d,j=3.9hz,1h),8.26(s,1h),8.04(s,1h),7.77–7.57(m,2h),7.19(d,j=8.4hz,2h),4.94–4.76(m,1h),3.35(s,2h),3.03(q,j=6.7hz,2h),2.64(s,3h),1.96(t,j=7.5hz,2h),1.63(d,j=6.8hz,8h)。

实施例155-(2-(4((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)-n-羟基戊酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入5-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)戊酸甲酯(200mg,0.36mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得156mg，产率=78%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(d,j=1.7hz,1h),9.73(s,1h),8.68(d,j=1.7hz,1h),8.62(d,j=3.9hz,1h),8.26(s,1h),8.01(s,1h),7.68(dd,j=18.8,10.2hz,3h),7.18(d,j=8.4hz,2h),4.87-4.83(m,1h),3.34(s,2h),3.02(d,j=6.4hz,2h),2.64(s,3h),1.94(t,j=7.2hz,2h),1.62(d,j=6.9hz,6h),1.49(t,j=7.7hz,2h),1.37(t,j=7.6hz,2h)。

实施例166-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)-n-羟基己酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入6-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)己酸甲酯(200mg,0.35mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得110mg，产率=55%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.34(s,1h),9.73(s,1h),8.67(s,1h),8.62(d,j=4.0hz,1h),8.25(s,1h),7.98(q,j=5.4hz,1h),7.75–7.59(m,3h),7.18(d,j=8.2hz,2h),4.86-4.81(m,j=7.0hz,1h),3.34(d,j=1.8hz,2h),3.02-2.99(m,2h),2.64(s,3h),1.92(q,j=8.7,8.0hz,2h),1.60(dd,j=16.4,7.0hz,6h),1.47(q,j=7.6hz,2h),1.38(q,j=7.4hz,2h),1.27–1.17(m,2h)。

实施例177-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)-n-羟基庚酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入7-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)庚酸甲酯(200mg,0.346mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得154mg，产率=77%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.34(d,j=1.7hz,0h),9.74(s,0h),8.68(d,j=1.7hz,0h),8.63(d,j=3.9hz,0h),8.26(d,j=1.3hz,0h),7.98(t,j=5.6hz,0h),7.73–7.63(m,1h),7.22–7.16(m,1h),4.88-4.82(m,1h),3.35(s,1h),3.02(q,j=6.6hz,1h),2.65(s,1h),1.91(d,j=7.4hz,1h),1.63(d,j=6.9hz,3h),1.47(t,j=7.0hz,1h),1.38(t,j=6.5hz,1h),1.23(d,j=5.9hz,2h)。

实施例188-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)-n-羟基辛酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入8-(2-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)辛酸甲酯(200mg,0.34mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得146mg，产率=73%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.33(s,1h),9.74(s,1h),8.67(s,1h),8.62(d,j=3.9hz,1h),8.26(d,j=1.3hz,1h),7.98(t,j=5.6hz,1h),7.73–7.59(m,3h),7.19(d,j=8.4hz,2h),5.00-4.63(m,1h),3.34(s,2h),3.03(d,j=6.3hz,2h),2.65(s,3h),1.92(t,j=7.3hz,2h),1.63(d,j=6.9hz,6h),1.46(t,j=7.0hz,2h),1.38(dd,j=8.7,4.8hz,2h),1.23(s,6h)。

实施例19n-1-(4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-5-羟氨氧代戊酸酰胺的制备

在50ml单口瓶中加入5-((4-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸甲酯(200mg,0.38mmol)，羟胺水溶液(50%，2ml)，甲醇10ml，80℃加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得114mg，产率=57%。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.83(s,1h),9.69(s,1h),8.60(d,j=3.9hz,1h),8.27(d,j=1.3hz,1h),7.71(d,j=9.0hz,2h),7.65(dd,j=11.9,1.2hz,1h),7.55(d,j=9.0hz,2h),4.85(p,j=6.9hz,1h),3.60(s,3h),2.64(s,3h),2.36(dt,j=14.3,7.4hz,4h),1.85(p,j=7.4hz,2h),1.63(d,j=6.9hz,6h)。

生物学测定。

hdac1酶活性测定。

体外检测化合物hdac1酶的生物学活性是在384孔板进行的。实验中，使用全长的hdac1蛋白，在km的浓度下，于荧光标记的多肽ac-peptide-amc（ac：乙酰基，amc：7-氨基-4-甲基香豆素）中孵化。在tris-based测定缓冲液中反应，随后在去乙酰基酶和胰蛋白酶作用下，底物释放荧光团7-氨基-4-甲基香豆素，使用多标记微孔板检测仪进行荧光检测(355nm激发,460nm发射)。数据进行荧光随时间的线性分析。软件进行数据处理计算ic50值。

实验材料：hdac1(bpsbioscience,usa,cat.no.50051)；384-wellplate(fromperkinelmer,cat.no.6007279)。

实验方法：首先准备1x实验缓冲液(tris缓冲液)；将溶于dmso中的抑制剂，四倍连续稀释加入到多孔板中；准备酶溶液:在1x实验缓冲液中准备酶溶液；准备底物溶液：在1x实验缓冲液中加入胰蛋白酶和乙酰基修饰的多肽底物；将15μl的酶溶液加入到多孔板中；室温孵化15分钟；每个孔中加入10μl底物溶液，反应开始；室温孵化60分钟。在synergymx仪上，355nm激发和460nm发射波长下读板。在excel中使用下列公式进行数据处理计算抑制率(1)公式(1):抑制率%=(最大值-读数)/(最大值-最小值)*100使用软件graphpadprismv5.0和公式（2）处理数据得到ic50值(2)，公式(2):y=bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic50-x)*面积阙值))。y是抑制率%，x是化合物浓度。

cdk酶活性测定。

采用calipermobilityshiftassay方法测试化合物对cdk酶的抑制活性，该技术将毛细管电泳的基本理念应用到微流体环境中，在不加入中止试剂的情况下检测酶学实验。用于实验的底物是带有荧光标记的多肽，在反应体系中酶的作用下，底物转变为产物，其所带的电荷也发生了相应的变化，mobility-shiftassay利用底物和产物所带电荷的不同，将二者进行分离，并分别进行检测。

实验材料：cdk4/cycd3(carna,cat.no04-105,lot.no10cbs-0429c,gst-cdk4(1-303end)/gstcycd3(1-292end));peptidefam-p8(glbiochem,cat.no.112396,lot.no.p100804-xz112396);atp(sigma,cat.no.a7699-1g,casno.987-65-5);dmso(sigma,cat.no.d2650,lot.no.474382)；edta(sigma,cat.no.e5134,casno.60-00-4);96-wellplate(corning,cat.no.3365,lot.no.22008026);384-wellplate(corning,cat.no.3573,lot.no.12608008)。

实验方法：测定mobilityshift上的atp表观km,384微孔板中加入5μl/孔的2×enzyme&peptide混合液。加入5μl/孔三倍梯度稀释的2×atp溶液，启动反应。室温离心1min，放入23°c培养箱反应60min后，加入5ul/孔3×stopbuffer（100mmhepes,ph7.5；0.015%brij-35；0.2%coatingreagent#3；50mmedta）终止反应，置于caliperezreaderi上进行检测；在96微孔板中对化合物在5μm浓度进行4倍梯度稀释,加入100μl,100％dmso作为无化合物无激酶对照组，取10μl化合物加入到一个新的96孔微孔板，再加入90μl,1×kinasebasebuffer(20mmhepes,ph7.5;0.01%tritonx-100;10mmmgcl2;2mmdtt)，将该板放置在摇床上10分钟以将化合物混匀；每孔取5μl混合液加入到384孔微孔板中。384孔微孔板各孔中加10μl，2.5×enzymesolution。室温下孵育10分钟后再在各孔中再加10μl,2.5×的多肽溶液(1×kinasebasebuffer中加入fam-labeledpeptide和atp）。激酶反应，指定时间停止，孵育30℃。加25μlstopbuffer终止反应。置于caliperezreaderi上进行检测。

表1为化合物对hdac1激酶的抑制效力

表2为化合物对cdk4激酶的抑制效力

表1

表2