一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白（rPgmp22）及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用与流程

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rpgmp22)及其制备方法和在疟疾传播阻断过程中的应用。

背景技术：

疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播的一种严重威胁人类健康的感染性寄生虫疾病，最新who全球疟疾报告指出，仅2015年全球仍有约429000人死于疟疾。在疟疾的高密度流行区，目前可用的抗疟疾方法已经不足以阻断疟疾传播，耐药蚊虫与疟原虫的增加与流行更加增大了控制疟疾的难度。因此，国际疟疾消除专家委员会(malera)认为控制疟疾传播的关键措施是研发新的控制方法，有效地阻断疟疾的传播，而疫苗无疑是完成这项工作的最佳武器。疟疾疫苗主要分三大类：红前期疫苗、红内期疫苗以及传播阻断疫苗(tbvs)；其中：红前期疫苗与红内期疫苗可降低疟疾的感染率与临床发病率，但两者的候选抗原均暴露于人体免疫系统，受到人体免疫压力等因素的影响，候选抗原存在广泛的基因多态性，传播阻断疫苗不仅可以阻断疟疾流行的传播，且其候选抗原主要表达于蚊虫阶段疟原虫表面，不受脊椎动物免疫系统选择压力的影响，显示出较低的多态水平，不会出现抗原变异，更有利于疫苗的免疫效果。因此,tbvs被认为是加速疟疾控制和最终根除疟疾的新策略。

tbvs的效应机制是以蚊阶段疟原虫表达的特异性虫体表面蛋白作为抗原刺激机体产生抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体。当蚊吸入被免疫的人血后，抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体与蚊中肠内发育的疟原虫发生特异性结合，进而阻断蚊体内疟原虫的进一步发育。因此，tbvs可以阻断按蚊将疟原虫从一个宿主传播至另一个宿主。

tbvs候选抗原主要表达于疟原虫的有性生殖阶段，即配子体至动合子发育阶段。目前，研究发现的tbvs候选抗原非常有限，如p230、p48/45、p25和p28。但这几种疟原虫有性阶段疫苗候选抗原诱导的特异性抗体尚不能达到令人满意的传播阻断效果。因此，疟疾防控的重点策略是迫切需要筛选并增加新型疟原虫有性阶段候选抗原，并制备重组蛋白，为后续开发高效、安全的tbv疫苗提供有效靶点。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明目的在于提供一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rpgmp22)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的具体方案如下。

本发明提供的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rpgmp22)的氨基酸序列为seqidno：1；或与序列seqidno.1限定的氨基酸序列同源性在95-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或seqidno.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。所述的合成用于编码伯氏疟原虫配子体重组蛋白具有200个氨基酸，其位于pgmp22全长蛋白的第19-218位氨基酸残基位置，其氨基酸序列为seqidno.1：ser-his-lys-asn-ile-ile-gln-ile-asn-tyr-lys-ile-asn-ser-tyr-ser-ala-asn-asn-asp-asn-ile-gln-trp-asn-ser-ile-gly-ala-phe-val-leu-asp-lys-asn-gln-ile-tyr-asn-thr-ser-asn-val-tyr-ile-asn-glu-lys-asn-lys-leu-ile-lys-lys-leu-lys-glu-gln-asn-phe-asp-tyr-val-leu-phe-gln-leu-cys-tyr-lys-ser-val-pro-gln-asn-cys-ile-gln-thr-tyr-ile-asp-arg-lys-lys-ile-gln-asn-pro-glu-asn-phe-ile-leu-leu-ile-gly-leu-asp-asn-asn-tyr-met-pro-tyr-val-leu-asn-tyr-arg-thr-tyr-asp-lys-val-asn-asp-lys-asn-ile-lys-val-phe-tyr-asp-leu-phe-ala-ile-lys-val-leu-ser-val-ser-leu-pro-ile-asn-ile-asn-lys-ile-gln-thr-asp-asp-asn-ile-asn-lys-asn-lys-tyr-lys-gly-asn-glu-asn-gly-lys-asn-lys-asp-glu-pro-lys-ser-phe-leu-arg-lys-tyr-trp-ile-tyr-ile-ala-ile-phe-leu-leu-ser-leu-ser-phe-ser-lys-his-leu-thr-glu-asn-thr-gln-gln-thr-gly-asp-ser。

本发明还提供编码上述伯氏疟原虫配子体重组蛋白的基因，由含编码上述重组蛋白的基因对的重组表达载体也属于本发明的范围，所述的重组表达载体由含有疟疾传播阻断的重组蛋白的基因原核表达载体组成，所述的原核载体为pet-32a表达载体。

所述的编码该重组蛋白的核苷酸为600bp，其序列为seqidno：2：tcacataaaaatataattcaaataaattataaaataaattcctactcagctaataatgataatatacaatggaatagtattggagcatttgtattagataaaaaccaaatatataacacgtccaacgtttatataaatgaaaaaaataaactcataaaaaaactaaaagaacagaattttgattatgttttatttcaattgtgctataaatctgttccccaaaattgtatacaaacatatattgatagaaagaaaatacaaaatccagaaaattttattttattaataggtttagataataattatatgccatatgtgctaaactatcgaacctatgataaagtcaatgataaaaatataaaagtattttatgatttatttgcaatcaaggttttatcagtttctttaccaattaatattaataaaatacaaactgatgacaacattaataaaaataagtataaaggaaatgaaaatgggaaaaataaagatgagcccaaatcatttctgaggaaatactggatttatatagctatatttttattgtcgctatctttttcaaaacaccttactgaaaatacacaacagacaggtgattca。

优选的，所述的重组表达载体为大肠杆菌dh-5α表达菌株。

为了实现上述目的，本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，所述方法包括引物的设计、目的基因的扩增、重组表达载体的构建、重组蛋白的表达和纯化。

所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白pgmp22在制备疟疾传播阻断疫苗中的应用。

本发明的显著效果。

本发明旨在通过生物信息学的分析和分子生物学的实验验证，提供一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，以进一步提高疟疾传播阻断效果。

本发明所述的重组蛋白是通过对伯氏疟原虫进行生物信息学分析，预测出配子体表达的一种表面蛋白，设计全长片段，在大肠杆菌中诱导表达、纯化，并进行动物免疫，获得免疫血清，验证其传播阻断效应。为进一步确定其功能,我们还制备了相应的抗体和基因敲除及基因恢复虫株,通过功能实验,明确其传播阻断效果。本发明所利用的基因恢复技术，其原理是利用敲除虫株的基因组与pcr扩增的目的基因及双侧同源臂的片段发生同源重组，对预先敲除的基因进行基因恢复达到使基因组完整的目的。

应该明确的是，本领域技术人员可根据本发明公开的seqidno.1氨基酸序列，在不影响其蛋白生物活性的前提下，对于其实施取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对同源性在95％以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此，本发明还包括对seqidno.1所示的氨基酸序列经取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。本发明还提供了一种基因打靶技术敲除伯氏疟原虫配子体蛋白(pgmp22)后获得虫株δpgmp22。由含上述重组蛋白目的基因两侧同源臂的重组打靶载体也属于本发明的范围，该重组打靶载体分别插入目的基因两侧同源臂，含有hdhfr耐药基因用来筛选阳性克隆虫株。该打靶载体为pl0034表达载体。本发明还提供了一种含有上述重组打靶载体的大肠杆菌tg1菌株。

本发明首次用分子生物学方式筛选伯氏疟原虫配子体蛋白(plasmodiumbergheigametocytemembraneprotein22，pgmp22，pbanka_030590)。并确定疟原虫有性生殖阶段表达的pgmp22的基因结构特点。pgmp22是分子量为25812da的保守膜蛋白，存在一个信号肽及两个低度复杂区，与其他疟原虫株高度同源。随后，应用原核表达系统成功地表达并纯化了可溶性的重组蛋白rpgmp22，经动物免疫，收获免疫血清。利用该血清对pgmp22进行定位，为进一步功能的研究提供新的理论与实验依据。然后，利用基因打靶技术敲除pgmp22，获得pgmp22基因敲除型疟原虫株δpgmp22，并对δpgmp22进行了详细的表型与生物学功能研究，明确pgmp22基因对疟原虫生活史的影响；并利用双交叉同源重组对δpgmp22基因敲除虫株进行了基因恢复，研究恢复后的虫株与wt和敲除虫株在表型和生物学功能上的异同；以及利用前期制备的重组蛋白rpgmp22获得的免疫血清，鉴定pgmp22的生物学功能和传播阻断效应，为疟疾疫苗的研制开发打下基础。

本发明所利用的基因打靶技术，其原理是利用活细胞基因组dna可与外源性dna的同源序列发生同源重组，对预先选择的基因进行定点修饰以达到改变基因组中某一特定基因的目的。该技术的优点是能将外源基因引入到疟原虫基因组dna的特定片段上，并靶向敲除目的基因，而靶向引入的基因随基因组dna的复制而稳定复制，因此可在活体内对某一特定基因的功能进行研究，并可在体内分析疟原虫相应蛋白的功能。因鼠疟整个生命周期的实验程序均可以进行人工操作，具有明显的易用性。鼠疟的基因组与人疟的基因组约有80％的同源性，所以通过敲除鼠疟中的靶基因、明确其生物学功能来推断相应的靶基因在人疟中的生物学作用也被广泛应用。

附图说明

图1为对pgmp22蛋白同一物种序列比对的alignment结果示意图。

图2为对pgmp22蛋白进行结构域预测的结果示意图。

图3为对pgmp22蛋白进行b细胞表位预测的结果示意图。

图4为sds-page电泳检测重组蛋白rpgmp22的表达和纯化结果。

图5为elisa检测重组蛋白rpgmp22免疫小鼠所得抗血清的抗体滴度水平。

图6为westernblot检测抗血清中抗体的特异性，鉴定pgmp22的定位阶段。

图7为ifa检测抗血清中抗体识别天然抗原的能力，鉴定pgmp22的定位阶段。

图8为基因敲除及恢复载体构建模式图。

图9为pcr鉴定基因敲除及恢复基因型的结果。

图10为基因敲除及恢复后表型的鉴定。

图11为重组蛋白rpgmp22免疫小鼠后的体内传播阻断效应。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明限定范围的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也为本发明的保护范围。

一、试验材料。

1.1菌株及质粒：大肠杆菌dh5α，m15和tg1(购自北京鼎国昌盛公司)，大肠杆菌escherichiacolirosetta-gamib(de3)(购自杭州丰海科技有限公司)，原核表达载体pet32a和打靶载体pl0034(购自clontech公司)。

1.2虫株：伯氏疟原虫(p.berghei)(ankastrain2.34)，获赠于日本爱媛大学。

1.3动物：清洁级balb/c小鼠购自北京维通利华公司。

1.4引物合成服务由深圳华大科技有限公司提供。

1.5主要试剂和仪器。

主要试剂：胰蛋白胨、酵母提取物购自oxoid公司，氯化钠购自dm公司，基因组提取试剂盒购自takara公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，dna聚合酶和ligationhigh连接酶购自toyobo公司，限制性内切酶购自neb公司，ni-nta为novagen公司产品，最小截留分子量为3500da的透析袋购自millipore公司产品，hrp标记的二抗购自北京鼎国昌盛公司，鼠源alexa-488荧光二抗购自invitrogen公司，乙胺嘧啶购自sigma公司，5-氟胞嘧啶购自sigma公司，bca定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

主要仪器有：水平电泳仪和垂直电泳仪(上海天能科技有限公司)，酶联仪(thermo，multiskanmk3)，高速离心机(hitachi,cr22gⅲ)。

下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。

实施例1。

疟疾传播阻断疫苗候选抗原pgmp22确定及其重组蛋白的制备。

1.利用分子生物信息学技术，鉴定并预测pgmp22的结构特点和功能。

pgmp22(pbanka_030590)基因在疟原虫数据库中被描述为“保守的疟原虫蛋白，功能未知”。bioedit分析显示，pgmp22蛋白在疟原虫物种中相对保守见图1，图中可见氨基酸残基完全同源的为黑色阴影，同源性大于50％的为灰色阴影。smart分析显示，pgmp22蛋白含有一个信号肽及两个低度复杂区，为表达全长蛋白，我们避开信号肽选取b细胞表位富集区获得全长片段，即从n端起得第19到218个氨基酸残基，共计200个氨基酸残基作为本发明所设计的rpgmp22的氨基酸序列，见图2，图中显示该蛋白存在一个信号肽及两个低度复杂区，第19-218位氨基酸是本发明表达的氨基酸序列。b细胞表位预测结果显示，pgmp22全长蛋白含有7个b细胞表位，见图3，我们用来表达蛋白的片段含有6.5个b细胞表位。

2.重组蛋白表达载体pet32a-pgmp22的构建。

2.1疟原虫基因组dna的提取。

6-8周龄雌性balb/c小鼠腹腔注射200μl苯肼(6mg/ml)，三天后小鼠腹腔感染1×10⁷p.berghei感染的红细胞，感染第四天开始检测疟疾血症，当疟疾血症达到30％左右时，肝素钠抗凝取心脏血液，按照血液基因组dna提取试剂盒takaradnaextractionkit说明书来提取p.berghei疟原虫基因组dna；将提取后的dna测定浓度后，-20℃保存。

2.2引物设计合成。

利用primerpremier5软件针对原核表达载体pet32a(+)设计引物，上下游引物5’端分别引入限制性内切酶bamhi和noti酶切位点,引物序列如下。pgmp22-f(seqidno：3)：ctggatcctcacataaaaatataattcaaataaattat。pgmp22-r(seqidno：4)：cagcggccgctgaatcacctgtctgttgtgtattt。

2.3目的基因的pcr扩增。

将引物稀释后以p.berghei基因组dna为模板，以pgmp22-f和pgmp22-r为引物扩增基因片段。

pcr反应体系具体为：10μm引物pgmp22-f1.5μl、10μm引物pgmp22-r1.5μl、2mmdntps5μl、10×缓冲液5μl、25mm硫酸镁3μl、基因组dna模板1μl、dna聚合酶1μl、超纯水补充至50μl。

pcr反应程序如下:98℃2min—98℃10sec，56℃30sec，68℃1min，35个循环—68℃5min。

2.4pcr产物的回收。

将上述pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的基因片段，按照dna纯化试剂盒操作说明进行pcr产物的回收。

2.5pet32a-pgmp22载体的构建。

将所得的回收产物克隆入pmd18-t载体后，转化宿主菌dh-5α，采用菌体pcr方法鉴定阳性克隆，挑取阳性克隆并提取质粒后，送华大基因公司进行测序，测序结果经ncbi数据库中的blast工具进行比对。测序结果正确的质粒及pet32a载体用限制性核酸内切酶bamhi和noti进行双酶切反应，条件为37℃反应2h，将酶切后的dna片段及载体回收并纯化。

酶切反应体系具体为：pcr产物35μl、bamhi1μl、noti1μl、10x酶切缓冲液5μl、超纯水8μl。

pet32a载体酶切体系：pet32a20μl、bamhi1μl、noti1μl、10x酶切缓冲液5μl、超纯水23μl。

用ligationhigh连接酶连接回收后的片段及pet32a载体，16℃连接1h，连接后的产物转化宿主菌tg1中，采用菌体pcr方法鉴定阳性克隆，并挑取阳性克隆提取质粒，进行双酶切鉴定后保存菌种。

连接体系如下：pcr产物bamhi、noti双酶切回收片段9μl、pet32a质粒bamhi、noti双酶切产物1μl、ligationhigh10μl。

3.蛋白表达、纯化与鉴定。

挑取经酶切鉴定正确的阳性菌落，37℃摇菌过夜，提取质粒转化至原核表达菌株escherichiacolirosetta-gamib(de3)中；取转化成功的菌液按1:100的比例转接到新鲜的lb培养基，37℃摇菌2h后测定菌液的od值；当od值达到0.6-0.8后，加入iptg至终浓度1.0mm，20℃诱导8h；10000rpm离心10min收菌；菌体加入1×ni-nta结合缓冲液重悬并进行超声裂解菌体(超声2s，间隔3s，全程时间30min，冰上进行)，4℃条件下，12000r/min离心5min，取上清液样品，加至5ml50％镍氨三乙酸琼脂糖柱ni-ntahis·bindsuperflow中纯化蛋白；将纯化后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的pbs缓冲液中进行梯度透析，4℃条件下进行，最终的产品溶于纯的pbs缓冲液中；10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳证明纯化成功(目标蛋白rpgmp22的分子量约为22kda)，见图4，其中，泳道m为蛋白分子量标准(蛋白marker)；泳道rpgmp22为纯化后重组蛋白，蛋白分子量为22kda，所得蛋白大小与预期相符。

实施例2。

免疫血清的制备及蛋白定位。

1.免疫血清的制备。

6-8周龄balb/c雌性小鼠10只，分2组，每组5只。第1组注射实施例1制备的重组蛋白，第2组为pbs对照组。用纯化的重组蛋白(50μg/小鼠)与弗氏完全佐剂研磨为油包水状乳剂，100μl/只皮下注射免疫小鼠。于第3周和第5周再分别给予两次加强免疫，25μg重组蛋白与弗氏不完全佐剂研磨为油包水状乳剂，100μl/小鼠皮下注射免疫小鼠。第三次免疫后10天收集小鼠血清，elisa检测小鼠血清特异性抗体水平，与pbs免疫组相比抗体水平显著升高(p<0.01)，抗体效价超过1:256000，见图5，抗体滴度达到1:256000，证明重组蛋白具有较强抗原性。

2.pgmp22表达阶段的确定。

2.1westernblot鉴定pgmp22的表达阶段。

纯化的配子体、合子和动合子用0.15％的皂角苷裂解去除红细胞，纯度可达到80％以上，用裂解液(1％tritonx-100,2％sds，pbs溶解，含蛋白酶抑制剂)进行裂解30min。5×10⁷/泳道疟原虫用10％的sds-page电泳分离。电泳完毕后，4℃60v恒压转膜3h。以5％脱脂奶粉(tbs溶解)4℃封闭过夜。tbst(0.1mtbs，ph7.4，0.02％tween20)漂洗三次，每次5min。tbst稀释抗rpgmp22鼠血清(1:500)与pvdf膜室温结合3h。小鼠抗rpbhsp70蛋白血清(1:500)作为阳性对照。用tbst将pvdf膜洗涤三次，每次5min。再用tbst稀释hrp标记的山羊抗小鼠igg(1:5000)，孵育pvdf膜，室温2h。tbst洗涤三次后用ecl发光方法在荧光图像分析系统中检测。结果显示在配子体阶段约22kda处有特异性条带，即抗rpgmp22免疫血清可识别配子体阶段表达的蛋白，见图6，其中，泳道泳道gam为配子体抗原，泳道zyg为合子抗原，泳道ook为动合子抗原；hsp70为阳性对照用来定量蛋白的上样量。在合子和动合子抗原泳道没有特异性条带，在配子体抗原泳道上22kda左右有特异性条带，证明pgmp22主要在疟原虫配子体阶段表达。

2.2ifa鉴定pgmp22的表达阶段。

纯化后的各阶段疟原虫经pbs洗一次后，4％多聚甲醛室温固定20min，细胞经/不经0.1％tritonx-100进行透膜10min。用50mm甘氨酸/pbs进行漂洗后，细胞用含5％脱脂奶粉的pbs37℃封闭30min。加入1:500稀释的抗rpgmp22免疫血清或抗pbs21单克隆抗体(阳性对照)，37℃孵育2h。随后加入羊抗鼠alexa-488荧光二抗(1:500稀释)，37℃孵育60min。dapi染色30min后经抗淬灭封片剂goldantifadereagent封片，荧光显微镜观察结果，adobephotoshop分析，结果显示抗rpgmp22的免疫血清可识别雌雄配子体及雌雄配子细胞表面抗原，提示pgmp22主要表达于疟原虫的受精前后有性生殖阶段表面，见图7，主要包括的疟原虫阶段有：雌、雄配子体及雌、雄配子；pbs21标记的动合子用作阳性对照。bf为亮视野，fitc为绿色荧光，dapi为核染色，merge为fitc和dapi的合成图像。在裂殖体、合子、未成熟动合子及成熟动合子阶段没有绿色荧光，在雌、雄配子体及雌、雄配子阶段有绿色荧光。证明pgmp22主要在疟原虫受精前后有性阶段表达。

实施例3。

打靶载体的构建与δpgmp22疟原虫的获取。

1.基因敲除的打靶载体的构建。

应用双交叉同源重组的方法靶向敲除pgmp22基因，成功构建基因敲除的打靶载体。根据载体构建流程图所示，见图8，pgmp22为目的基因，5’utr和3’utr为目的基因两侧同源臂，p1、p2及p3为设计的鉴定基因敲除基因型的引物。

首先，应用pcr方法成功扩增出5’utr片段，扩增长度为877bp，上下游引物5’端分别引入限制性内切酶hindⅲ和psti酶切位点；引物序列如下：pgmp22-5u-f(seqidno：5)：cccaagcttgccatgggttttgggccatgttatac；pgmp22-5u-r(seqidno：6):ggctgcagtttcccctacccttttatcgttaat；将5’utr及pl0034载体通过hindⅲ与psti双酶切构建出质粒pl0034-pgmp22-5u。

随后，成功扩增出3’utr片段，扩增长度为974bp，上下游引物5’端分别引入限制性内切酶kpni和noti酶切位点。引物序列如下：pgmp22-3u-f(seqidno：7)：ggggtaccatttgaatgatccgtagatgttaag；pgmp22-3u-r(seqidno：8):attgcggccgcgaggtgcattattctttaacttatg；将3’utr及pl0034-pgmp22-5u通过kpni和noti双酶切构建出重组质粒pl0034-pgmp22-5u-3u。

重组质粒经公司测序，测序结果与plasmodb疟原虫网站公布序列一致。

2.p.berghei裂殖体的培养与分离。

p.berghei感染苯肼处理过的balb/c小鼠，待感染率达5～10％，乙醚麻醉小鼠，心脏采血并将血液置于裂殖体培养基中(rpmi1640含20％(v/v)胎牛血清(fbs),50mg/l青霉素与链霉素,50ml培养基/0.5ml血液)，37℃100rpm培养16小时。培养物经55％的nycodenz密度梯度离心分离，收集中间灰白层裂殖体，pbs清洗2次，取lμl经giemsa染色，光镜下计数裂殖体含量与纯度。

3.基因敲除型疟原虫δpgmp22及基因恢复型疟原虫pgmp22-re的制备、筛选与鉴定。

pl0034-pgmp22-3u-5u打靶质粒经大量提取后，用hindⅲ和noti进行酶切使质粒完全线性化。将提纯后的线性化质粒电转入纯化的裂殖体内，并经尾静脉注射给小鼠。pgmp22基因将被pl0034载体内的药物压力选择标记物基因hdhfr与yfcu等替代，即是通过同源重组双交叉法，达到完全敲除pgmp22基因的目的。线性化质粒电转染疟原虫24h后，给予小鼠乙胺嘧啶(0.07mg/ml)饮用水，进行药物筛选。第6天开始取尾静脉血，制备薄血膜片，吉姆萨染色光学显微镜下观察监测外周血是否有疟原虫出现，当发现疟原虫后，取少量尾血进行外周血pcr鉴定基因型，设计pcr鉴定引物如下：p1和p2扩增出的是野生型；引物p1和p3扩增出的是同源重组成功的序列。序列如下：

p1(seqidno：9)：gtgaaactcaaacaaaccacacatagatta。

p2(seqidno：10)：ttatcataggttcgatagtttagcacat。

p3(seqidno：11)：ctggtgctttgaggggtgag。

pcr鉴定含有重组疟原虫基因型出现后，在疟疾血症达到1-3％时，小鼠尾静脉取血，用生理盐水将小鼠血液稀释，最终稀释量为1个irbc/100μl。将稀释的疟原虫经尾静脉注射给10只balb/c小鼠(100μl/只)进行克隆。小鼠给予乙胺嘧啶水饮用，感染后的第6天开始监测外周血是否有耐药虫株的出现，经疟原虫感染后的小鼠尾血再次pcr进行鉴定pcr鉴定结果显示我们成功敲除pgmp22基因，见图9，wt和ko分别为野生型疟原虫和敲除型疟原虫的基因组,其中，p1和p2扩增的是野生的基因型(1449bp)，p1和p3扩增的是重组成功的基因型(1180bp)。pcr结果显示基因敲除成功。

实施例4。

敲除型疟原虫δpgmp22表型及功能分析。

6-8周龄的雌性balb/c小鼠，分成两组，每组5只，苯肼处理小鼠后分别感染5×10⁶个δpgmp22或野生型疟原虫，于感染后的第三天giemsa开始计算配子体率与雌、雄配子体比率。同时尾静脉取10μl血液置于40μl动合子培养液中，疟原虫在25℃下培养15min，10min内用普通显微镜观察配子出丝数。将培养物继续在19-20℃下培养24h，用抗pbs21抗体与羊抗鼠alexa-488荧光二抗标记培养物，在荧光显微镜下计数合子，未成熟动合子及成熟动合子数量。小鼠于感染后的第三天，用饥饿了12h的按蚊吸食血液30min，实验组与对照组每组至少用50只按蚊，吸血后的按蚊于第24小时研磨，取1μl研磨液涂片，giemsa染色后计数合子，未成熟动合子及成熟动合子数量。并于第14天进行解剖，计数蚊胃壁的卵囊数与蚊感染率。δpgmp22型疟原虫与野生型(wt)疟原虫相比，配子体率及雌、雄配子体比例无显著差异；在含有等量雄性配子体的情况下，敲除株δpgmp22配子体出丝明显减少89％(p<0.0001)；动合子数下降了97％(p<0.0001)。δpgmp22型疟原虫感染按蚊后，与野生型相比，其蚊胃内动合子及卵囊形成完全被阻断，蚊子感染率减少到0，差异具有明显的统计学意义，见图10。其中，图10中a为配子体率，b为雌雄配子体比例，c为雄性配子体出丝数量，d为体外培养合子、未成熟动合子及成熟动合子数量，e为24小时蚊胃内合子、未成熟动合子及成熟动合子数量，f为蚊胃内壁卵囊数量。结果显示基因敲除之后配子体率及雌雄配子体比例不变，雄性配子体出丝及动合子形成数量显著下降，蚊胃内动合子和卵囊形成完全被阻断。基因敲除疟原虫与野生型疟原虫相比，卵囊数量及蚊虫感染率，见表1。结果显示基因敲除后卵囊数量显著下降，蚊虫感染率也明显下降。

实施例5。

基因恢复虫株pgmp22-re的制备、筛选与鉴定。

敲除株δpgmp22感染小鼠后，感染率达到5-10％时，取尾血提取血液基因组，pgmp22-5u-f(seqidno：5)及pgmp22-3u-r(seqidno：8)扩增re-fragment。提取敲除株δpgmp22成熟裂殖体，将re-fragment用hindⅲ和noti进行酶切使片段完全线性化。将提纯后的线性化质粒电转入纯化的裂殖体内，并经尾静脉注射给小鼠。线性化片段电转染疟原虫48h后，给予小鼠5-氟胞嘧啶饮用水，进行药物筛选。第6天开始取尾静脉血，制备薄血膜片，吉姆萨染色光学显微镜下观察监测外周血是否有疟原虫出现，当发现疟原虫后，取少量尾血进行外周血pcr鉴定基因型，设计pcr鉴定引物如下：p1(seqidno：9)和p2(seqidno：10)扩增的是恢复成功的基因型；引物p1(seqidno：9)和p3(seqidno：11)扩增出敲除的基因序列，见图8。

pcr鉴定含有恢复成功疟原虫基因型出现后，在疟疾血症达到1-3％时，小鼠尾静脉取血，用生理盐水将小鼠血液稀释，最终稀释量为1个irbc/100μl。将稀释的疟原虫经尾静脉注射给10只balb/c小鼠(100μl/只)进行克隆。小鼠给予5-氟胞嘧啶水饮用，感染后的第6天开始监测外周血是否有耐药虫株的出现，经疟原虫感染后的小鼠尾血再次pcr进行鉴定pcr鉴定结果显示我们成功恢复pgmp22基因，见图9，re为恢复型疟原虫的基因组,其中，p1和p2扩增的是野生的基因型(1449bp)，p1和p3扩增的是重组成功的基因型(1180bp)。pcr结果显示基因恢复成功。

实施例6。

基因恢复虫株pgmp22-re表型及功能分析。

6-8周龄的雌性balb/c小鼠5只，苯肼处理小鼠后分别感染5×10⁶个pgmp22-re疟原虫，于感染后的第三天，用饥饿了12h的按蚊吸食血液30min，实验组与对照组每组至少用50只按蚊，吸血后第14天进行解剖，计数蚊胃壁的卵囊数与蚊感染率。pgmp22-re与δpgmp22型疟原虫相比，卵囊形成明显增多，蚊子感染率恢复到92.2％，差异具有明显的统计学意义，见图10f为蚊胃内壁卵囊数量。结果显示敲除株δpgmp22进行基因恢复之后，蚊胃壁卵囊形成数量及蚊虫感染率机会恢复至野生型水平。基因恢复疟原虫卵囊数量及蚊虫感染率，见表1，结果显示恢复型疟原虫单个蚊胃壁卵囊形成平均数量与敲除型相比由0上升到93.7，蚊感染率也恢复到93.7％。

表1敲除株δpgmp22及恢复株pgmp22-re蚊胃壁卵囊形成数量及蚊虫感染率。

由此可见，pgmp22对雄配子出丝、动合子的发育以及卵囊的形成均具有至关重要的作用。

实施例5。

抗rpgmp22抗体传播阻断效应评价。

1.体内传播阻断-体外培养实验。

经rpgmp22/pbs免疫的小鼠，于三次免疫后第十天，小鼠经腹腔注射1×10⁶p.berghei感染的红细胞，感染第3天开始隔天涂片观察感染率，并于感染第3天观察配子体率，尾静脉采血检测配子体出丝，培养后计数动合子形成情况。重组蛋白免疫小鼠与对照组小鼠相比，疟原虫血症、配子体率及雌雄配子体比例没有差异，雄性配子体出丝显著下降65％(p＝0.002)，动合子形成数量显著下降93.4％(p<0.001)。见图11，其中a为疟原虫血症，b为配子体率，c为雌雄配子体比例，d为雄性配子体出丝，e为体外培养动合子形成数量。

2.体内传播阻断-直接膜伺实验。

经rpgmp22/pbs免疫的小鼠，于第三次免疫后第十天，小鼠经腹腔注射1×10⁶p.berghei感染的红细胞，感染第3天，用至少50只按蚊吸取小鼠血液30min，吸血后第24小时观察蚊胃内动合子形成数量，并于第14天检查蚊胃壁上的卵囊形成数量，重组蛋白免疫小鼠与对照组小鼠相比，蚊胃内动合子形成数量显著下降96.1％(p<0.001)，蚊胃壁卵囊数量显著下降97.4％(p<0.001)。见图11，其中f为蚊胃内动合子形成数量，g为蚊胃壁上的卵囊形成数量。卵囊数量及蚊虫感染率，见表2，结果显示对照组单个蚊胃壁卵囊形成平均数量与重组蛋白免疫组相比由107.5下降到2.8，蚊感染率也下降了84.1％。

表2：rpgmp22免疫小鼠蚊胃壁卵囊形成数量及蚊虫感染率。

但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>中国医科大学

<120>一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白（rpgmp22）及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用

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<213>人工合成

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