本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种三步法降解烟草薄片果胶含量的方法。
背景技术：
造纸法烟草薄片（paper-processreconstitutedtobacco）是一种烟草资源再生利用的产品。它是利用一些烟草废弃料、边角料，如烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，经过浸提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香工艺过程，制成烟叶薄片，用作卷烟填充物。造纸法烟草薄片，不仅在改善烟叶产品结构强度、燃烧性能及降低卷烟的烟气烟碱和焦油量等方面具有优势，同时还能降低烟叶单耗，节约生产成本，可以说是烟草工业近年最重要的成果之一。而近年来，生物技术与造纸法烟草薄片技术在生产中的结合应用，不仅发挥了造纸法烟草薄片的工艺优势，而且利用生物技术有选择地改变烟草化学成分，明显改善了烟草薄片的品质。
果胶质是烟草等植物细胞壁的构成成分，是结构复杂分子量大的复合糖类化合物。果胶在烟草中的含量约为5%-13%。烟草中果胶质含量过高使得烟草燃烧不充分，分解成小分子甲醇、乙酸等使卷烟吸味刺激性大。果胶在烟叶醇化过程中也会产生多达1.2%-1.5%的乙酸，进而使人呛咳、灼烧喉咙，并有辛辣的刺激性气味，在燃烧分解时还能产生挥发性羰基物等有害物质，对吸食健康不利。因此适当降低烟叶果胶含量对于提升烟叶品质、降低卷烟危害成分具有重要研究价值。
现有技术中，针对烟草薄片中果胶类物质的降解主要是采用传统的果胶酶进行的。但是由于烟草薄片中果胶结构的复杂性和多样性，而现有技术中的果胶酶普遍存在对于烟草薄片中果胶降解针对性不强、降解不够充分、降解过程难以控制的缺陷，因而急需探讨新的果胶酶及其在烟草薄片加工中的应用。
技术实现要素：
本发明目的在于通过提供一种利用特定菌株发酵制备的果胶酶，采用“三步法”将这种果胶酶应用在烟草薄片加工过程中，进而实现对一级和二级浸取液及混合浆中果胶的降解，从而降低烟草薄片果胶含量，最终改善烟草品质。
本发明的技术方案具体如下所述。
一种利用华根霉发酵制备的果胶酶，通过如下生产步骤制备获得：
（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养2~3d左右；
所述发酵菌株具体为黑龙江省轻工科学研究院在中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为cicc41051的华根霉（rhizopuschinensis），该菌株为可公开获得菌株；
所述活化培养基为pda培养基；从保藏培养基挑取菌株后接种活化培养基时具体可采用划线法接种；
所述pda培养基按常规方法制备，具体为：马铃薯提取液1.0l（200g马铃薯），葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，ph自然；
（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养36~48h左右（优选，25℃、160r/min培养48h），制备种子液；
所述种子培养基配方为：果胶3g/l，酵母粉15g/l，nano33.0g，mgso4•7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4•4h2o0.01g，k2hpo41.0g，蒸馏水1.0l，ph=6.0～6.5；
（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养3~16h以进一步发酵培养（优选，25℃、160r/min摇床培养10h左右）；
将种子液接种发酵培养基时，接种量具体可按4%体积分数比例进行接种；
所述发酵培养基配方为：果胶23.18~56.82g/l、酵母粉0.98~6.02g/l，ph=5~6（优选配方为：果胶50g/l、酵母粉3.0g/l，ph=6）；
（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液，测定酶活后即可作为果胶酶进行应用。
所述华根霉发酵制备的果胶酶在烟草中的应用，用于烟草薄片加工过程，用于降解烟草薄片原料中果胶。
具体使用时，以上述步骤（4）所制备粗酶液直接应用为例，将果胶酶粗酶液稀释0~50倍后，用于烟草薄片加工过程时，将其用于一级浸取液、二级浸取液和混合浆中的任意一个或几个；
用于一级浸取液时，一级浸取液以干重计，一级浸取液：果胶酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，将一级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，45~55℃、酶解2~4h；
用于二级浸取液时，二级浸取液以干重计，二级浸取液：果胶粗酶液=1g：1~10ml的比例，将二级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，45~55℃、酶解2~4h；
用于混合浆时，混合浆以干重计，混合浆：果胶酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，将混合浆与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，45~55℃，酶解2~4h。
优选处理工艺条件为，将果胶酶粗酶液稀释20倍后，
用于一级浸取液时，一级浸取液以干重计，一级浸取液：果胶酶粗酶液=1g：6ml的比例，将一级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，55℃、酶解4h；
用于二级浸取液时，二级浸取液以干重计，二级浸取液：果胶粗酶液=1g：4ml的比例，将二级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，55℃、酶解4h；
用于混合浆时，混合浆以干重计，混合浆：果胶酶粗酶液=1g：3ml的比例，将混合浆与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，55℃，酶解3h。
一种三步法降解烟草薄片果胶含量的方法，具体包括如下步骤：
（1）制备粗酶液，即按照上述步骤（1）至步骤（4）制备粗酶液；稀释0~50倍后备用，
（2）按现有工艺制备烟草薄片，在烟草薄片制备工艺的一级浸取液、二级浸取液和混合浆中的任意一个或几个过程中应用步骤（1）中所制备粗酶液，优选处理工艺为：一级浸取液、二级浸取液和混合浆中均应有步骤（1）中所制备粗酶液；
用于一级浸取液时，一级浸取液以干重计，一级浸取液：果胶酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，将一级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，45~55℃、酶解2~4h；
用于二级浸取液时，二级浸取液以干重计，二级浸取液：果胶粗酶液=1g：1~10ml的比例，将二级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，45~55℃、酶解2~4h；
用于混合浆时，混合浆以干重计，混合浆：果胶酶粗酶液=1g：1~10ml的比例，将混合浆与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，45~55℃，酶解2~4h。
本发明的总体技术路线是：将特定菌种首先进行发酵，通过筛选优化最佳发酵条件，获得最高果胶酶酶活的粗酶液，然后将粗酶液采用“三步法”直接用于烟草薄片生产过程，以降低薄片产品的果胶含量，进一步通过优化处理工艺，获得最佳降解效果，从而改善烟草品质。
初步试验表明，本发明采用特定菌种发酵所得粗酶液的酶活最高可达2986.87u/ml，具有较好的应用潜力。进一步用于烟草薄片原料处理后，最终可降低烟草薄片中果胶含量。将处理后烟草薄片用于卷烟后，进一步的感官抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟烟气更加细腻，甜润感有所增强且刺激性减轻，香气量增加，杂味减少，劲头足，且燃烧性更好，从而较好的改善了烟草的吸食品质。
需要解释的是，本申请中所述“三步法”是指对烟草薄片加工工艺中烟草原料的浸取液的不同处理阶段进行酶解处理，通过在不同工艺阶段分别加入发酵制备的果胶酶，从而降低最终烟草薄片成品的果胶含量。因而总体而言，本申请与现有烟草薄片加工工艺结合较为紧密，可直接配合现有烟草薄片加工工艺使用，由于不需额外改动生产工艺，具有较好的适用性，结合其改进效果而言，具有一定的推广应用价值。
附图说明
图1为烟草薄片加工工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中果胶含量测定、果胶降解率的计算方法简要介绍如下。
果胶含量测定
下述实施例中对于烟草薄片中的果胶含量采用咔唑比色法测定，具体测定步骤如下：
1、样品预处理，取待测样品（酶解处理后或未处理样品），量取10ml或10g（精确到0.001g）样品于250ml锥形瓶中，加入150ml加热至沸腾的0.05mol/l的hcl溶液，装上冷凝器，于90℃水浴中加热回流1h，冷却后把滤液移入250ml容量瓶中，加入2mol/l的naoh中和至ph=4，摇匀，收集滤液即得总果胶提取液，备用；
2、以半乳糖醛酸为标准品，咔唑比色法测定果胶含量，取步骤a中所得总果胶提取液1ml于含有6ml浓硫酸的试管中，摇匀；
85℃水浴加热15min；冷却，加入0.15%咔唑无水乙醇溶液0.3ml，摇匀，暗置30min；530nm下测吸光度；
3、根据咔唑比色法标准曲线和公式，求得待测液果胶含量；
所述公式为：果胶（%）=c×v×k×100/(w×106)；
其中，c：对照标准曲线求得的果胶提取稀释液的果胶含量（μg/ml)，v：果胶提取液原液体积（ml），k：果胶提取液稀释倍数，w：样品质量（g），106：质量单位换算系数；
所述咔唑比色法标准曲线的绘制方法为：
首先准确称取0.1000g半乳糖醛酸标准品于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至100ml容量瓶中，用ph为3的盐酸定容；
然后分别取0、1、2、3、4、5、6、7ml于8个100容量瓶中，用ph为3的hcl定容，得到浓度为0、10、20、30、40、50、60、70μg/ml的标准溶液；
最后以上述方法测定，然后绘制咔唑比色法的标准曲线。
果胶降解率计算
下述实施例中果胶降解率按以下公式计算：
ei=[（c0－ci）/c0]×100%；
其中，ei：果胶的降解率，c0：空白对照样中果胶水解生成的半乳糖醛酸的量；ci：酶处理的烟草薄片中果胶水解生成的半乳糖醛酸的量；空白对照样和酶处理的烟草薄片中果胶含量测定均按上述咔唑比色法进行测定。
酶活力检测方法：参照miller(1959)方法。取0.4mll%果胶溶液于试管中，加入1.0mlph=5的0.04mol/lna2hpo4-0.02mol/l柠檬酸缓冲液，45℃水浴平衡5min；加入0.1ml适当稀释的酶液，45℃反应30min（空白对照组以煮沸失活的酶液代替），加入3.0mldns溶液终止反应，沸水浴5min，冷却，定容至15ml，于分光光度计540nm波长下测吸光度，得到反应体系中半乳糖醛酸的量；
酶活力单位：1ml酶液或1g酶在45℃、ph5.0的条件下，每min分解底物产生lμg半乳糖醛酸的酶量定义为1单位聚半乳糖醛酸酶(pg)酶活；以u/ml表示；
酶活力计算公式：u=(c实验-c对照)*n*1000*(v总/v酶)/t；
其中：n—酶液稀释倍数，v总—反应总体积，v酶—酶液体积，t—反应时间（min）；
dns法标准曲线的绘制：
配置1mg/ml的半乳糖醛酸标准溶液；取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，补水至1ml，加dns试剂3ml，混合后于沸水中煮7min，冷却后定容至15ml，于分光光度计540nm波长下测吸光度；以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线。
实施例1
本实施例所提供的利用华根霉发酵所制备的果胶酶，通过如下生产步骤制备获得。
（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养3d左右；
所述发酵菌株具体为黑龙江省轻工科学研究院(l188)中科院微生物所在中国工业微生物菌种保藏中心(cicc)保藏的保藏号为cicc41051的华根霉，本实施例中所用菌株从保藏单位购买获得；
所述活化培养基为pda培养基；从保藏培养基挑取菌株后接种活化培养基时具体采用划线法接种；
所述pda培养基按常规方法制备，具体为：马铃薯提取液1.0l，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，ph自然；
所述马铃薯提取液制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0l煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0l，121℃灭菌即可。
（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，25℃、160r/min摇床培养48h，制备种子液；
所述种子培养基配方为：果胶3g/l，酵母粉15g/l，nano33.0g，mgso4•7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4•4h2o0.01g，k2hpo41.0g，蒸馏水1.0l，ph=6.0；
具体装液量为：100/250ml锥形瓶。
从活化培养基中挑取菌株时，具体按如下方法进行：
用打孔器在活化培养基平板上靠近菌株生长边缘的位置取两块0.5cm2的、长满新生菌丝的接种块，再接种于种子培养基中；
还需解释的是，在摇床发酵培养结束后后，可加入灭菌的磁珠和适量的玻璃珠，使用磁力搅拌器搅拌1h，以使将培养物打碎，便于作为种子液接种用于进一步发酵培养扩增使用。
（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，25℃、160r/min摇床培养10h以进一步发酵培养；
将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种；
所述发酵培养基配方为：果胶50g/l、酵母粉3.0g/l，ph=6。
（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液，测定酶活后即可作为果胶酶进行应用，其酶活为2986.87u/ml。
实施例2
将实施例1所制备粗酶液采用“三步法”分别作用于河南中烟烟草薄片工艺生产线上的一级浸取液、二级浸取液和混合浆三个位置（生产工艺流程图如图1所示），用于降解浸取液和混合浆中的果胶，具体使用方法为：
将实施例1中所制备果胶酶粗酶液（酶活为2986.87u/ml，理论而言，实施例1中所制备任意酶活的粗酶液均可用于降解果胶应用，但为确定较好降解条件及对烟草实际改善效果，因而仅以实施例1所制备的酶活为2986.87u/ml的粗酶液为例进行实验）进行适当稀释，然后将稀释后粗酶液根据不同体积比（浸取液、混合浆(干重g)与粗酶液体积(ml)之比）设计，45℃~55℃条件下，酶解2~4h；
酶解结束后，将粗酶液中的果胶酶进行失活处理，待进一步制成成品烟草薄片后进而测定样品中的果胶含量。
同样操作条件下，加入失活酶液（将粗酶液煮沸失活）作为对照组，最终计算果胶降解率。
一级浸取液酶解效果
实验过程中，为获得一级浸取液内果胶最佳的降解率，发明人采用正交试验设计的方法，选用l9(34)正交表对果胶降解条件（粗酶液稀释倍数、体积比、酶解温度、酶解时间）进行了优化试验设计。
具体正交实验因素水平设计如下：
不同酶解条件下对一级浸取液中果胶降解情况进行测定，具体测定结果如下所示：
从上述实验结果可以看出，将粗酶液稀释20倍、料液比1:6、反应温度55℃、处理时间4小时，在此条件下烟草薄片生产过程中果胶降解率达到最大，可将烟草薄片所含的果胶量由2.50%降低到1.60%，降解率达到36.00%。
二级浸取液和混合浆酶解参数
采用上述类似正交实验设计，分别对二级浸取液和混合浆的酶解工艺参数进行了优化，结果表明：
用于二级浸取液时，最佳工艺参数为：二级浸取液以干重计（所述干重为将浸取液在低温状态烘至无液体挥发即可），二级浸取液：果胶粗酶液=1g：4ml的比例，将二级浸取液与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，55℃、酶解4h；
用于混合浆时，最佳工艺参数为：混合浆以干重计，混合浆：果胶酶粗酶液=1g：3ml的比例，将混合浆与果胶酶粗酶液溶液混合均匀，55℃，酶解3h。
测定及计算结果表明，分别用于二级浸取液、混合浆时，降解率可达41.3%和49.8%。
为进一步检测酶解处理后烟草薄片对于烟草吸食效果的改进程度，以上述最佳酶解处理条件处理后烟草薄片（一级浸取液、二级浸取液和混合浆均一最佳工艺参数进行果胶降解）为例，发明人对其进行了实际卷烟抽吸实验，相关实验过程简要介绍如下。
将最佳酶解条件处理后烟草薄片在80℃条件下进行适当烘干（至湿度65%）后，切丝，然后置于恒温恒湿箱内平衡（相对湿度(60±5)%，温度(22±2)℃）48h；
按烟丝重量15%（即称取0.12g样品）与平衡后85%的许昌b2f均匀混合后按现有技术制备抽吸用卷烟，此即为试验组卷烟。
相同条件及相同方法下采用灭活酶处理的烟草薄片所制备的卷烟记为对照组，以蒸馏水处理的烟草薄片所制备的卷烟组记为空白组。
将各组卷烟样品（每支烟只总重0.80±0.01g）在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)%的恒温恒湿箱中平衡24h后，依据国家现行成品烟评析标准gb5606.4-2005对卷烟进行质量评吸鉴定和评价。
具体评价结果如下表所示：
从上述评价结果可以看出，酶解处理后的烟草薄片添加与卷烟后，可使卷烟的香气更加细腻，烟气透发性更好，同时能够增加甜润感且减轻刺激性，口感发涩程度减小，余味纯净舒适，劲头足，且燃烧性更好，卷烟的吸食品质得到了较好改善。