一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原SZO_430及其制备方法与流程

本发明涉及疫苗学技术领域，具体地说是一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430及其制备方法。

背景技术：

链球菌是一种常见的致病菌，因其细胞壁多糖抗原表位的不同，人为地将其分为20个群，分别为a、b、c…、v(缺i和j)。a群链球菌(groupastreptococci，gas)主要对人致病，而其他群则主要感染动物。b群链球菌(groupbstreptococci，gbs)和c群链球菌(groupcstreptococci，gcs)等溶血性链球菌则为家畜和家禽发生链球菌感染的主要病原体，如b群可以导致牛的乳腺炎和猪脓疱症；而c群则主要引起马腺疫及牛、羊、猪的败血症等病症。

马链球菌兽疫亚种(streptococcuszooepidemicus，sez)为兰氏分群的c群链球菌，没有宿主专嗜性，在自然界中发布广泛。链球菌感染可引发败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎和乳腺炎等多种疾病。该菌为一种重要的人畜共患病，人类可因食用污染的食物或与发病动物密切接触而引发该病的感染。对于该病的预防和治疗曾广泛的依赖于青霉素和阿莫西林等抗生素，但由于抗生素的滥用而使得该病原菌产生了耐药性，同时也存在药物残留等问题。因此，开发有效的疫苗对于链球菌的防治具有重要的意义。前期已有关于马链球菌兽疫亚种的亚单位疫苗的研究，但是开发更多的保护性抗原对于链球菌的防治意义重大。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430及其制备方法，其主要作用于宿主细胞，使得病原体容易粘附和入侵宿主组织。

本发明一方面保护一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述抗原szo_430由szo_430基因编码；

进一步地，所述抗原szo_430为szo_430重组蛋白，且由529个氨基酸残基组成，分子量为57.35kda。

szo_430重组蛋白为sezszo_430重组蛋白(rszo_430)。

本发明第二方便保护第一方面所述一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430的制备方法，包括如下步骤：

s1、pcr扩增：使用马链球菌兽疫亚种c55138株基因组为模板，用引物进行pcr扩增；

优选地，步骤s1中，所述引物为：

正向引物(seqidno.3)：5’-cccggatccggagtgaaggcgaatga-3’，

其中，划线部分为bamhi酶切位点；

反向引物(seqidno.4)：5’-ctcaagcttcaactgacctgctggtttt-3’，

其中，划线部分为hindiii酶切位点；

s2、与载体连接：将步骤s1获得的pcr产物通过限制性内切酶酶切后与pet-32a载体连接；

s3、转化和诱导：将经步骤s2连接好的载体转化大肠杆菌感受态细胞bl21后，于摇床进行培养，待其进入指数生长期，加入iptg诱导；

步骤s3中，摇床上诱导培养温度为：26～37℃；优选为37℃；

步骤s3中，诱导时间为：3～5h；

s4、纯化：收集步骤s3获得的细菌离心收集菌体，再用pbs重悬后破碎，离心收集上清，取上清液经ni-nta层析柱纯化，获得纯化的szo_430重组蛋白，即为马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430。

本发明第三方便保护第一方面所述抗原szo_430在制备链球菌疫苗中的应用。

本发明第四方面保护制备马链球菌兽疫亚种疫苗的方法，具体为：采用抗原szo_430与montanidegel01pr(seppic,france)佐剂乳化后作为疫苗，疫苗中抗原szo_430的浓度为100～200μg/ml。

一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430及其制备方法，其优点是：

①、本发明获得的抗原szo_430具有优异的免疫原性，也可诱发高水平的抗体滴度、诱导较强的杀菌能力，同时，将抗原szo_430分布于sez细菌表面，可明显抑制sez对hep-2细胞的粘附能力，抑制率达16.86％；

②、通过pcr技术获取目的基因，通过酶切酶连的方法获得重组质粒，将其转入大肠杆菌中诱导表达，获得szo_430重组蛋白，方法简单、实用性强；

③、抗原szo_430可作为制备链球菌疫苗的材料，使得病原体易于粘附和入侵宿主组织，效果优异。

附图说明

图1为重组蛋白szo_430的sds-page和免疫印记分析；

其中，泳道m为蛋白预染marker，泳道1～3分别为重组大肠杆菌诱导前、诱导表达和纯化后的szo_430；泳道4为rszo_430与sez感染康复猪血清的westernblot结果；

图2为免疫组、阳性对照组和阴性对照组的小鼠，经sezc55138攻毒后的存活率；

图3为被动保护试验中实验组、阳性对照组和阴性对照组的小鼠，经sezc55138攻毒后的存活率；

图4、图5均为重组蛋白szo_430在小鼠体内产生的抗体滴度情况；

图6为实验组、阴性对照组和阳性对照组小鼠的全血致死率；

图7为定量pcr分析结果；

图8、9为szo_430重组蛋白在sez表面的分布情况；

图10为szo_430对sez粘附hep-2细胞的抑制分析图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下就具体实施例及附图对本发明做进一步说明；

实施例一

一、试验材料与生长条件：

菌株选取sezc55138菌株，载体为大肠杆菌pet-32a，感受态细胞为大肠杆菌bl21；

菌株培养条件为：加入5％胎牛血清的tsb培养基或tsa培养基进行培养，且于37℃震荡培养8h或od600达到0.6～1.0即可；

其中，sezc55138菌株、大肠杆菌pet-32a、大肠杆菌bl21、胎牛血清等均为市售产品。

二、具体制备步骤：

s1、pcr扩增：使用马链球菌兽疫亚种c55138株的基因组为模板，用以下引物进行pcr扩增，获得含1053bp的碱基序列(如seqidno.1所示)；

正向引物(seqidno.3)：5’-cccggatccggagtgaaggcgaatga-3’，

其中，划线部分为bamhi酶切位点；

反向引物(seqidno.4)：5’-ctcaagcttcaactgacctgctggtttt-3’，

其中，划线部分为hindiii酶切位点；

pcr扩增反应体系为：

pcr体系如下：

pcr扩增反应条件为：

94℃5min，(94℃30s，57℃30s，72℃30s)30个循环，72℃7min，4℃保存；

其中，c55138株的基因组由常规方法从c55138株中提取获得；

引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；

s2、与载体连接：将步骤s1获得的pcr产物通过限制性内切酶酶切后与pet-32a载体连接；(其中，限制性内切酶为bamhi和hindiii)

s3、转化和诱导：将经步骤s2连接好的载体转化大肠杆菌bl21感受态细胞，于37℃恒温摇床中培养，待其进入指数生长期，加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导3h；同时做非诱导对照试验；

其中，iptg即异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质。当带有lacz基因载体dna以lacz缺失细胞为宿主进行转化时，它可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

s4、纯化：收集步骤s3获得的细菌离心收集菌体，再用pbs重悬后经高压破碎仪以1000bar压力高压破碎，离心收集上清液，取上清液中的目的蛋白经ni-nta层析柱纯化，获得纯化的szo_430重组蛋白(其为529个氨基酸残基组成的蛋白质(如seqidno.2所示))，即为马链球菌兽疫亚种保护性抗原szo_430。

三、szo_430重组蛋白的sds-page和免疫印记分析：

将szo_430重组蛋白使用感染过sez的康复猪血清作为一抗，山羊抗猪igg(h+l)-hrp作为二抗进行免疫印迹分析

1、将未诱导表达菌株、诱导表达菌株培养液各取1ml离心收集菌体，同时取ni-nta柱纯化的蛋白，分别加入40μlpbs重悬后与10μl蛋白上样缓冲液混合沸水浴6～8min即为sds-page上样样品；

2、在第一块sds-page胶样品孔中依次加入5μl蛋白上样marker，未诱导样品10μl、诱导样品10μl、蛋白纯化样品10μl、同时在第二块sds-page胶样品孔中依次加入5μl蛋白上样marker；蛋白纯化样品10μl；

3、调节电泳电压为80v，时间20min；电泳完成后切换电压为120v、80min、电泳结束；

4、将第一块胶放入考马斯亮蓝r-250中进行染色2h，染色结束后置于脱色液中脱色直至清晰，拍照保存实验结果；

5、将第二块胶进行转膜，转膜条件为20v，45min；转膜结束后，用pbst洗涤液洗膜三次，5min/次，将膜用10％的脱脂奶粉封闭1h；

6、封闭完成后，洗膜三次，将膜用sez感染康复猪血清作为一抗孵育1h(1:1000稀释)；

7、一抗孵育完毕，用pbst洗涤液洗膜三次，5min/次，将山羊抗猪igg(h+l)-hrp作为二抗(1:3000稀释)，孵育1h；

8、孵育完毕，用pbst洗涤液洗膜三次后，加入ecl显示液进行显色，并拍照保存实验结果；

如图1可知：成功表达了目的蛋白，且目的蛋白的条带大小与预测的大小一致。通过ni-nta层析柱纯化的方式获得的重组蛋白，通过免疫分析实验表明，该重组蛋白与感染sez的康复期猪血清表现出良好的免疫反应性(见图1)。

四、小鼠免疫接种与攻毒试验

1、选取30只6周龄健康的km雌鼠，随机分为3组，每组10只，分别设置为第一组、第二组、第三组备用；

2、实验组：50μg纯化的rszo_430用montanidegel01pr(seppic，france)佐剂乳化后，腹腔注射免疫第一组小鼠，间隔14天后，以同样的方式第二次免疫小鼠；

3、阳性对照组：将c55138灭活后经montanidegel01pr(seppic，france)佐剂乳化后，以1×10⁹cfu/ml免疫第二组小鼠，采用腹腔注射的方式，间隔14日后，以同样的方式进行二次免疫；

4、阴性对照组：将第三组小鼠均腹腔注射经montanidegel01pr(seppic，france)佐剂乳化的pbs做对照(如上述步骤2、3一样进行二次免疫)；

5、三组小鼠在第二次免疫10天后，尾静脉采血、离心收集血清，然后将三组小鼠均攻毒sezc55138菌株(2×10⁵cfu/ml)；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：

1)阳性对照组的小鼠总体为未表现明显的临床症状，在整个攻毒期间只有1只小鼠死亡。

2)阴性对照组的小鼠在攻毒后第二天即开始出现死亡，存活的小鼠表现出明显的临床症状，例如被毛零乱，对外界刺激反应迟钝，不好动等，并在攻毒后4天内全部死亡；

3)实验组的10只小鼠，攻毒后第三天开始出现死亡，存活的小鼠表现出轻微的临床症状，如精神状态较差，消瘦，在5天内即全部恢复正常，最终有5只小鼠死亡(见图2)。

结果表明：szo_430重组蛋白可以部分保护小鼠抵抗sez强毒株的攻击。

五、被动保护试验分析

用rszo_430二免血清被动免疫小鼠，然后再进行攻毒试验，具体步骤如下：

1、选取30只6周龄健康的km雌鼠，随机分为3组，每组10只，分别设置为第一组、第二组、第三组备用；

2、阳性对照组：用sez灭活疫苗二免血清静脉注射免疫第一组小鼠；

3、阴性对照组：用正常小鼠血清静脉注射免疫第二组小鼠；

4、实验组：用rszo_430二免血清静脉注射免疫第三组小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠均用sezc55138菌株进行攻毒试验(2×10⁵cfu/ml)；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：

1)阳性对照组小鼠在攻毒试验中基本未表现出临床症状，最终有1只小鼠死亡；

2)阴性对照组小鼠在攻毒后表现为精神萎靡，对外界刺激反应迟缓、被毛粗乱等症状，且在5天内均陆续死亡，最终只有1只存活。

3)实验组小鼠在攻毒后主要表现为精神萎靡，对外界刺激反应迟缓、被毛粗乱等症状，但3天后基本恢复正常，最终有3只小鼠死亡，存活率为70％(见图3)。

结果表明：重组蛋白szo_430和sez灭活疫苗(阳性对照组)对小鼠表现出较好的被动保护，而正常血清(阴性对照组)不能为小鼠提供保护。

六、抗体滴度测定

通过elisa方法测定血清igg，具体步骤如下：

将纯化的szo_430重组蛋白于4℃过夜包被后采用步骤四的方式进行二免操作，将二免10天后的小鼠血清进行梯度倍比稀释后，将各个稀释度的溶液均取100μl加入酶联板，37℃反应后加入辣根酶标记的山羊抗鼠igg，用酶标仪读取od值。

取od值大于对照血清平均od值+3倍方差sd(标准差)的血清最大稀释倍数作为血清抗体。

为了推断免疫类型，igg1和igg2a分别进一步作为测定th2和th1的免疫反应类型。

实验结果：免疫组的igg滴度的水平显著高于阴性对照组的抗体水平(p<0.01)(见图4)。进一步的实验结果表明szo_430重组蛋白可以引起显著的th1/th2免疫反应，与igg2相比，igg1占主导地位(见图5)。

七、全血致死量分析

为测定szo_430抗体的杀菌活性，将小鼠血液肝素化后，使用rszo_430二免血清或对照血清与血液中存活的sez孵育后进行评估，具体步骤如下：

1、待sezc55138菌株生长至指数中期，离心收集菌体，用无菌pbs重悬菌体，将细菌浓度调整为10⁴cfu/ml；

2、实验组：取900μl健康小鼠经肝素抗凝全血，与100μlrszo_430重组蛋白二免血清混合；

3、阴性对照组：取900μl健康小鼠经肝素抗凝全血，与100μl正常小鼠血清混合；

4、阳性对照组：取900μl健康小鼠经肝素抗凝全血，与100μlsez灭活疫苗二免血清混合；

5、分别向上述步骤2、3、4获得的混合液中加入100μlsez菌液，置于37℃恒温摇床震荡培养90min；

6、每组分别取100μl样品，涂布于tsa平板中，进行3个重复，计算孵化前后孵化后存活的细菌量；

7、存活率为处理后存活的细菌量相对于加入的细菌数量的百分比。

实验结果：阴性对照组杀菌率仅为13.08±0.98％；阳性对照组杀菌率高达89.95±1.93％；实验组杀菌率为58.82±1.14％(见图6)。

结果表明：阳性对照组和实验组抗体对细菌均有较强的致死能力，而阴性对照组则无明显致死能力；anti-rszo_430抗体可以诱导高水平的杀菌能力。

八、荧光定量pcr检测体内诱导基因的表达水平

为了评估sezszo_430基因在小鼠体内外的表达水平，通过荧光定量pcr技术定量检测szo_430基因体内外的转录水平，具体步骤如下：

1、从感染sez的小鼠脾脏内获得体内增殖细菌，无菌采集脾脏组织，碾磨后于4℃，850×g离心5min，取上层清液于4℃，15500×g离心5min，沉淀即为脾脏组织内的细菌；

体外培养的细菌待其生长至指数中期后离心收集沉淀即可；

2、用酸酚法提取细菌总rna；

3、将rna逆转录为cdnas，以cdna样品为模板进行定量pcr反应，所有反应进行三个重复；

在实时荧光定量pcr中，使用下述引物对szo_430基因进行定量分析：

正向引物(seqidno.5)：5’-gaactcggtcgcaaag-3’；

反向引物(seqidno.6)：5’-gcagcagcagtgaaaa-3’；

在实时荧光定量pcr中，使用下述引物对16srrna基因进行定量分析：

正向引物(seqidno.7)：5’-atccgaactgagattggc-3’；

反向引物(seqidno.8)：5’-cccttatgacctgggcta-3’；

实验结果：表明在三组实验小鼠体内，szo_430基因的转录水平均要高于体外培养的转录水平(见图7)。

九、流式细胞术分析

1、用含1％bsa的pbs重悬sezc55138细菌，取菌液200μl；

2、实验组加入经szo_430免疫的小鼠血清100μl，对照组加入经pbs免疫的小鼠血清100μl，4℃孵育15min，然后室温孵育30min；

将实验组、对照组分别下述步骤3、4、5，具体为：

3、5000rpm离心3min，收集细菌；

4、用含1％bsa的pbs洗3次，加入fitc-山羊抗鼠二抗，室温下孵育45min；

5、用含1％bsa的pbs洗涤3次，用500μl含1％bsa的pbs重悬，将重悬后的菌液加入到流式细胞仪中进行检测。

实验结果：未染色的细菌与正常血清孵育后染色的细菌所激发的荧光强度基本没有差别，且均显著低于szo_430抗体处理细菌的平均荧光强度，表明szo_430蛋白分布于sez的表面(见图8为对照组试验图、图9为实验组对照图)。

十、粘附抑制试验

为检测szo_430对sez粘附hep-2细胞的影响，通过hep-2细胞的粘附试验进行检测，主要步骤如下：

1、使用两个24孔板，并在两个24孔板中均进行如下操作：加入含10％胎牛血清的dmem培养细胞，将其置于37℃细胞培养箱中培养，待其长至80％左右；使用预冷的pbs/bsa洗涤细胞3次；

2、其中一孔板内，每孔加入200μg/ml的纯化的rszo_430孵育2h作为实验组；

另一孔板内，每孔中加入200μg/ml的bsa孵育作为对照组；

3、孵育完成后，用pbs/bsa洗涤3次，然后向各孔中加入1ml5×10⁷cfu/ml的sezc55138株，在37℃，5％co2条件下孵育2h；

4、用pbs/bsa洗去没有粘附的细菌，然后用1mlpbs(含0.2％的tritonx-100)将细胞吹散，稀释后平板计数；

5、szo_430对sez粘附hep-2细胞的抑制率通过如下公式计数：抑制率＝[1-(szo_430处理的细胞的细菌数/bsa处理的细胞的细菌数)]×100％。

实验结果：rszo_430能够抑制sez对hep-2细胞的粘附作用，相对于对照组而言，抑制率为16.86％(见图10)。

本发明中未详细说明的实验步骤及实验条件均为常规技术，因此，未进行详细说明。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>湖北大学

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