一种大蒜阿霍烯对照品的制备方法与流程

本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及大蒜中阿霍烯对照品的制备方法。

背景技术：

大蒜一般含有约1％的蒜氨酸，在低温储藏的过程中，大蒜中蒜氨酸的含量会有所增加。在切割、捣碎、咀嚼等情况下，蒜氨酸酶(alliinase)会迅速将蒜氨酸分解为硫代亚磺酸酯，其中的主要化合物为蒜素(allicin)。蒜素及其他硫代亚磺酸酯在室温下很不稳定，数小时即可分解为硫化物形式、乙烯基二硫杂苯(二噻烯dithiins)、阿霍烯类(ajoene)。

经对现有技术文献及公开专利进行检索发现，中国专利公布号“cn103525878a”，名为《一种富含阿霍烯的组合物的制备方法》，公开了如下技术方案：溶解在缓冲液中的蒜氨酸，在蒜酶的催化下发生反应，将从大蒜中提取的天然蒜氨酸转化成二烯丙基硫代亚磺酸酯，得到含有二烯丙基硫代亚磺酸酯的反应液；将该反应液通过膜浓缩，再使用有机溶剂萃取富集二烯丙基硫代亚磺酸酯，然后经过多次的回收溶剂、萃取得到阿霍烯含量大于80％的组合物。该技术方案使用有机溶剂多、工序复杂容易导致产品所得率小。中国专利公布号“cn104974068a”，名为《一种阿霍烯的制备方法》，公开了如下技术方案：将大蒜破碎，加入提取液混合，得到产物a，对产物a进行提取处理后，再进行过滤和/或离心处理，取获得溶液为产物b，将产物b中的溶剂去掉，然后加入植物油混合，得到产物c，将产物c加入吸附剂混合，得到产物d，用含有洗脱剂的溶液洗脱产物d，得到产物e，产物e去掉溶剂，得到浓度达到89.76阿霍烯产品。但是该方法存在植物油用量较大，工艺比较复杂，阿霍烯纯度相对较低的问题。

到目前为止，国家食品药品监督管理总局及国内公司尚未能提供大蒜阿霍烯的对照品，国外也对国内进行技术保密。因此，从大蒜中制备阿霍烯对照品，对大蒜的深度开发具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大蒜阿霍烯对照品的制备方法，以解决现有技术从大蒜中提取阿霍烯工艺过程中使用过多有机溶剂或植物油，工艺复杂，阿霍烯纯度低等问题。

为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

一种大蒜阿霍烯对照品的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将大蒜粉碎，加入第一溶剂后，高压均质提取，过滤，得提取液；

(2)往提取液中加第二溶剂萃取，静置分层，取上层，得萃取液；

(3)萃取液减压浓缩后经过硅胶柱层析，用第三溶剂洗脱得第一洗脱液；

(4)第一洗脱液减压浓缩后，通过制备液相分离纯化，得到富含阿霍烯的第二洗脱液；

(5)把步骤(4)得到的富含阿霍烯的第二洗脱液减压浓缩除去溶剂，得到阿霍烯对照品。

进一步地，所述步骤(1)中，大蒜粉碎成50μm～300μm的蒜粒。优选为100μm。

进一步地，所述步骤(1)中，高压均质提取的条件为：第一溶剂为纯化水，料液比是1:2～1:10，优选为1:5；压力为20～80mpa，优选为50mpa；提取0.5～2h，优选为1h；提取1次。

进一步地，所述步骤(2)中，第二溶剂为乙酸乙酯、正己烷、异丙醇、正丁醇、氯仿中的一种或多种，优选为乙酸乙酯。

进一步地，所述步骤(2)中，萃取次数为1～3次，优选为2次；用量为：大蒜质量：溶剂体积＝1:0.5～2，优选为1:1。

进一步地，所述步骤(3)中，硅胶柱层析选用200～300目硅胶。

进一步地，所述步骤(3)中，柱层析洗脱的第三溶剂为乙酸乙酯和石油醚混合溶剂。

进一步地，所述步骤(3)中，层析洗脱流速1～5bv/h，优选为2bv/h；按体积比计，先以乙酸乙酯：石油醚＝20:80的混合溶剂洗脱除杂，再以乙酸乙酯：石油醚＝30:70～70:30的混合溶剂洗脱，优选为乙酸乙酯：石油醚＝50:50的混合溶剂洗脱并收集该洗脱液。

进一步地，所述步骤(4)中，制备液相分离填料为10～100μm反相c18，优选为50μm。

进一步地，所述步骤(4)中，制备液相流动相为乙醇、甲醇、乙腈中的一种或多种；体积分数为45％～75％，优选为60％；流速5ml/min～25ml/min，优选为15ml/min。

本发明提的优点在于：

1、将大蒜粉碎后，加入纯化水高压均质，一方面使阿霍烯快速从大蒜中分散在水中，另一方面可以使蒜氨酸与蒜酶接触，促使蒜氨酸转化为阿霍烯；

2、通过溶剂萃取，将大蒜水溶液中的阿霍烯快速富集到萃取溶剂中，除去水溶性杂质，起到富集纯化作用；

3、萃取溶剂经过浓缩后通过硅胶柱层析进一步纯化，硅胶对脂溶性成分具有较好的分离纯化作用。首先通过较低比例的乙酸乙酯溶剂除去部分杂质，再用高比例的乙酸乙酯溶剂洗脱阿霍烯；

4、最后通过制备液相纯化阿霍烯，制备液相可以选择性的分离纯化阿霍烯。

通过溶剂萃取、硅胶柱层析及制备液相可以快速制备阿霍烯对照品，该工艺过程简单、生产周期短，可用于大蒜阿霍烯对照品的制备，为大蒜阿霍烯的开发提供技术支持。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是实施例1中步骤(4)制备液相分离纯化色谱图；

图2是实施例1中阿霍烯红外光谱(ir)图；

图3是实施例1中阿霍烯质谱正离子图；

图4是实施例1中阿霍烯的¹h-nmr图(500mhz)；

图5是实施例1中阿霍烯的¹³c-nmr图(500mhz)；

图6是实施例1中阿霍烯的高效液相色谱图(hplc)。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

1、取瓣蒜1kg，去皮，将大蒜粉碎至100μm，加5l纯化水，50mpa高压均质提取1h，提取1次，过滤，得提取液；

2、往提取液中加乙酸乙酯萃取2次，每次1l，静置分层，取上层，合并上层液得萃取液；萃取液45～65℃减压浓缩，得萃取物；

3、取200～300目硅胶100g，装入层析用玻璃柱，萃取物干粉上样。按体积比计，用2bv乙酸乙酯：石油醚＝20:80的混合溶剂以2bv/h的流速洗脱除杂，再用2bv乙酸乙酯：石油醚＝50:50的混合溶剂以2bv/h的流速洗脱阿霍烯；

4、洗脱液45～65℃减压浓缩后，加甲醇溶解。取50μmc18制备柱，用体积分数为60％的甲醇以15ml/min分离制备阿霍烯，收集阿霍烯色谱峰洗脱液；

5、阿霍烯色谱峰洗脱液55～75℃减压浓缩除去溶剂，得到阿霍烯对照品。

阿霍烯对照品经四大光谱及高效液相色谱纯度检测，阿霍烯纯度为99.5％，符合国家标准。

表1是实施例1中阿霍烯红外光谱(ir)解析结果；

表1红外光谱图解析

实施例2

1、取独蒜1kg，去皮，将大蒜粉碎至50μm，加2l纯化水，80mpa高压均质提取0.5h，提取1次，过滤，得提取液；

2、提取液加2l正丁醇萃取1次，静置分层，取上层，得萃取液；萃取液45～65℃减压浓缩，得萃取物；

3、取200～300目硅胶100g，装入层析用玻璃柱，萃取物干粉上样。按体积比计，用2bv乙酸乙酯：石油醚＝20:80的混合溶剂以2bv/h的流速洗脱除杂，再用2bv乙酸乙酯：石油醚＝30:70的混合溶剂以2bv/h的流速洗脱阿霍烯；

4、洗脱液45～65℃减压浓缩后，加甲醇溶解。取100μmc18制备柱，用体积分数为45％的甲醇以25ml/min流速分离制备阿霍烯，收集阿霍烯色谱峰洗脱液；

5、阿霍烯色谱峰洗脱液55～75℃减压浓缩除去溶剂，得到阿霍烯对照品。

阿霍烯对照品经高效液相色谱检测，阿霍烯纯度为99.1％。

实施例3

1、取瓣蒜1kg，去皮，将大蒜粉碎至300μm，加2l纯化水，20mpa高压均质提取2h，提取1次，过滤，得提取液；

2、提取液加氯仿萃取3次，每次500ml，静置分层，取上层，合并上层液得萃取液；萃取液45～65℃减压浓缩，得萃取物；

3、取200～300目硅胶100g，装入层析用玻璃柱，萃取物干粉上样。按体积比计，用2bv乙酸乙酯：石油醚＝20:80的混合溶剂以2bv/h的流速洗脱除杂，再用2bv乙酸乙酯：石油醚＝70:30的混合溶剂以2bv/h的流速洗脱阿霍烯；

4、洗脱液45～65℃减压浓缩后，加甲醇溶解。取10μmc18制备柱，用体积分数为75％的甲醇以5ml/min分离制备阿霍烯，收集阿霍烯色谱峰洗脱液；

5、阿霍烯色谱峰洗脱液55～75℃减压浓缩除去溶剂，得到阿霍烯对照品。

阿霍烯对照品经高效液相色谱检测，阿霍烯纯度为99.3％。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。