双酚类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明涉及海洋放线菌培养制备化合物
技术领域：
，具体涉及一种双酚类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：雄激素和雌激素与受体相结合在人体内发挥着重要生理作用，当人体内雄/雌激素分泌过多时，会影响正常的生理机能并诱发癌症等疾病，因此研究雄/雌激素受体(ar/er)的作用机制意义重大，而芳香化酶是细胞色素p450酶系中的一种，广泛存在于卵巢、肝脏、肌肉、脂肪和肿瘤组织中，可以催化雄烯二酮、睾酮脱去19位的碳并使a环芳香化，分别形成雌二醇和雌酮，作为雌激素生物合成的限速酶，对雄/雌激素受体的具有关键的调节作用。研究证明芳香化酶与多种常见的女性疾病的病理过程有着密切的联系，如：乳腺癌、子宫内膜癌、子宫内膜异位症、卵巢癌、平滑肌瘤等以及男性疾病，如：雄激素依赖性、敏感性前列腺癌。因此芳香化酶可作为一个极好的药物作用靶标，高选择性的芳香化酶抑制剂(ais)可以在提高疗效的同时又减少不良反应，还能增加患者的耐受性。同时雄/雌激素受体在细胞组织中具有独特的功能结构域，包括羧基末端配体结合域(lbd)、包含锌指基序的dna结合域(dad)、n末端结合域(ntd)包含1个或多个转录激活中心。ar/er可以在激素产生时不同功能性激活人体的生理机能作用，但是在癌症细胞组织内没有激素时通过改变转导途径被激活，研究发现癌症细胞中存在激活的ar/er，因此发现选择性优良的受体抑制剂，可用于治疗与雄/雌激素受体相关的各种癌症类型。有研究表明，双酚a类化合物对于ar/er具有较好的生物活性，对于开发应用于相关肿瘤治疗具有重大意义。海洋放线菌代谢产物丰富，结构多样化，活性新颖，易于培养，对于发现具有肿瘤活性的先导化合物具有较大开发空间，从而扩大天然来源的bpa类化合物作为前列腺癌、乳腺癌等治疗药物开发的应用前景。技术实现要素：本发明提供了一种双酚类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明采用大米固体培养基发酵培养海洋放线菌，最终由发酵产物分离纯化获得式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ结构的化合物。一种双酚类化合物，为式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ结构；所述的双酚类化合物的制备方法，由海洋放线菌固体发酵产生，经分离纯化得到，易于操作和实施。所述的双酚类化合物的制备方法，包括以下步骤：1)将海洋放线菌接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，获得种子液；2)将上述所得的种子液接种于大米固体培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物；3)将上述所得的发酵产物进行分离纯化后，获得式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ结构的化合物。步骤1)中，所述的海洋放线菌，具体可采用市售产品，如采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌streptomycessp.cicc11027，订购网址：http://www.china-cicc.org/。所述的摇床培养的条件为：在26℃～30℃、130rpm～230rpm的摇床中培养2～4天，进一步优选，在28℃、180rpm的摇床中培养3天。步骤2)中，所述的大米固体培养基，由大米和海水组成，所述的大米的质量和海水的体积之比为30g～50g：50ml～70ml，进一步优选，所述的大米的质量和海水的体积之比为40g：60ml，即按大米质量40g和海水体积60ml配比后经高压湿热灭菌所得。所述的静置培养的条件为：在23℃～33℃下静置培养100～140天，进一步优选，在28℃下静置培养120天。步骤3)中，所述的分离纯化包括：由乙酸乙酯等体积浸泡萃取获得的发酵产物，经凝胶柱色谱、制备液相色谱获得式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ结构的化合物。所述的凝胶柱色谱的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(lh-20)，采用的洗脱剂为甲醇-水溶液，进一步优选，采用的洗脱剂为甲醇体积数20％-100％的甲醇-水溶液；所述的制备液相色谱的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为甲醇-水的溶液、含三氟乙酸的甲醇溶液-水的体系，进一步优选，采用的流动相为体积百分数40％-100％甲醇-水的溶液；体积比百分数40％至100％的含三氟乙酸的甲醇溶液-水的体系，即含三氟乙酸的甲醇溶液与水的体积比为40：60至100：0，所述的含三氟乙酸的甲醇溶液为含体积百分数0.05％三氟乙酸的甲醇溶液。本发明采用人前列腺癌细胞株pc3进行活性评价试验，本发明提供的化合物式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ能抑制pc3的生长，充分说明该类化合物具有受体抑制活性从而发挥细胞毒性作用，因此可制备获得作为抗肿瘤药物。所述的式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ结构的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，可单一成分或多成分组合可用于治疗与雄/雌激素受体(ar/er)和芳香化酶有关的乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等癌症，以及艾滋病，痤疮、头发脱落、多囊卵巢等疾病的药物。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明中具有抗肿瘤活性的化合物，可用于开发治疗雄/雌激素受体、芳香化酶相关的癌症药物；所述的式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ结构的化合物可用于研究微生物代谢通路中对有细胞毒性化合物的生合成途径；本发明实验操作简单，易于扩大生产，具有较好的应用前景。附图说明图1为式ⅰ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-30f的1h-nmr图谱；图2为式ⅰ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-30f的13c-nmr图谱；图3为式ⅰ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-30f的hsqc图谱；图4为式ⅰ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-30f的hmbc图谱；图5为式ⅰ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-30f的1h-1hcosy图谱；图6为式ii结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31h的1h-nmr图谱；图7为式ii结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31h的13c-nmr图谱；图8为式ii结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31h的hsqc图谱；图9为式ii结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31h的hmbc图谱；图10为式ii结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31h的1h-1hcosy图谱；图11为式ⅲ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31i的1h-nmr图谱；图12为式ⅲ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31i的13c-nmr图谱；图13为式ⅲ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31i的hsqc图谱；图14为式ⅲ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31i的hmbc图谱；图15为式ⅲ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31i的1h-1hcosy图谱；图16为式ⅳ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31f的1h-nmr图谱；图17为式ⅳ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31f的13c-nmr图谱；图18为式ⅳ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31f的hsqc图谱；图19为式ⅳ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31f的hmbc图谱；图20为式ⅳ结构中抗肿瘤活性的化合物a68-31f的1h-1hcosy图谱。具体实施方式实施例1一、化合物的发酵海洋放线菌采用中国普通微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌streptomycessp.cicc11027；1)将海洋放线菌接种于500ml锥形瓶中，每瓶含250ml高氏一号液体培养基，培养条件为28℃、180rpm的摇床中恒温培养3天，获得种子液；2)将步骤1)所得的种子液接种至大米培养基(大米培养基，由以下组分制成：大米质量40g；海水60ml，置于500ml锥形瓶后经高压湿热灭菌所得)，接种体积为12ml，在28℃下静置培养120天，得到含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物。二、化合物的制备将含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物用乙酸乙酯萃取3次，溶剂回收浓缩，获得粗体物。将所得粗体物进行凝胶柱色谱(填料为羟丙基葡聚糖凝胶lh-20)，洗脱剂为甲醇体积百分数20％-100％的甲醇-水体系梯度洗脱，每1/4柱体积为一个馏分，tlc分析合并含有目标化合物的馏分。对目标组分采用中压制备色谱分离(sepaxamethystc-18(10μm,30×400mm)色谱柱，检测波长210nm)，流动相为甲醇体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，tlc分析合并含有新化合物的馏分，得到含有新化合物的组分。所得含有新化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长210nm，填料为十八烷基硅烷键合硅胶)，采用的流动相为体积百分数60％-100％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa，即含体积百分数0.05％三氟乙酸的甲醇溶液)/水体系以10ml/min等度洗脱，收集63-64min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物a68-30f，如图1至5所示，依据核磁共振数据，其结构如下所示，为式i结构。分子式根据高分辨质谱hr-esi-ms计算为c35h39n2o8([m+h]+615.2692,calculated615.2701)，鉴定化合物为(9r/22r)-bisphenolabis(9(22)-hydroxy-10(23)-anthranilicacid-propyl)ether，简称为a68-30f，具体结构如下：所得含有新化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长210nm)，采用的流动相为体积百分数78％-83％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa)/水体系以10ml/min等度洗脱，收集22-25min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物a68-31f。如图6至10所示，依据核磁共振数据，其结构如下所示，为式ⅱ结构。分子式根据高分辨质谱hr-esi-ms计算为c29h36no7([m+h]+510.2480,calculated510.2486)，鉴定化合物为(9r/22r)-bisphenola(9-hydroxy-10-anthranilicacid-propyl)(22-hydroxy-23-methoxy-propyl)ether，简称为a68-31h，具体结构如下：所得含有新化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长210nm)，采用的流动相为体积百分数80％-85％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa)/水体系以10ml/min梯度洗脱，收集17-19min色谱峰，回收溶剂，得到化合物a68-31i。如图11至15所示，依据核磁共振数据，其结构如下所示，为式ⅲ结构。分子式根据高分辨质谱hr-esi-ms计算为c28h34no7([m+h]+496.2364,calculated496.2330)，鉴定化合物为(9r/22r)-bisphenola(9-hydroxyl-10-anthranilicacid-propyl)(22,23-dihydroxyl-propyl)ether，简称为a68-31i，具体结构如下：所得含有新化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长210nm)，采用的流动相为78％-83％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa)/水体系以10ml/min梯度洗脱，收集16-17min色谱峰，回收溶剂，得到化合物a68-31f。如图16至20所示，依据核磁共振数据，其结构如下所示，为式ⅳ结构。分子式根据高分辨质谱hr-esi-ms为c25h28no5([m+h]+422.1975,calculated422.1963)，鉴定化合物为(9r)-bisphenola(9-hydroxy-10-anthranilicacid-propyl)ether，简称为a68-31f，具体结构如下：化合物的核磁鉴定(1h500mhz,13c125.7mhz)，其结果如表1和表2所示。表1表2三、抗肿瘤活性实验采用磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法检测化合物对人前列腺癌细胞株pc3细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞，配置成5×104个/ml，以100μl/孔铺于96孔培养板，co2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于co2培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μl4℃冰箱预冷的质量百分数10％的三氯醋酸(tca)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μlsrb溶液，室温25℃放置20分钟，去上清液，用质量百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的srb用100μl/孔10mmol/ltris碱液(ph＝10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔od值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(od515给药孔/od515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率可计算半数抑制浓度ic50。10μg/ml浓度抑制率，其结果如表3所示表3化合物10μg/ml浓度抑制率a68-30f37.46％a68-31h20.08％a68-31i38.22％a68-31f36.98％从上述结果可以看出，本发明提供的化合物式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ能抑制pc3的生长，充分说明该类化合物具有受体抑制活性从而发挥细胞毒性作用，因此可制备获得作为抗肿瘤药物。当前第1页12