一种基于生物3D打印水凝胶的三维肝癌组织构建的方法与流程

本发明属于生物学和组织工程学技术领域，具体涉及一种基于生物3d打印水凝胶的三维肝癌组织构建的方法。

背景技术：

药物研发需要经过体内及体外实验，肝癌细胞系hepg2在传统的2d培养中在药物筛选及组织工程已经具有广泛的研究和应用，但2d培养体系在长期的培养过程中存在细胞形态及功能上的缺失，许多指标无法客观评价，依然是需要攻克的难题。3d培养系统能更好的模拟细胞在人体的生长环境，具有比2d更加完善的培养体系，正广泛应用于各个领域。

3d培养体系需要借助不同的生物材料来实现，胶原、纳米材料等生物支架材料在组织工程中均具有广泛的应用。细胞生长需要一定的机械强度，gelma由酰基化的gelatin合成，具有良好的吸水性和机械性能。肝组织工程得到的微型肝组织具有比2d更好的形态和功能上的优势，细胞与细胞间能形成紧密联系和彼此融合，形成具有一定生物学功能的肝组织。其更加完善的功能可用于体外药物筛选和评价以及3d打印方向的应用。

综上所述，肝脏组织工程领域迫切需要开发一种新的构建微型肝组织的方法，在能够有效达到培养微型肝组织目的的同时，还能有效改善2d培养体系在完整肝功能上的缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进肝癌组织功能的形成的基于生物3d打印水凝胶的三维肝癌组织构建的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于生物3d打印水凝胶的三维肝癌组织构建的方法，其创新点在于：包括以下步骤：

（1）合成gelma支架材料，并且检测酰基化率和光聚时间，然后配置光引发剂，保存备用；

（2）将gelma与光引发剂均匀混合溶解后，将人肝癌细胞hepg2与gelma溶液混匀3d打印并光聚成细胞与水凝胶的复合体，然后加入10%fbs培养液中培养7天，即制备成含有hepg2来源的肝癌组织工程化单元，保存备用；

（3）检测三维肝癌组织材料的溶胀比及平衡水含量；

（4）采用be组化方法检测2d及3d第7天时的生长状态。

进一步的，所述步骤（1）中的gelma支架材料的合成具体方法为：称取1克明胶溶于10毫升的去离子水中，50℃水浴保温；剧烈搅拌并加入0.6毫升甲基丙烯酸酐，反应4小时；降温至40℃并逐渐缓慢倒入1:4（v/v）的冰丙酮中沉淀，4℃4000转/分钟离心10分钟，弃上清；将沉淀在40℃下，用去离子水透析72小时。

进一步的，所述步骤（1）中的光引发剂采用pbs配制得到光引发剂i2959，保存备用，所述将gelma支架材料进行水浴溶解，至最终浓度为10%。

进一步的，所述步骤（2）具体方法为：将gelma与光引发剂均匀混合溶解后得到gelma溶液，然后将人肝癌细胞hepg2、gelma溶液混匀，细胞浓度调整为1x10⁶/ml，制成生物打印墨水，生物打印的细胞与水凝胶体系置于紫外灯下光聚5分钟固化，将固化的水凝胶放入培养箱中继续培养7天，每2天更换新鲜培养液，观察支架内细胞生长状态。

进一步的，所述步骤（3）具体方法为：分别将无细胞gelma水凝胶，培养第0天生物3d打印水凝胶，培养第3天生物3d打印水凝胶，培养第7天生物3d打印水凝胶分别放入pbs内37^oc充分吸水3天，取出称各组湿重w湿重，并冻干48h后称各组干重w干重，计算各组溶胀比及平衡水含量。

本发明的有益效果如下：本发明可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进肝癌组织功能的形成，能够为肝组织工程的科学研究以及肝癌的临床治疗提供有益的参考，并且为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。

附图说明

图1为本发明的gelma空白水凝胶完全吸水及冻干后的形态对比图；

图2为本发明中gelma空白水凝胶，gelma-细胞水凝胶分别培养0天、3天、7天后的质量溶胀比的对比图；

图3为本发明中gelma空白水凝胶，gelma-细胞水凝胶分别培养0天、3天、7天后的平衡水含量的对比图；

图4为本发明2d及3d培养体系下第7天时的he染色图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

一种基于生物3d打印水凝胶的三维肝癌组织构建的方法，包括以下步骤：

（1）合成gelma支架材料，并且检测酰基化率和光聚时间，然后配置光引发剂，保存备用，光引发剂采用pbs配制得到光引发剂i2959，保存备用，将gelma支架材料进行水浴溶解，至最终浓度为10%。

（2）将gelma与光引发剂均匀混合溶解后，得到gelma溶液，将人肝癌细胞hepg2、gelma溶液混匀，细胞浓度调整为1x10⁶/ml，制成生物打印墨水，生物打印的细胞与水凝胶体系置于紫外灯下光聚5分钟固化，将固化的水凝胶放入培养箱中继续培养7天，每2天更换新鲜培养液，观察支架内细胞生长状态。

（3）检测三维肝癌组织材料的溶胀比及平衡水含量：分别将无细胞gelma水凝胶，培养第0天生物3d打印水凝胶，培养第3天生物3d打印水凝胶，培养第7天生物3d打印水凝胶分别放入pbs内37^oc充分吸水3天，取出称各组湿重w湿重，并冻干48h后称各组干重w干重，计算各组溶胀比及平衡水含量。

（4）采用be组化方法检测2d及3d第7天时的生长状态。

gelma支架材料的合成具体方法为：称取1克明胶溶于10毫升的去离子水中，50℃水浴保温；剧烈搅拌并加入0.6毫升甲基丙烯酸酐，反应4小时；降温至40℃并逐渐缓慢倒入1:4（v/v）的冰丙酮中沉淀，4℃4000转/分钟离心10分钟，弃上清；将沉淀在40℃下，用去离子水透析72小时。

为了进一步了解本发明方法的效果，对培养出来的微型肝癌组织进行了相应的检测及鉴定。

（1）质量溶胀比及含水量测定

分别将无细胞gelma水凝胶，第0天生物3d打印水凝胶，第3天生物3d打印水凝胶，第7天生物3d打印水凝胶分别放入pbs内37度充分吸水3天，取出称湿重，并冻干48小时后称干重，计算各组溶胀比及平衡水含量，如图1-图3所示，质量溶胀比q=w湿重/w干重，平衡水含量m=（w湿重-w干重）/w干重；

由图2可知，10%gelma溶胀比较好，含水量高，适于细胞生长。细胞生长产生的ecm影响水凝胶的机械性能，与正常肝组织逐渐接近，成功构建生物3d打印水凝胶的三维肝癌组织。

（2）组织学分析

根据标准组织学检测方法，收集gelma-细胞水凝胶结构组织置于10%（v/v）福尔马林中固定过夜，按照操作方案脱水完全后转移至氯仿透明直至包埋入石蜡中，然后进行石蜡切片，切片厚度为5μm，最后用h/e对上述制备的切片进行染色，观察样品中的细胞核及细胞质，如图4所示，由图4可知，结果表明第7天时3d体系内细胞生长良好，细胞之间形成相互联系，核质明显，出现融合聚集现象。2d培养体系细胞整体生长较好，出现少数细胞堆积生长，堆积于上层细胞核质模糊，形态发生改变。

本发明可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进肝癌组织功能的形成，能够为肝组织工程的科学研究以及肝癌的临床治疗提供有益的参考，并且为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。