本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种高效激活和扩增nkt细胞的新方法。
背景技术：
经典的免疫学理论认为机体的淋巴细胞有三种：t细胞、b细胞和nk(naturalkiller)细胞，而nkt(naturalkillert)细胞是较晚发现的第四种淋巴细胞。nkt细胞是一群细胞表面既有t细胞受体(tcellreceptor,tcr)，又有nk细胞受体的特殊t细胞亚群。nkt细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在脐带血中也有nkt细胞。
nkt细胞的生物学功能主要包括免疫调节和细胞毒性作用，nkt细胞受到刺激后，可以分泌大量的白细胞介素-4(interleukin-4，il-4)，γ-干扰素(interferon-γ，ifn-γ)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)，白细胞介素-13(interleukin-13，il-13)和其它细胞因子与趋化因子，发挥免疫调节作用，nkt细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。nkt细胞活化后具有细胞毒性，可溶解靶细胞，主要效应分子是穿孔素、fas配体和ifn-γ。nkt细胞作为具有强杀伤力的一类细胞群，具有广谱的抗肿瘤作用，已经开始广泛应用于临床治疗中，而且毒性较低。经体外培养得到的nkt细胞具有很好的抗肿瘤活性和保健作用。
目前培养nkt细胞的常规方法是在外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)的培养基中加入活化抗体和细胞因子，经过2-3周的培养得到大量的nkt细胞。但是常规培养方法得到的nkt细胞产量偏低，免疫细胞里面有大量的t细胞。大量t细胞的存在不仅降低了nkt细胞的纯度也影响了nkt细胞的增殖，所以目前急需改进现有的培养nkt细胞的工艺。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效激活和扩增nkt细胞的新方法，以解决常规nkt细胞培养方法存在的产量低和纯度不高的问题。
为达到上述目的，本发明提供了一种高效激活和扩增nkt细胞的新方法，包括以下步骤：
步骤1：从外周血中分离出pbmc细胞；
步骤2：将分离出的pbmc细胞经培养基重悬后，转移至经抗人cd3抗体和重组人纤连蛋白包被过的培养容器中，并向培养基中加入ifn-γ后进行培养；
步骤3：向培养基中继续加入维生素c、人血清白蛋白、白细胞介素-2(interleukin-2，il-2)和ok432后继续培养，得到nkt细胞。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，在步骤2中，所述抗人cd3抗体和重组人纤连蛋白由培养基配制后对培养容器进行包被。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，所述抗人cd3抗体的浓度为1-40μg/ml；所述重组人纤连蛋白的浓度为1-10μg/ml。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，在步骤2中，所述包被的时间为8-24h，温度条件为0-10℃。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，在步骤2中，所述ifn-γ的终浓度为1-1000u/ml。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，在步骤3中，所述维生素c的终浓度为1-10μg/ml；所述人血清白蛋白的终浓度为0.5-10mg/ml；所述il-2的终浓度为1-1000u/ml；所述ok432的终浓度为1-10μg/ml。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，在步骤3中，根据细胞的生长情况，每隔1-3天补加培养基、维生素c、人血清白蛋白和il-2。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，每次补加后，将细胞转移至没有被抗人cd3抗体和重组人纤连蛋白包被过的培养容器中培养。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，步骤2中所述培养的时间为12-48h；步骤3中所述培养的时间为12-30天。
上述的高效激活和扩增nkt细胞的新方法，其中，所述培养基为x-vivo15无血清培养基。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)pbmc细胞里面含有天然的nkt细胞，比例大概在2-3％。本发明通过制造有利于nkt细胞增殖的培养条件，让nkt细胞尽可能多地增殖。结果表明，本发明能显著的提高nkt细胞的纯度和与产量；且本发明提供的nkt培养方法操作简单，所耗费的成本也比较低。
(2)本发明在培养nkt细胞的起始阶段使用cd3抗体和纤连蛋白，这能够很大程度的提高nkt细胞的诱导效率，利于nkt细胞的扩增。
(3)本发明在nkt细胞的培养基里面加入ifn-γ和ok432，可以显著的增加nkt细胞的杀伤能力，而且ok432能明显的促进nkt细胞的增殖能力。
附图说明
图1为不同效靶比的nkt细胞对肿瘤细胞的杀伤效率示意图。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
本发明提供了一种高效激活和扩增nkt细胞的新方法，包括以下步骤：
步骤1：从外周血中分离出pbmc细胞；
步骤2：将分离出的pbmc细胞经培养基重悬后，转移至经抗人cd3抗体和重组人纤连蛋白包被过的培养容器中，并向培养基中加入ifn-γ后增加nkt细胞的毒性，进行培养12-48h；
步骤3：向培养基中继续加入维生素c、人血清白蛋白、il-2和ok432后继续培养12-30天，得到nkt细胞。
在步骤2中，所述抗人cd3抗体和重组人纤连蛋白由培养基配制后对培养容器进行包被。所述抗人cd3抗体的浓度为1-40μg/ml；所述重组人纤连蛋白的浓度为1-10μg/ml。所述包被的时间为8-24h，温度条件为0-10℃。所述ifn-γ的终浓度为1-1000u/ml。所述培养基为x-vivo15无血清培养基。
在步骤3中，所述维生素c的终浓度为1-10μg/ml；所述人血清白蛋白的终浓度为0.5-10mg/ml；所述il-2的终浓度为1-1000u/ml；所述ok432的终浓度为1-10μg/ml。根据细胞的生长情况，每隔1-3天补加培养基、维生素c、人血清白蛋白和il-2。每次补加后，将细胞转移至没有被抗人cd3抗体和重组人纤连蛋白包被过的培养容器中培养。所述培养基为x-vivo15无血清培养基。
以下通过一个具体实施例阐述上述高效激活和扩增nkt细胞的新方法：
一、分离pbmc细胞
首先，分离10毫升外周血。预先把人淋巴细胞分离液ficoll-hypaque(密度为1.077g/ml)平衡到室温。把10mlficoll缓慢加入到50ml体积的无菌离心管中，倾斜离心管45度，在离ficoll液面上1cm处把等体积的外周血缓慢加到ficoll上面。把离心管放入水平离心机，用400g的速度离心30分钟，同时关掉离心机的减速阀。
从离心管里面吸取中间的pbmc细胞层，加入到新的50ml离心管中。用生理盐水定容至40ml，吹打均匀，400g离心10分钟。离心后弃上清，补加40ml生理盐水吹打细胞至混匀，再次以400g离心10分钟，弃上清得到外周血单个核细胞。用6-7ml无血清培养基重悬细胞，同时细胞计数。
二、用抗cd3单抗和纤连蛋白包被培养瓶
用无血清培养基稀释抗人cd3单抗和重组人纤连蛋白，把1.5毫升含有20μg/ml的cd3单抗和5μg/ml重组人纤连蛋白的无血清培养基加入到一个t25的培养瓶中。使液体铺满瓶底，把培养瓶平放在4℃冰箱中包被过夜。
三、nkt细胞的培养过程
把pbmc细胞加入被包被过的培养瓶中，同时把培养液的体积补足到10毫升；然后加入ifn-γ，使其终浓度到达1000u/ml。
24小时以后，往细胞里面加入维生素c、人血清白蛋白、ok432和il-2；保证维生素c的终浓度为10μg/ml、人血清白蛋白的终浓度为0.5mg/ml、ok432的终浓度为1μg/ml和il-2的终浓度为1000u/ml。
细胞在培养箱继续培养2天以后，补加30-50％体积的新鲜无血清培养基(含有10μg/ml的维生素c、0.5mg/ml的人血清白蛋白和1000u/ml的il-2)，把细胞转移到t75的培养瓶中。平均每两天补液一次，随着培养液体积的增多，再把细胞转移到没有被包被过的培养瓶中培养。一共培养21天，收集nkt细胞。
四、nkt细胞计数和表型分析
对刚分离到的pbmc细胞进行细胞计数，并取少量的细胞用于流式细胞仪分析。细胞用抗cd45抗体、抗cd3抗体和抗cd56抗体染色。
同样对培养21天的nkt细胞进行细胞计数，并取少量的细胞用于流式细胞仪分析。
为了检验本发明的实际扩增nkt细胞的能力，实验中采集了多个健康人的外周血用于实验，每个人抽10毫升新鲜的外周血用于实验。表1是培养5名献血者的外周血单个核细胞所得到的数据。5组实验所得到的nkt细胞的平均纯度是67.3±8.2％，nkt细胞的平均扩增倍数是2923±902，10毫升外周血平均能扩增出(1.9±0.68)×109个nkt细胞。
表1.外周血单个核细胞经培养后的结果分析
五、nkt细胞对肿瘤细胞的杀伤实验
肝癌细胞株hepg2培养在含有10％胎牛血清的dmem培养基中，取处于对数生长期的hepg2细胞计数并用于实验。
整个杀伤实验中用到的培养基是含有1％灭活的胎牛血清的dmem培养基。用到的试剂盒是非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega,g1780)。
用新鲜的培养基把hepg2细胞制成1×105个/ml的细胞悬液，加入到圆底的96孔板中，每孔100μl。用同样的培养基调整一系列nkt细胞的浓度，把80μlnkt细胞按照效应细胞：靶细胞为1:1、5:1、10:1、20:1、40:1的比例加入到hepg2细胞中；同时设置nkt细胞对照和hepg2细胞对照组，培养基对照组和hepg2细胞最大释放组，每孔的最终体积矫正为200μl，均设三个复孔，250g离心4分钟，把细胞放在37度的培养箱中培养12个小时。
在反应结束前45分钟，把20μl裂解液加入到靶细胞最大释放组。反应结束后从每个孔吸走50μl细胞上清至另一个新的96孔板，再加入50μlldh酶反应液，混匀30秒，室温下避光放置30分钟，再加入50μl终止液，用酶标仪测量每个孔的od值。
计算nkt细胞杀伤活性的公式：杀伤活性％＝(实验组od值-nkt细胞对照组od值-hepg2细胞对照组od值)/(hepg2细胞最大释放组od值-hepg2细胞对照组od值)×100％。
结果如图1所示，本发明所制得的nkt细胞对hepg2细胞有很强的杀伤能力。当效靶比是10：1的时候，杀伤比例是(59.9±10)％；当效靶比是40：1的时候，杀伤比例是(96.2±2)％。
综上所述，本发明能显著的提高nkt细胞的纯度和与产量；且本发明提供的nkt培养方法操作简单，所耗费的成本也比较低。在培养nkt细胞的起始阶段使用cd3抗体和纤连蛋白，这能够很大程度的提高nkt的诱导效率。在nkt细胞的培养基里面加入ifn-γ和ok432，可以显著的增加nkt细胞的杀伤能力，而且ok432能明显的促进nkt细胞的增殖能力。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。